全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 6期，2008年 12月 1125
过量表达星星草 PtSOS1提高拟南芥的耐盐性
程玉祥 *
东北林业大学园林学院, 哈尔滨 150040
提要: 将星星草中分离的质膜型 Na+/H+逆向转运蛋白基因 PtSOS1 (GenBank登录号 EF440291)构建到 pGWB2植物表达载
体上, 转化拟南芥, 获得抗卡那霉素的抗性植株。PCR和Northern检测表明, PtSOS1已整合到拟南芥基因组中并过量表达。
耐盐性实验表明, PtSOS1过量表达提高了拟南芥植株的耐盐性。盐分测定表明, 盐胁迫下PtSOS1转基因植株中Na+积累低
于野生型的, K+含量则高于野生型的, 转基因植株中K+/Na+比值高于野生型。
关键词: 星星草; PtSOS1; 转基因拟南芥; 盐胁迫
Overexpression of the PtSOS1 from Puccinellia tenuiflora Enhanced Salt Tol-
erance of Arabidopsis
CHENG Yu-Xiang*
College of Landscape Architecture, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: The cDNAs of PtSOS1 (GenBank accession No. EF440291), a plasma membrane Na+/H+ antiporter
gene isolated from Puccinellia tenuiflora, were constructed into plant expression vector pGWB2. Arabidopsis
thaliana wild-type (WT) plants were transformed with Agrobacterium tumefaciens containing the resultant
vectors, and kanamycin-resistant plants were obtained. PCR analysis showed that PtSOS1 was integrated in the
genome of Arabidopsis. Northern analysis indicated that transgenic plants over-expressed the PtSOS1 in the
transcript level. Salt stress assay showed that PtSOS1-overexpression enhanced salt tolerance of Arabidopsis
transgenic plants. It was implied by salt contents measure analysis that, compared with WT plants, Na+ accu-
mulation was remarkably lower in transgenic plants under salt stress, the K+ level was obviously higher, and K+/
Na+ ratio was also distinctly higher.
Key words: Puccinellia tenuiflora; PtSOS1; transgenic Arabidopsis; salt stress
收稿 2008-09-01 修定 2008-10-28
资助 黑龙江省自然科学基金(C200518)和哈尔滨市青年科学
研究基金(200 5AFQXJ0 24)。
* E-ma il : chengyuxia ng1 11 @sina .com.cn; Tel : 02 1-
54924142
植物细胞内K+/Na+的动态平衡不仅关系到细
胞代谢, 也是植物耐盐的依据之一(Tester和Daven-
port 2003; Volkov和Amtmann 2006; Chen等 2007;
Munns和 Tester 2008)。要维持盐逆境下细胞内合
适的K+/Na+比值, 需要阻止Na+过度积累。Na+区
隔化和Na+外排是植物降低细胞内Na+浓度的主要
方式, 这一生理功能由Na+/H+逆向转运蛋白完成
(Niu等 1995)。植物中Na+/H+逆向转运蛋白根据
其亚细胞分布不同, 分为液泡型和质膜型两类。
Na+区隔化是由位于液泡膜上的Na+/H+逆向转运蛋
白利用液泡膜上H+-ATPase和H+-焦磷酸酶(H+-
PPase)建立跨膜质子电势差作为驱动力, 将Na+区
隔化入液泡。质膜型Na+/H+逆向转运蛋白则参与
Na+的外排(Blumwald 2000; Shi等2002; Shabala等
2005), 遗传学和生化学证据表明: 拟南芥盐过度敏
感基因(AtSOS1)是一个质膜定位的Na+/H+逆向转运
蛋白编码基因, 该基因能恢复其突变体(sos1)盐过度
敏感表型; 酵母突变体互补实验证实质膜型Na+/H+
逆向转运蛋白控制Na+外排; 转基因过量表达质膜
型Na+/H+逆向转运蛋白降低细胞内Na+的积累(Wu
等 1996; Zhu等 1998; Shi等 2000, 2002, 2003; Qiu
等 2002)。最近有人报道, 水稻和小麦中的质膜型
Na+/H+逆向转运蛋白也行使类似的功能(Martinez-
Atienza等 2007; Xu等 2008)。
然而, 盐生植物的质膜型Na+/H+逆向转运蛋白
功能的报道较少。我们从盐碱地植被恢复先锋物
种星星草中克隆了质膜型Na+/H+逆向转运蛋白基
因PtSOS1 (程玉祥 2008)。本文将PtSOS1导入到拟
南芥, 获得过量表达的转基因植株, 并分析了盐胁
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迫下这种转基因植株的耐盐性及其Na+、K+含量
和 K+/Na+比值。
材料与方法
星星草[Puccinellia tenuiflora (Turcz.) Scribn.
et Merr.]的培养和逆境胁迫处理时, 将其种子播于
装有蛭石和珍珠岩(1:1)基质的营养钵中, 置于人工
气候室中培养。培养条件为: 温度 24~28℃、光
照强度 120 µmol·m-2·s-1、光周期 16 h/8 h、相对
湿度 60%。每 5 d浇 1次 Hoagland营养液, 生长
至30 d时, 幼苗进行NaCl胁迫处理, 分别将带幼苗
的营养钵浸在 200 mmol·L-1 NaCl溶液和蒸馏水(对
照)中, 处理 24 h后收获材料, 液氮速冻后用于总
RNA分离。
Northern blot分析时, 用 RNAgents® Denatur-
ing Solution (Promega公司)分离植物总 RNA, 操作
按照说明书进行。取 10 µg总 RNA, 在 65 ℃变性
10 min, 经 1.5%甲醛 -琼脂糖变性胶电泳分离后转
至Hybond-N+尼龙膜; 用紫外线照射法交联RNA于
膜上, 膜用DIG-PtSOS1的DNA探针(625 bp)于50 ℃
杂交 12 h; 信号用 CDP-StarTM试剂(Roche公司)检
测。
构建植物表达载体pGWB2-PtSOS1时, 根据星
星草 PtS OS 1 基因 cD NA 序列, 设计引物: 5 -
CACCATGGAGGAGGCCGGCTCCAGC-3和 5-
TCAGTTGCCCTGCGGCCGTGGTTGG-3。以本
实验室已有的pMD18-T-PtSOS1质粒为模板, PCR扩
增 PtSOS1基因阅读框DNA片段。PCR产物回收
后连接到载体pENTRTM/SD/D TOPO® (Invitrogen公
司)上并测序鉴定。用GATEWAY系统(Invitrogen
公司)把pENTRTM/SD/D TOPO®载体上的PtSOS1片
段融合到pGWB2上。液氮冻融法将pGWB2-PtSOS1
质粒导入农杆菌GV3101中, 用农杆菌介导法对拟
南芥遗传转化, 收获的种子在含 50 mg·L-1 Kan的
MS培养基筛选, 得到的抗性植株用于转基因植株
分子鉴定。
分析植物基因组DNA的PCR时, 以CTAB法
提取转基因和非转基因拟南芥植株叶片总DNA作
为模板, 进行 PCR扩增。引物为: 5 -TCGGAAAA-
CAACCTGGTAGCTTCT-3 和 5 -CAAGCG-
GTCCAAAGGTTCAGCT-3, 反应体积为 50 µL, 反
应条件为: 95 ℃预变性3 min; 95 ℃变性30 s, 62 ℃
退火 30 s, 72 ℃延伸 1 min, 30个循环; 72 ℃延伸 7
min。PCR产物进行琼脂糖电泳分析。
转基因拟南芥盐胁迫处理分2个时期: 子叶期
与幼苗期。子叶期的盐处理在MS培养基平板上
进行, 将纯合转基因种子和对照种子铺于MS培养
基平板上发芽、生长 5 d后分别移栽于MS+100
mmol·L-1 NaCl和MS+150 mmol·L-1 NaCl的培养基
上, 20 d后观察其生长状况并拍照。幼苗期的盐处
理在土壤中进行, MS培养基平板上生长 5 d的纯
合转基因植株和野生型植株移栽于含营养土的盆
中, 生长 14 d后, 分对照组和盐胁迫组; 对照组不
进行盐胁迫, 盐胁迫组植物分别浇 50、100、150
及 200 mmol·L-1的NaCl盐溶液, 每 2 d浇 1次, 共
浇 3次; 之后, 2组植物继续生长 14 d后观察、拍
照; 此后, 2组植物生长直至开花、结实, 拍照并
观察其生长状况。
测定Na+和K+含量时, 对盆栽4周的野生型和
过表达拟南芥植物进行盐胁迫处理, 方法如上所述,
盐胁迫后继续生长 10 d。取植物材料, 用去离子
水洗 3次, 于 80 ℃烘干至恒重。取研磨成粉未的
材料 0.1 g, 加入 4 mL的 4 mol·L-1 HCl, 于 37 ℃下
浸提 12 h, 12 000×g离心 15 min, 取上清液稀释, 用
于Na+和K+含量测定。测定方法按文献(Peng等
2004)所述。
实验结果
1 盐诱导下的星星草PtSOS1转录
NaCl盐胁迫下星星草叶和根中PtSOS1基因转
录水平均明显升高(图 1)。用Gelpro密度分析软件
图 1 盐胁迫下星星草 PtSOS1的mRNA表达
Fig.1 The mRNA level of PtSOS1 from Puccinellia tenuiflora
under salt stress
Northern blot检测 PtSOS1的mRNA量, 杂交信号用Gelpro
密度分析软件定量, 0 h处理的杂交信号作为 1.0, 其他泳道信号
分别与其相比。
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分析表明: PtSOS1的mRNA量随着盐胁迫时间的延
长逐渐递增, 在盐胁迫 24 h时, 根中 PtSOS1的
mRNA量比未胁迫的升高约 8.9倍, 在叶中也增加
约 4.5倍。这些结果表明星星草 PtSOS1基因表达
受到盐胁迫诱导响应, 暗示PtSOS1参与了星星草的
抗盐生理活动。
2 PtSOS1转基因拟南芥的鉴定及其转录表达
用农杆菌介导法转化拟南芥, 共获得 25个独
立转化株系。PCR检测 6个转基因株系植株, 结果
表明6个转基因植株均扩增出与目的片段大小一致
的产物, 而非转基因植株(野生型)则没有扩增出目
的片段(图 2-a)。扩增的 PCR产物回收后经DNA
测序证明为 PtSOS1基因序列的一部分(资料未列
出), 这表明外源基因 PtSOS1已整合到转化的拟南
芥基因组中。
6个转基因株系植株的Northern blot分析表明,
转基因植株中外源基因PtSOS1的mRNA表达量均
呈现高丰度水平(图 2-b)。但在不同转基因株系中
PtSOS1表达量有所不同, TP4中表达量最高, TP13
次之。TP4和TP13转基因株系用于抗盐性实验及
Na+和K+含量分析。
在MS+150 mmol·L-1 NaCl培养基上生长 20 d后野
生型植株显著地小于转基因植株(图 3-a)。野生型
叶色紫, 叶片增厚, 明显地受到盐胁迫的毒害, 而转
基因拟南芥在盐胁迫条件下生长表现较为正常(图
3- a )。
(2)土壤中生长14 d的野生型和转基因植物幼
苗经盐胁迫处理后, 植株继续生长 14 d, 我们观察
到PtSOS1转基因植株生长速度明显地快于野生型
(图3-b), 这表明野生型植株受到盐毒害的程度明显
地大于 PtSOS1转基因植株。经过盐胁迫后野生型
和转基因植株继续生长至成熟期, 我们观察到转基
因植物单株生物量明显地大于野生型(图 3-c)。另
外, 在盐胁迫的生长环境下, 尽管转基因植物和野
生型的生长大小呈现显著的差异, 但没有改变二者
的成熟期(图 3-c)。
4 盐胁迫下 PtSOS1转基因植物的 Na+、K+含量
及K+/Na+比值
(1)在未受盐胁迫处理的转基因和野生型拟南
芥中, Na+和K+含量均没有显著差异, 在盐胁迫处
理后二者中Na+含量均升高, 但转基因植株中Na+
积累明显低于野生型, 如 100 和 200 mmol·L-1 盐胁
迫下根和茎的Na+积累有显著差异(图4)。此外, 与
对照相比盐胁迫下转基因和野生型拟南芥的K+均
明显地降低, 但转基因植株中K+降低的幅度也明显
地小于野生型(图 4)。
(2) K+/Na+比值是判断植物具有较强耐盐性的
重要依据之一(Tester和Davenport 2003; Chen等
2007)。在盐逆境胁迫下 PtSOS1转基因拟南芥的
Na+积累明显地低于野生型, 而K+含量明显地高于
野生型(图 4)。因而, 在盐逆境条件下转基因植物
的K+/Na+比值也显著高于野生型(图 5)。
讨　　论
Na+外排是植物降低细胞内Na+过量积累的重
要方式之一。一般认为细胞膜上Na+/H+逆向转运
蛋白是行使这一功能的(Blumwald 2000)。用酵母
为材料的研究已证实质膜上Na+/H+逆向转运蛋白
SOD2执行胞内 Na+外排功能(Hahnenberger等
1996), SOD2过表达拟南芥在盐胁迫下降低细胞内
Na+含量, 并显著增强转基因植物的耐盐性(Gao等
2003)。植物中拟南芥质膜型Na+/H+逆向转运蛋白
基因(AtSOS1)不仅具有Na+的外排, 还控制Na+长距
图 2 PtSOS1转基因拟南芥的分子鉴定
Fig.2 Molecular identification of the PtSOS1 gene in
transgenic Arabidopsis plants
a: WT和 TP基因组 DNA为模板, PCR扩增 PtSOS1基因片
段。b: Northern blot检测转基因株系中 PtSOS1基因 mRNA表
达。M: D NA 分子量标准; WT 为野生型; TP2、TP4、T P9、
T P1 3、T P 1 5 和 T P 1 6 为 6 个独立的转基因株系。
3 过量表达PtSOS1拟南芥的抗盐性分析
(1)野生型和转基因拟南芥在MS培养基的正
常条件下生长速度和发育程度没有明显的差异, 但
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图 3 PtSOS1转基因拟南芥耐盐性分析
Fig.3 Salt tolerance analysis in PtSOS1 transgenic Arabidopsis plants
a: MS培养基上转基因幼苗的耐盐性; b: 土壤中生长的转基因幼苗的耐盐性。盆栽 14 d的转基因和野生型植物进行盐胁迫处理
见“材料与方法”所述，盐处理后植物继续生长 1 4 d，观察、拍照; c : 转基因植物在幼苗期经盐胁迫后生长至成熟期。W T
为野生型; T P4 和 TP1 3 为 2 个独立的 PtS OS 1转基因株系。
离运输(Shi等 2002)。本文用Northern杂交方法证
明耐盐碱植物星星草质膜型Na+/H+逆向转运蛋白
基因PtSOS1受到盐胁迫诱导, PtSOS1在拟南芥中进
行过量表达后, 盐逆境胁迫下的过表达植物比野生
型呈现较强的耐盐表型, 并且过量表达植物体内
Na+积累显著低于野生型。这些结果表明 PtSOS1
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图 4 不同浓度盐胁迫处理后 PtSOS1转基因拟南芥植物中的Na+、K+含量
Fig.4 Na+ and K+ levels of transgenic Arabidopsis plants after treated with different concentration of NaCl
WT 为野生型; TP4 和 TP13 为 2 个独立的转基因株系; *: P<0.05，**: P<0.01; 数据为 3 个重复的平均值 ±SD。
图 5 不同浓度盐胁迫处理后 PtSOS1转基因拟南芥植物的K+/Na+比值
Fig.5 K+/Na+ ratio of transgenic Arabidopsis plants after treated with different concentration of NaCl
WT 为野生型; TP4 和 TP13 为 2 个独立的转基因株系; *: P<0.05，**: P<0.01; 数据为 3 个重复的平均值 ±SD。
在盐逆境胁迫下参与了过量表达植物Na+的外排。
另外, 尽管在盐逆境胁迫下PtSOS1过量表达植
物和野生型二者体内K+含量均明显降低, 但过量表
达植物中K+含量下降幅度却显著低于野生型。在
盐逆境胁迫下PtSOS1过量表达植物K+/Na+比值也
显著高于野生型的。事实上, 在盐逆境下生长的很
多植物保持较高的K+/Na+值比维持其细胞内较低
Na+更为重要(Tester和Davenport 2003; Huang等
2008; Byrt等2007), 这很可能与植物能否正常吸收
K+相关。Qi和 Spalding (2004)认为, 拟南芥在盐
逆境下AtSOS1具有保护质膜上K+运输子的运输功
能。据 Peng等(2004)报道星星草抗盐胁迫能力与
保持细胞内高浓度的钾离子呈正相关。我们认为,
在盐逆境胁迫下星星草PtSOS1也可能与K+的运输
功能相关, 但这种推测需要我们进一步研究来证
实。
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