全 文 ：724 植物生理学通讯 第40卷第6期，2004年12月
植物细胞内pH值的测定
周文彬邱保胜+
华中师范大学生命科学学院，武汉430079
MeasurementofIntracellularpHinPlants
ZHOUWbn．Bin，QIUBao-Sheng+
∞f彪妒D，L谵＆fPncP毋＆肋训鳓f阳^协"MZ踟如P瑙协胁肠，l430D79
提要介绍了植物细胞内pH值的测定方法和各种方法的优缺点。
关键词细胞内pH值；植物；测定方法
细胞内pH值(iIl仃acellularpH，pH)是细胞生理
活动的重要调节因素。胞内pH值不仅能调节酶活
性和一些重要的代谢过程，细胞内许多生理活动
如ATP合成、DNA复制、RNA和蛋白质合成以
及细胞生长等也都受胞内pH值的调节n2】。越来越
多的实验表明，细胞内pH值的变化在顶端生长、
根向重性、结瘤、植物防卫、植保素
benzophenaIlt嘶dine出aloids的诱导、植物激素(如
GA、ABA)响应等生理活动中充当第二信使，起
信号作用f3】。一般来说，大多数植物的细胞质中
pH值接近中性，液泡内pH值维持在5．0—6．5范围
内：在特殊生理条件下或外界环境因子的作用下
会有一些变动，但植物细胞能通过质膜反向运输
器(Na+，H+或K+，H+)、质子泵、阴离子交换以及有
机酸的产生或消耗等方式维持细胞内pH值稳
态(11。植物细胞适时地进行胞内pH值调控是所有
生活细胞的～个重要特征，胞内pH值也是目前研
究细胞功能的重要参数。因此，准确、动态、
无损伤地观测胞内pH值对于深入研究细胞代谢与
胞内pH值关系以及相关作用机制有重要意义。细
胞内pH值测定及相关研究已有一百多年的历史，
研究方法也在实践中不断得到改进和完善。目
前，采用不同的实验方法或测定不同的实验材料
所得的结果往往有一定差异，不同文献报道的胞
内pH值差异较大(表1)，‘因此要根据材料类型和
实验目的选择方法。胞内pH值的测定方法主要有
弱酸弱碱分布法、核磁共振法、微电极法、荧
光染料法，本文就这些方法～一作介绍，以供同
行参考。细胞内pH值的测定方法大多数先建立于
动物体系中，后在植物中逐渐得到应用。植物
细胞质和液泡内pH值的测定，主要有以下5种方
法：
1弱酸弱碱分布法(weakac沁柚dba∞diS蛹blla佃)
此方法基于以下前提：弱酸(弱碱)只有未解
离形式具膜透性；它们在细胞内代谢不活泼，不
改变胞内相关部分的pH值。未解离形式的弱电解
质(通常为放射性示踪剂)能优先扩散进入细胞，
经过足够长时间暴露后，细胞内外的分布达到平
衡，其在细胞内外的浓度相等(图1)。弱酸(弱碱)
处理细胞一段时间后，用不含弱酸(弱碱)的培养
基清洗数分钟，采用液体闪烁计数器测定放射性
强度，结合所测得的细胞体积，计算弱酸(弱碱)
的共酸一碱对浓度，再根据细胞外pH值和此种弱
电解质的解离常数，即可计算出pHi【l241。常用的
弱酸有5，5．dimemyl．oxazolidinedi ne(DMO)、丁酸
(butyricacid)，弱碱有甲胺(methylamine，MeA)、
苄胺(benzylamine，BA)、烟碱(nicotine，Nic)、
荧光碱(9．aIIlinoacridine，9AA)等。弱酸常用于测
定细胞质内pH值(pH。)，弱碱用于测定液泡内pH
值(pH，)。此法操作简单，可应用于小细胞，分辨
率在0．1加．2个pH单位，所需植物材料为0．1．1g
鲜重。此法的不足之处在于反应时间长，不能用
于测定细胞内pH值的短期变化川。另一方面，弱
收稿 2004．04．16修定 2004．07．12
资助 国家自然科学基金(30200021)。
+
通讯作者(E·mail：bsqju@pub】jc．whmb．cn，T引：D27．
678615141。
万方数据
植物生理学通讯第40卷第6期，2004年12月 725
表l不同植物材料的细胞质和液泡内pH值(根据文献l修改)
植物种类 测定方法 细胞质pH 液泡pH 参考文献
高等植物细胞
悬浮培养
AcPrpJe“dDpf口fⅡ，lMj 31PNMR 7．5 5．7 4
6．6(缺氧6h以上) 6．3(缺氧6h以上)
菜豆P^口jeDfMJv“f窖口一s 31PNMR 7．5 5．3 5
互0c^sc矗D2fzf口c口髓如，wicn SNA】RF 7．10．4 5．5～6．3 6
器官
根
玉米(z鲫m口vsJ 31PNMR 8．0
— 7
玉米(Z阳m口vsJ 31PNMR 7．0一一7．2 5．6 8
玉米(压口m口vsJ 微电极法 5．1—5．6(质外体) 一 9
白芥(Sf，l口p括df蚰) 微电极法 7．3 4．6 10
Rfcc蛔砌ffnnj 微电极法 7．3 4．8 11
萝h(R4p|h彻Hjj口ffv“J) 微电极法 7．2 6．0 12
大麦(^m埘eⅡmv“Zg口re) 微电极法 7．26 5．18 l3
拟南芥(A阳6fdDps括f砌ff口n口)BCECF 7．22 — 3
叶片
玉米(压nm口vs) SNARF 6．6 一 14
豌豆(Pf5“msⅡffv“m) ”PNMR 7．5 5．3 1 5
层，D如口dPns口 DM0和细胞液提取法 7．5 5．3 16
藻细胞
L口mprD胁口删，mmpDp“fDs“m DM0和细胞液提取法 7．5 4．9—5．1 l 7
安那藻(An口叫smnid“2口ns) DMO 7．5(光)、6．9(暗) 一 18
Eremosp}laemvcrid话 微电极法 1．3 5．o 、9
海洋原甲藻(PrDrDcPn打Hmmicnns)SNAI心 7．7 — 20
发状念珠藻(ⅣDJ幻c伽gPff玎．Drme)SNARF 6．6 — 21
聚球藻(Synec}lococc“s) 31PNMR 7．1—7．3(光)、6．7(暗)一 22
柱胞鱼腥藻(AnⅡ蚰e加cyff^drfc口)3‘PNMR 6．7撕．9(暗) 一 23
酸(如DMO)在胞内可能会发生代谢而使测定结果
偏高，未解离的弱酸若在胞内外不能达到完全平
衡时则会使测定结果偏低【241。此外，这一方法需
要破坏组织，监测到的胞内pH值变化不一定是
细胞中的真实值，并有可能改变胞内pH值。
2核磁共振法(nuclearmagneticresonancespe ．
协嘀oopy，M江R)
这项技术基于细胞内无机磷库在施加强磁场
后，31P频谱发生依赖于pH值变化的化学位移，
不需要外源分子探针，对细胞无损伤，可避免各
种损伤或破坏所导致的细胞内部生理和代谢变化以
及由此产生的测定结果的不准确性。采用此法可
同时测定细胞质和液泡内的pH值，且易于观察组
织细胞内pH值的异质性。此外，此法不但可以
了解细胞内pH值调节机制【251、糖酵解途径的活性
和细胞能态(energystatus)等方面的信息㈤，还可
获取到细胞内磷酸单酯、磷酸双酯、ATP、双
磷酸双酯、磷酸肌酸和无机磷(Pi)等多种含磷化合
物的信息，因此应用价值大。此法的主要局限性
在于敏感性低，测定时需要大量生物材料(1～5g
鲜重)或较高的细胞浓度，研究细胞群体或器官部
分的pH值变化以核磁共振技术较为适宜；它的时
间分辨率较低f2"，而要长时间维持材料的适宜生
理状态又有一定困难；另外，从无机磷(Pi)校准
曲线范围来看，相对于中性pH值，此法对于酸
性或碱性pH值(pH<5．5或pH>7．5)敏感性低，因
此当细胞质内pH值高于7．5、液泡内pH值低于
5．5时测定的结果相对来说不精确f26】。核磁共振法
一般在模拟细胞内条件下制作标准曲线：离心收
集细胞，加入高氯酸以抽提无机磷，取上清液，
万方数据
726 植物生理学通讯第40卷第6期，2004年12月
B
图l弱酸(A)和弱碱(B)分布示意【261
pH。：细胞外pH值：pH。：细胞质pH值：pH。：液泡
内pH值；AH和BOH分别表示弱酸和弱碱未解离形式；A一和
B+表示解离形式；字母大小表示所在区室浓度的高低。
滴加KHC0，，使溶液pH值近中性，后用盐酸调
至不同的pH值；分别取上清液放入NMR管中，
用31PNMR测不同pH值条件下Pi峰的化学位移。
经31PNMR测得活体细胞内P；峰的化学位移，依
据标准曲线即得知细胞内pH值。为了得到清晰的
31P核磁共振谱，通常应降低细胞培养液中锰离子
浓度【231。
3微电极法(microelectrodes)
微电极主要有金属、玻璃和液膜微电极3
种。H+选择性液膜微电极的性能优于pH值敏感的
玻璃微电极。微电极由H+一交换载体构成，可测
量电极插入区域与H+活性有关的电子动力势。采
用微电极法测定胞内pH值时，需在同一细胞中插
入2根微电极或1根双腔微电极，其中一个为pH
值敏感电极，另一个为参比电极，两电极间的电
位差为所测pH值的线性函数。walker等【131用三腔
微电极(离子选择性微电极)可同时测定细胞内pH
值、K+或NO，一活性及细胞膜电位。微电极可直
接插入生活细胞，技术时间响应快，能够在各种
实验条件下持续记录细胞内pH值变化，因此具有
较高的时间分辨率；此法校准简便且精确度高，
pH值分辨率可达O．02加．05个pH单位川；此项技术
还可同时测定细胞膜电位，因此可用以评价微电
极插入对细胞膜所造成的损伤。一般来说，测定
分离到的细胞、原生质体和液泡内的pH值可以采
用微电极；需要持续记录或研究pH值的瞬时变化
时采用微电极较为合适。电极插入可能会造成插
入部位周围离子泄漏，但对胞内pH值影响不大，
因为细胞内缓冲能力较高，且跨细胞膜的pH值梯
度一般较低，微电极对大细胞造成的损伤比小细
胞要小。微电极法不足之处在于：(1)技术操作难
度大；(2)微电极可能误入某些细胞器使测定结果
不准确；(3)应用微电极测定胞内pH值时，一般
要求细胞直径大于50“m【251，因此，使用微电极
时要兼顾细胞的直径大小。在野生型拟南芥叶肉
细胞中，随着电极尖端在细胞中区室的变化，即
从细胞质插入液泡，pH值从7．3逐渐变化到5．8，
膜电位从一150mV逐渐变化到一120mV，这表明
跨液泡膜的电位以30mv的差异发生了变化【z钔。
4荧光染料法(nuorescentdyes)
近年来，采用pH值敏感的荧光染料测定细胞
内pH值已多有报道。pH值荧光染料有多种，广
泛采用的有2’，7’_bis(carboxyethyl)．5一(and一6)．
carboxyfluorescein(BCECF)和carboxy
seIIlinaphtorhodanuor(carboxySNARF一1)(表2)㈣。
以BCECF为例，此方法的原理是：非荧光、亲
脂性的BCECF—AM分子能自由跨膜扩散进入细
胞，在细胞内酯酶作用下，AM基团水解，后形
成亲水、能发荧光的BCECF分子，其荧光强度
依赖于细胞内pH值。BcEcF的荧光强度可采用
特定的仪器(激光共聚焦显微镜或流式细胞仪)检
测，再根据离体或活体校准曲线，即可得出所测
细胞胞内的pH值。测定时需要根据特定的材料选
择荧光染料的合适浓度、染色时的温度和染色时
间等。此法的主要优点是操作相对简单，能够实
时监测细胞内pH值变化，适用于各种大小细胞，
不受细胞浓度的限制，重复性好，可以同时测定
细胞内多个位点的pH值，具有较高的时间分辨
万方数据
植物生理学通讯 第40卷第6期，2004年12月 727
一_——————————————————————————————————————————————————————————————一
表2胞内pH值测定的荧光染料∞1
最适光谱
染料名称 p墨
激发波长／nm 发射波长／nm
率，因此，目前此法得到广泛采用。但此法也
存有一些不足之处，如：游离的、高电荷的
BcECF能与细胞内的蛋白质(如转运蛋白Ca2+一
ATpase)结合，以致染料的光谱发生变化，最终
使据离体校准所得到的pHj不准确。活体校准大多
采用离子载体尼日利亚菌素(nigericin)。尼日利亚
菌素的作用是使细胞内外pH值达到平衡，但它不
能使胞内pH值与胞外完全达到平衡，较难稳定地
维持pHi在一个特定的水平上。离子载体处理还可
破坏细胞结构，造成染料在细胞器中发生螯合，
从而增加染料的损失，并可能给细胞带来污染【30】，
因此离体校准的溶液应尽可能地模拟细胞的内环
境。另外，此法不能测定细胞的膜电位【25】。有
研究表明，SNARF是测定细胞内pH值较好的染
料，另一种广泛采用的染料为BCECF。与SNARF
比较，BCECF在液泡中螯合更加明显；使用
BCECF时需在2个波长下激发，而SNARF仅可
在1个波长下激发，在2个发射波长下同时检测
荧光强度，可提高瞬时分辨率【30】。与右旋糖苷
(dex拄an)结合的SNARF比与酯结合的SNARF测得
的pHj高，用SNARF测定pHj的精确度在±O．03一
±0．06个pH单位之间，空间分辨率为2．3岬2【30】。
最近，我们用荧光探针法测定发状念珠藻(^，DJfDc
月昭PZ毙励肋e)胞内pH值时，发现钾离子对胞内pH
值无显著影响【211。尽管我们的测定结果偏低，但
与Johanne8膪【141采用同～方法测定玉米的叶枕细
胞胞内pH值所得出的结果一致。荧光染料法的基
本操作步骤是：在特定的温度下细胞以荧光染料
染色一定时间后，用新鲜的培养基或缓冲液洗涤
几次，于激光共聚焦显微镜下检测两发射波长下
的荧光强度，得到的比值可根据离体或活体校准
曲线，计算出该细胞内的pH值。
5细胞液提取法(ceUsapextract)
用玻璃微电极测定提取细胞液的pH值。此法
主要用于液泡内pH值的测定，对于某些类型植物
材料(如：组织培养材料)较为简单。其主要缺陷
在于：破碎细胞时抽提的细胞液中可能混有其它
成分，从而引起实际的pH值发生变化，因此， ．
较少有人采用。
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