全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 4期，2008年 8月 677
甘露醇、蔗糖和低温预处理对花楸体细胞胚诱导的影响
沈海龙 *, 高翔翔, 杨玲
东北林业大学林学院, 林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室, 哈尔滨 150040
提要: 用渗透剂甘露醇和蔗糖以及2~5 ℃低温分别预处理未成熟合子胚外植体, 研究其对花楸体胚诱导率影响的结果表明,
未成熟的合子胚经 1.0 mol·L-1甘露醇预处理 24 h后, 接种在添加0.5 mg·L-1 6-BA、0.2 mg·L-1 2,4-D和 4%蔗糖的MS培养基
上培养可产生大量体胚, 体胚诱导率可达84%, 显著高于未经甘露醇预处理的(诱导率为38%), 每个外植体产生的体胚数可
达 12.9个。体胚经成熟和萌发培养后形成再生植株。扫描电镜观察表明, 甘露醇预处理可改变外植体表面细胞的有序排
列, 改善体胚发生状况, 因而体胚诱导率增加。
关键词: 花楸; 体胚发生; 渗透剂; 低温
Effects of Mannitol, Sucrose and Cold Pretreatment on Somatic Embryogen-
esis of Sorbus pohuashanensis (Hance) Hedl.
SHEN Hai-Long*, GAO Xiang-Xiang, YANG Ling
School of Forestry, Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement and Biotechnology of Ministry of Education, Northeast
Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: Effects of pretreatments with osmotica, mannitol and sucrose, and 2–5 ℃ cold storage on immature
zygotic embryo explants of Sorbus pohuashanensis were conducted. The results showed that abundant somatic
embryos formed and the their regeneration rate reached 84% on MS medium supplemented with 0.5 mg·L-1 6-BA,
0.2 mg·L-1 2,4-D and 4% sucrose after pretreatment with 1.0 mol·L-1 mannitol for 24 h, average 12.9 somatic
embryos per explant were induced, the regeneration rate was much higher than that of untreated explants
(control, 38%). The somatic embryos converted into plantlets successfully after maturation and germination
culture. Scanning electron micrographs (SEM) revealed that pretreatment with 1.0 mol·L-1 mannitol for 24 h
disturbed the distribution pattern of the explant epidermal cells and the somatic embryogenesis was
enhanced.
Key words: Sorbus pohuashanensis; somatic embryogenesis; osmotica; low temperature
收稿 2008-04-11 修定 2008-06-27
资助 国家 “十一五 ”科技支撑项目子课题(2006BAD03A0405)
和东北林业大学校立基金(20 05 -2 00 7)。
* E-mail: shenhl-cf@nefu.edu.cn; Tel/Fax: 0451-82191044
花楸为蔷薇科花楸属小乔木, 是一种观花、
观叶、观果俱佳的珍贵经济树种。主要分布在我
国黑龙江省小兴安岭、完达山、张广才岭和老爷
岭山区; 吉林、辽宁、内蒙古和华北各省, 数量
稀少, 常生于较高海拔的山地暗针叶林内, 呈单株
散生状态。花楸种子具有休眠的特性, 采用传统的
育苗方法, 其发芽率低, 耗时长, 成型慢, 且存在采
种母树不足和种子收集困难等缺陷。体细胞胚胎
发生和植株再生具有以少量原始繁殖材料获取大量
繁殖后代的潜在优势, 可能是解决这些问题的途径
之一。体细胞胚胎发生受多种因素影响, 如外植体
来源、培养基、生长激素各种添加物、光和温
度等(周俊彦和郭扶兴 1996; 袁澍等 2003; 陈小飞
等 2007)。有研究表明, 外植体预处理有良好的体
胚诱导和体胚苗再生的效应, 其预处理方法有水浸
(Tu等 2005)、光照(D’Onofrio等 1998; Torne等
2001; 袁澍等 2003)、渗透剂(Reidiboym-Talleux等
1999; Iantcheva等2005; You等2006; Zhou和Brown
2006)、冷处理(Reidiboym-Talleux等 2000; 袁澍等
2003)、高浓度细胞分裂素(Kintzios等 2000)和其
他如嘧啶类化合物、三唑衍生物(Sena ra tna 等
2002)等。尽管不同的物种或基因型对不同处理方
法的反应不同, 但采用渗透剂处理和低温处理或二
者结合的方法比较广泛且效果较好。本文以花楸
未成熟合子胚为材料, 研究渗透调节剂和低温预处
理对花楸体细胞胚诱导的影响, 探求提高花楸体胚
植物生理学通讯 第 44卷 第 4期，2008年 8月678
诱导率的预处理方法, 从而为提高花楸体胚发生效
率和体胚苗转化率提供参考。
材料与方法
花楸[Sorbus pohuashanensis (Hance) Hedl.]未
成熟合子胚于 2006年 7月中旬采自黑龙江省植物
园二十多年生的花楸母树。取洗去杂质后的幼果,
用70%的酒精冲洗30 s (重复2次), 再用3% NaClO
冲洗10 min后以无菌水冲洗干净, 于超净工作台上
将幼果顶端切除 2~3 mm长, 挤出果实剩余部分内
的幼胚, 作预处理和接种(图 1-a~d)。
预处理分两种方法: (1)渗透剂预处理, 分别配
制浓度为 0.5、0.7、1.0 mol·L-1的甘露醇和蔗糖
溶液, 灭菌后, 将上述剥离出的幼胚分别浸泡在不
同溶液中 0、3、6、12、24和 48 h后接种。每
一处理 100个幼胚。(2)低温预处理, 将上述剥离出
的幼胚分别放在 2~5 ℃的温度下放置 0、3、5、
7 d后接种。每一处理 100个幼胚。
培养基有: ① MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1
2,4-D+500 mg·L-1水解酪蛋白(CH)+4%蔗糖; ②
MS+0.01 mg·L-1 NAA+4%蔗糖 +500 mg·L-1 CH; ③
MS+5 g·L-1 PEG6000+3%蔗糖; ④ MS+3%蔗糖; ⑤
MS+0.05 mg·L-1 IBA。各培养基均添加 6 g·L-1琼
脂, 高压灭菌前 pH调到 5.8。
体胚诱导时, 将幼胚接种于培养基①上进行诱
导培养。培养室温度 25 ℃左右, 暗中培养, 相对
湿度为 40%~70%。
植株再生培养时, 将诱导培养 35 d左右得到
图 1 花楸体胚诱导发生过程
Fig.1 Processes of somatic embryogenesis of S. pohuashanensis
a: 花楸幼果(1.0×); b: 果实横切面(1.0×); c: 剥离后的幼胚(1.0×); d: 接种后的外植体(1.0×); e: 未经处理的幼胚体胚发生(对照, 1.0×);
f: 1.0 mg·L-1甘露醇预处理 24 h后的幼胚体胚发生(2.0×); g: 分化的鱼雷型体胚(2.5×); h: 子叶型体胚(1.25×); i: 体胚在试管内萌发
(1.0×); j: 体胚形成的再生植株(1.0×)。
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的体细胞胚继代到培养基①上再培养20 d后, 轻轻
将体胚分离下来, 转接到培养基②上进行增殖培养;
每30 d更换一次增殖培养基②; 有大量子叶型体胚
出现时转接到培养基③上进行成熟培养, 直至出现
大量成熟子叶型体胚时, 将其转至萌发培养基④上
进行萌发培养, 长出真叶时, 将其接入生根培养基
⑤上诱导生根, 直至形成完整植株。培养条件: 培
养温度为(24±2) ℃, 光照强度为 20 µmol·m-2·s-1左
右, 每天 16 h光照 /8 h黑暗, 相对湿度为 40%~
7 0 %。
电镜观察参考谢娇等(2007)和杨玲(2007)文中
的方法, 分别取培养前未经预处理的幼胚(剥离出的
新鲜幼胚长约 4 mm)、培养前经 1.0 mol·L-1甘露
醇浸泡 24 h后的幼胚(长 6 mm)和培养 3 d后的幼
胚用液氮固定后粘于样品台上, 采用美国FEI公司
生产的Quanta 200型扫描电子显微镜进行超微形
态观察并照相。
体胚诱导率用经诱导产生体胚的外植体个数
占接种外植体总数的百分比表示。
结果与讨论
1 未成熟合子胚的体胚发生
未成熟合子胚接种于培养基①上, 培养 3 d后
开始萌动, 2片子叶微微分开并逐渐膨大, 呈淡黄
色。1周左右即见有透明颗粒状愈伤组织广泛分
布在 2片子叶的边缘, 少量分布在表面上。15 d左
右可观察到有少量较小的乳白色瘤状突起(早期原
胚), 出现于 2片子叶上表面。培养 20 d时, 可看
到子叶边缘的表面上有大量乳白色瘤状突起, 有的
子叶边缘产生大量愈伤组织。30 d左右, 可观察
到胚轴以及子叶表面上乳白色突起变大, 呈半透明
状, 此时将愈伤组织和瘤状突起剥离开来, 瘤状突
起进行继代培养 35 d时, 记录体胚数量, 统计体胚
诱导率。未经处理幼胚的体胚诱导如图 1-e所示。
2 渗透调节剂预处理对体胚的诱导效应
从图 1-d可见, 合子胚经渗透剂浸泡后, 子叶
均张开, 其中用 0.7和 1.0 mol·L-1甘露醇浸泡 12和
24 h的子叶张开比较明显; 培养 15 d时, 经过 1.0
mol·L-1甘露醇浸泡 3、6、12、24 h的幼胚均长
出鲜黄色的胚性愈伤组织; 培养 20 d时, 子叶表面
和胚轴延伸处有大量瘤状突起, 少数出现早期体胚;
培养30 d时, 比较多的白色半透明早期体胚呈圆形,
突起于子叶表面。渗透剂预处理后的合子胚, 其子
叶张开现象明显, 并较早出现, 愈伤组织出现较早,
早期体胚数量较多。方差分析(表 1)表明, 不同外
植体预处理方法影响花楸体胚诱导率的差异达到极
显著水平(P=0.0001)。渗透剂浓度对花楸体胚发
生的影响显著(P=0.040<0.05), 预处理时间对花楸
体胚发生的影响不显著(P=0.307>0.05)。采用 1.0
mol·L-1甘露醇预处理 24 h后的幼胚的体胚诱导率
(早期原胚诱导率为 84%)最高, 诱导产生的体胚数
量每外植体可达 12.9个。延长或缩短 1.0 mol·L-1
甘露醇的预处理时间均不能提高体胚诱导率, 其中
1.0 mol·L-1甘露醇预处理 6、24、48 h时的体胚
发生率与未经预处理相比差异均达到显著水平
(P=0.01<0.05、P=0.01<0.05、P=0.02<0.05)。处
理时间 24 h下, 其他浓度甘露醇预处理的幼胚体
胚诱导率差异不显著(P=0.01<0.05、P=0.01<0.05、
表 1 甘露醇和蔗糖预处理对花楸体胚诱导率的影响
Table 1 Effects of mannitol and sucrose on the induction rate of somatic embryos of S. pohuashanensis
%
预处理 浸泡时间 /h
渗透剂 浓度 /mol·L-1 0 3 6 12 24 48
对照 0 38.0±3.0ABCDE — — — — —
甘露醇 0.5 — 12.0±11.0CDEF 0±0F 6.7±11.5aDEF 26.3±5.4BCDEF 8.3±14.2DEF
甘露醇 0.7 — 11.3±12.8CDEF 13.3±15.3CDEF 41.0±18.3ABCD 61.7±2.0AB 6.7±5.8DEF
甘露醇 1.0 — 30.0±10.0BCDE 6.7±12.8DEF 52.3±9.0ABC 84.3±3.3A 22.3±7.1BCDEF
蔗糖 0.5 — 23.3±15.3BCDEF 12.0±11.3CDEF 10.0±10.0CDEF 0±0F 3.0±5.8EF
蔗糖 0.7 — 26.7±20.8BCDEF 16.7±15.7CDEF 13.3±15.3CDEF 3.3±5.8EF 10.0±10.0CDEF
蔗糖 1.0 — 10.0±10.0CDEF 18.3±20.8CDEF 26.7±20.8BCDEF 26.7±15.3BCDEF 33.3±20.7ABCDE
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P=0.01<0.05)。1.0 mol·L-1蔗糖预处理的体胚诱导
率低于不经预处理水平, 但预处理时间为 6、12、
24 h时的这种差异未达到显著水平(P=0.40>0.05、
P=1.0>0.05、P=0.67>0.05)。这些与 Choi和 Soh
(1997)、Zhou和 Brown (2006)用蔗糖预处理以及
You等(2006)用蔗糖和甘露醇预处理刺五加体细胞
胚诱导和体胚苗转化效果的结果基本上是一致的;
但本文中甘露醇比蔗糖似乎好一些。
3 低温预处理对体胚的诱导效应
低温预处理中以处理 5 d的体胚诱导率较高
(27%), 但低于未经低温预处理的(38%), 影响不显
著(P=0.355>0.05) (图 2)。培养 20 d的合子胚有愈
伤组织和少量早期体胚产生。愈伤组织呈淡黄色
并伴有瘤状胚性愈伤组织, 体胚呈白色不透明状。
这说明低温预冷处理可以降低花楸未成熟合子胚的
体胚诱导率, 不利于细胞胚性的潜能表达。SPSS
分析表明, 不同时间的低温预处理对体胚发生率的
影响不显著(P=0.776>0.05、P=0.280>0.05、P=0.188>
0.05)。这些与文献中适当的低温预处理可改善大
豆和平贝母(袁澍等2003)及欧洲甜樱桃(Reidiboym-
Talleuxa等 2000)体胚发生和植株再生状况的结果
不一致, 说明 2~5 ℃低温预处理并不适用于花楸。
4 花楸幼胚子叶表面细胞的形态学观察
从图3可见, 未经渗透剂预处理的子叶表面细
胞排列较为规则(图 3-a), 培养 3 d的细胞形态和排
列有明显变化, 子叶边缘细胞较为规则且细胞排列
紧密, 没有明显的子叶扩大现象(图 3-b); 经 1.0
图 2 2~5 ℃低温预处理对花楸体胚发生率的影响
Fig.2 Effects of cold pretreatment (2-5 ℃) on the induction
rate of somatic embryos of S. pohuashanensis
图 3 花楸幼胚子叶表面细胞的电镜观察(50 µm)
Fig.3 SEM of immature embryo epidermal cells of S. pohuashanensis
a: 未经处理子叶表面细胞(500×); b: 培养 3 d的未经处理的子叶表面细胞(500×); c: 1.0 mol·L-1甘露醇浸泡 24 h的子叶表面细胞
(500×); d: 1.0 mol·L-1甘露醇浸泡 24 h和培养 3 d的子叶表面细胞(500×)。
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mol·L-1甘露醇浸泡 24 h的子叶表面细胞排列不紧
密, 产生不规则的突起(图 3-c), 培养 3 d的子叶表
面细胞有明显的凹陷, 并伴有多细胞突起, 有早期
原胚生长(图 3-d)。这与 Choi和 Soh (1997)用蔗糖
处理以及You等(2006)用蔗糖和甘露醇处理后刺五
加的单胚和合子胚表面细胞产生质壁分离的现象相
似。
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