全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第4期，2005年8月502
植物水孔蛋白介导的水分运输及其分析测定技术
綦翠华1, 2 丁同楼2 王宝山2,*
1 济南大学食品科学系，济南 250002；2 山东师范大学生命科学学院，济南 250014
Water Transport Mediated by Plant Aquaporins and Its Analytical Techniques
QI Cui-Hua1,2, DING Tong-Lou2, WANG Bao-Shan2,*
1Department of Food Science, Jinan University, Jinan 250002, China; 2College of Life Science, Shandong Normal University, Jinan
250014, China
提要 水孔蛋白介导的水分运输具有选择性强、效率高和调节快等特点，在植物生长、发育和胁迫适应中起作用，文章
介绍了水孔蛋白介导的水分运输及其分析测定技术。
关键词 植物；水孔蛋白；水分运输；测定技术
收稿 2004-09-30 修定 　2005-01-24
资助 国家自然科学基金(3027 0 79 3)、国家“863”项目
(2001AA244081)。
*通讯作者(E-mail: bswang@sdnu.edu.cn，Tel: 0531-
86180197)。
植物中一系列分子量为 26~34 kD、选择性
强、能高效转运水分子的膜蛋白称为水孔蛋白
(aquaporins，AQPs)[1]。关于植物水孔蛋白及其
调节前人已有综述[2~4]。自从1993年Maurel等[5]首
先用爪蟾卵母细胞异源表达体系分析水孔蛋白介导
的水分跨膜运输以后，水孔蛋白分析测定技术有
了很大进展，促进了植物水分代谢生理的研究。
近年来研究表明，水孔蛋白在植物种子萌发、细
胞伸长、气孔运动及逆境应答等过程中调节水分
快速跨膜运输。本文就目前国际上常用的植物水
孔蛋白介导的水分运输及其分析测定技术进行介绍。
水分通过细胞膜的运输有两种途径：一是通
过脂类双分子层的自由扩散；二是由水孔蛋白介
导的集流运输。两者最主要的区别是：后者为
Hg 2+ 抑制，而 DTT 等巯基试剂可恢复 Hg 2+ 的抑
制；前者则不为 H g + 抑制。所以，测定水孔蛋
白介导的水分跨膜运输等一般用HgCl2 处理方法，
根据水分运输是否受抑制和受抑程度来判别。
1 整株水平上的测定
1.1 根部自然伤流法 去除植物地上部分，用硅氧
烷脂把带有一段茎的根密封于锥形玻璃瓶中。
2 h后用细的巴氏滴管收集溢出木质部的汁液并转
移到离心管中，称汁液和根重。液流量( J v) 用
mg·g-1 (FW)·h-1 表示。取 50 mL 汁液放于离心管
中，用冰点渗透压计测汁液渗透势(yscell)和根生
长介质的渗透势(yssoil)，得到木质部汁液和外部溶
液的渗透势差 Dys= (ys c e l l–ys s o i l)。根导水力
(hydraulic conductance, Lo)用公式：Lo=Jv /Dys计
算，单位为mg·g-1 (FW)·h-1·MPa-1，这种方法仅适
用于少数能发生自然伤流的植物[6]。
1.2 压力室法 压力室法普遍适用于不能自然收集
到木质部汁液的植物，尤其适合研究干旱、盐碱
等逆境条件下的Lo 值。用压力室对离体根逐渐增
加压力，渗出的木质部汁液收集在离心管中并称
重。按上述公式计算 Jv，以压力为横坐标，Jv 为
纵坐标绘图，斜率即为 Lo 值[6]。
2 细胞水平上的测定
2.1 原生质体水平上的测定 用酶解法得到原生质
体，然后测定离体原生质体在非等渗溶液中的涨
缩速率并结合HgCl2和DTT处理判别水孔蛋白在水
分跨膜运输中的作用[7]。Martínez-Ballesta 等[6]把
分离的原生质体悬浮液置于低渗溶液中并测定其体
积膨胀，通过与显微镜相连接的计算机和摄像机
记录原生质体体积的改变，记录40~60 s (3 s·次-1)，
并计算出原生质体体积。水渗透度(water permea-
bility, Pf)用公式：Pf=Vo·k/[So·Vw (osmolin–osmolout)]
计算[6]，Vo 是原生质体起始时的体积，So 是原生
技术与方法 Techniques and Methods
植物生理学通讯 第41卷 第4期，2005年8月 503
质体起始时的表面积，V w 是水的偏摩尔体积，
osmolin和osmolout分别是原生质体内外溶液渗透摩
尔浓度，k 是膨胀起始阶段(2% 的体积增加发生
前)恒速率的拟合参数。另外，根据原生质体在
低渗溶液中的涨破时间，也可以了解水孔蛋白的
水转运特性。
2.2 质膜和液泡膜水平上的测定 先分离纯化质膜[8]
和液泡膜微囊[ 9 ] ，用停流光散射分光光度计
(stopped-flow light scattering spectrophotometer)测
定微囊在非等渗溶液中的体积改变[10]，并计算Pf
值。根据质膜和液泡膜微囊的Pf 值、涨破时间和
在非等渗溶液中体积改变图像，可以了解质膜和
液泡膜上的水孔蛋白的水转运特性。与整株水平
上的测定相比，方法 2.1 和 2.2 两种方法更加精
确，并能获得原生质体涨破全过程的图像，而且
能够分别了解质膜和液泡膜上的水孔蛋白的水转运特
性，但要求提取高纯度并且完整性较高的膜微囊。
2.3 脂质体重组技术 用脂质体重组技术可用于研
究单一膜蛋白的功能和特性。分离纯化得到的水
孔蛋白可用脂质体重组实验研究水的转运特性。
这种方法在动物水孔蛋白研究中应用较多，Zeidel
等[11]将纯化的 CHIP28 重构于人工合成的脂质体
中，脂质体对水表现出极高的通透性(是对照的11
倍)和选择性。植物水孔蛋白中用脂质体重组技术
较少，只有 NOD26 曾有人作过此类分析[12]。
3 分子水平上的测定
3.1 异源表达分析 有关水孔蛋白功能的研究大多
用非洲爪蟾卵母细胞异源表达体系进行。将编码
水孔蛋白的 mRNA 注射到卵母细胞中，培养 2~3
d，让其蛋白质得以合成并整合到质膜中。对照
用的卵母细胞只注入水，后放入低渗溶液中，根
据其与对照卵母细胞Pf 的比较和发生破裂的时间
来判别水孔蛋白的水转运特性[4,5]。
3.2 基因敲除突变体或反义基因技术 专一的编码
水孔蛋白基因的敲除突变体，可以精确地检测某
种水孔蛋白的功能。拟南芥PIP2敲除突变体根皮
层细胞的Lo下降[13]。反义基因技术，即通过减少
某一水孔蛋白中 mRNA 和蛋白质的合成量来研究
该水孔蛋白的生理功能，观察不同发育阶段由于
某一特定水孔蛋白的表达受抑而引起表型及水转运
特性的相应变化。Kaldenhoff等[14]用反义技术下
调AtPIP1b 表达后，拟南芥突变体根细胞质膜的
Pf值仅为野生型的1/3，转基因植物根量却是野生
型的 5 倍，根系吸水能力与野生型相似。这两种
方法的优点在于不需要通过异源表达体系而更加直
接地阐明水孔蛋白的运输特性和生理功能。
3.3 Northern blot分析 用RNA杂交技术检测水孔
蛋白基因在转录水平上的变化，间接分析水孔蛋
白变化及其与环境之间的关系。如在200 mmol·L-1
N aCl 胁迫条件下，冰叶日中花液泡膜水孔蛋白
MIP-F 表达丰度下调(液泡内的水分流失减少)，
而质膜水孔蛋白MIP-C的表达则上调(植物体对外
界水分的吸收加强)，这种不同水孔蛋白的调控模
式可能与植物对逆境的适应性有关[15]。
3.4 Western blot分析 Western blot分析可以对水
孔蛋白进行定位和其表达量检测。Vera-Estrella
等[16]用不连续的蔗糖密度梯度方法分离到的膜微囊
与抗冰叶日中花MIPs 的几种抗体进行杂交的结果
表明，只有MIP-F 完全分布在液泡膜上，MIP-C
则主要分布在质膜上，液泡膜上也有少量分布，
MIP-B在质膜中的免疫信号很弱，液泡膜中则有几
条免疫反应带，其中有一条被认为是MIP-B的二聚
体形式；未发现与MIP-A 相应大小的免疫反应带。
3.5 融合基因技术 用报告基因与水孔蛋白基因融
合也是检测水孔蛋白亚细胞定位的一种有效方法。
Cutler等[17]用绿色荧光蛋白(green fluorescent pro-
tein，GFP): cDNA融合表达载体检测拟南芥PIP2a
和 b-TIP的亚细胞定位。Chaumont等[18]用融合基
因技术发现拟南芥水孔蛋白RD28-PIP可以在真菌
如Dictyostelium discoideum和前孢子(pre-spore)中
起作用，并影响其正常的生长发育过程。
4 结束语
上述种种水孔蛋白介导水分运输及其分析测
定技术在水孔蛋白功能及其调节机制研究中已得到
人们的注视，并已从不同研究问题的角度广泛采
用。今后，用这些方法研究的热点问题可能是：
(1)水孔蛋白在植物逆境应答过程中的作用；(2)质
膜和液泡膜以外的其它细胞膜水孔蛋白的特性和功
能；(3)质膜和液泡膜上的两类水孔蛋白如何协调
并共同完成调节细胞水分吸收和平衡的机制。
植物生理学通讯 第41卷 第4期，2005年8月504
参考文献
1 Tyerman SD, Niemietz CM, Bramley H. Plant aquaporins:
multifunctional water and solute channels with expanding
roles. Plant Cell Environ, 2002, 25: 173~194
2 侯彩霞, 黄昊, 汤章城. 植物细胞的水孔蛋白. 植物生理学通
讯, 1997, 33(2): 151~156
3 朱美君, 康蕴, 陈珈等. 植物水通道蛋白及其活性调节. 植物
学通报, 1999, 16(1): 44~50
4 于秋菊, 吴锜, 林忠平等. 植物水孔蛋白研究进展. 北京大学
学报, 2002, 38(6): 855~866
5 Maurel C, Reizer J, Schroender JI et al. The vacuolar mem-
brane protein g-TIP creates water specific channel in Xeno-
pus oocytes. EMBO J, 1993, 12: 2241~2247
6 Martínez-Ballesta MC, Martínez V, Carvajal M. Regulation
of water channel activity in whole roots and in protoplasts
from roots of melon plants grown under saline conditions.
Aust Plant Physiol, 2000, 27: 685~691
7 Carvajal M, Cook DT, Clarkson DT. Responses of wheat
plants to nutrient deprivation may involve the regulation of
water-channel function. Planta, 1996, 199: 372~381
8 Yang HB, Chen M, Wang BS et al. Na+ exclusion mechanism
of the Na+ exclusion sites in wheat seedlings. J Plant Physiol
Mol Biol, 2002, 28(3): 181~186
9 Wang BS, Lüttge U, Ratajczak R. Effects of salt treatment
and osmotic stress on V-ATPase and V-PPase in leaves of
the halophyte Suaeda salsa. J Exp Bot, 2001, 52(365):
2355~2365
10 Ohshima Y, Iwasaki I, Suga S et al. Low aquaporin content
and low osmotic water permeability of the plasma and vacu-
olar membranes of a CAM plant Graptopetalum
paraguayense: comparison with radish. Plant Cell Physiol,
2001, 42(10): 1119~1129
11 Zeidel ML, Nielsen S, Smith BL et al. Ultrastructure, phar-
macologic inhibition, and transport selectivity of aquaporin
channel-forming integral protein in proteoliposomes.
Biochem, 1994, 33(6): 1606~1615
12 Rivers RL, Dean RM, Chandy G et al. Functional analysis of
nodulin26, an aquaporin in soybean root nodule symbiosomes.
J Biol Chem, 1997, 272(26): 16256~16261
13 Javot H, Maurel C. The role of aquaporins in root water
uptake. Ann Bot, 2002, 90: 301~313
14 Kaldenhoff R, Grote K, Zhu JJ et al. Significance of plasma-
lemma aquaporins for water-transport in Arabidopsis
thaliana. Plant J, 1998, 14: 121~128
15 Kirch HH, Vera-Estrella R, Golldack D et al. Expression of
water channel proteins in Mesembryanthemum crystallinum.
Plant Physiol, 2000, 123: 111~124
16 Vera-Estrella R, Barkla BJ, Bohnert HJ et al. Salt stress in
Mesembryanthemum crystallinum L. cell suspensions acti-
vates adaptive mechanisms similar to those observed in the
whole plant. Planta, 1999, 207(3): 426~435
17 Cutler SR, Ehrhardt DW, Griffitts JS et al. Random GFP:
cDNA fusions enable visualization of subcellular structures
in cells of Arabidopsis at a high frequency. Proc Natl Acad Sci
USA, 2000, 97(7): 3718~3723
18 Chaumont F, Loomis WF, Chrispeels MJ et al. Expression
of an Arabidopsis plasma membrane aquaporin in
Dictyostelium results in hypoosmotic sensitivity and devel-
opmental abnormalities. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94
(12): 6202~6209