全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 2期，2008年 4月350
诱导子对长春花生物碱生物合成的诱导与调控
贺丽虹 *，赵淑娟 **，胡之璧 **
上海中医药大学中药研究所，上海 201203
Induction and Manipulation of Alkaloid Biosynthesis in Catharanthus roseus by
Elicitors
HE Li-Hong*, ZHAO Shu-Juan**, HU Zhi-Bi**
Institute of Traditional Chinese Meteria Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China
提要：真菌诱导子、信号分子、植物生长调节物质等诱导子对长春花生物碱的生物合成具有调控作用。文章介绍了诱导
子种类、诱导效果与调控机理等方面的研究进展。
关键词：长春花；次生代谢；诱导子
收稿 2008-01-16 修定 2008-03-21
资助 国家自然科学基金(30 2 00 3 5 8)。
* 现在地址：苏州大学生命科学学院(江苏苏州 215006)。
** 通讯作者(E-mail：zhaoshujuan@126.com；Tel：021-
5 1 3 2 2 5 7 6 )。
长春花(Catharanthus roseus)是夹竹桃科长春
花属的一种重要药用植物，含长春碱、长春新
碱、阿玛碱、蛇根碱等 1 0 0 多种生物碱，大多
具有很高的药用价值。其中长春碱和长春新碱可
用于治疗何杰金氏病、恶性淋巴肿瘤、急性淋巴
细胞型白血病、绒毛上皮细胞癌等癌症，是目前
应用最广泛的天然植物抗肿瘤药物；阿玛碱可治
疗高血压、心率不齐等心血管疾病；蛇根碱具有
镇定作用；长春质碱有抗菌止血、利尿、降血
糖等作用。但在植物体中这些有效成分的含量较
低，远远不能满足市场需求。因此，从 20 世纪
60年代人们开始利用植物组织和细胞培养技术生
产长春花生物碱。如何提高长春花组织和细胞培
养物中药用生物碱的含量是国内外专家广泛关注的
问题。运用诱导子，如真菌提取物、茉莉酸
(jasmonate，JA)、水杨酸、乙烯、光照等促进
生物碱合成可能是一条可行的途径。
诱导子(elicitor)是指能够引起目标生物体发生
生理变化的各种生物与非生物因子。对植物来
说，广义的诱导子是指能够引起植物发生生理学
和形态学反应并积累抗毒素的各种生物与非生物因
子。其中非生物诱导子包括金属离子和无机化合
物，生物诱导子包括来源于真菌、细菌、病毒、
食草动物和植物细胞壁的成分以及植物受到病菌或
食草动物伤害时在受伤部位释放的化学物质。狭
义的诱导子专指生物来源的诱导子和人工合成的生
物诱导子类似物(Zhao等 2005)。外源施加的诱导
子能够通过信号分子转导途径，促进长春花生物
碱合成途径中相关基因(图 1)的表达，以诱导特定
的次生代谢产物形成和积累。本文介绍外源诱导
子诱导和调控长春花生物碱合成的研究进展。
1 真菌诱导子
真菌诱导子是来源于真菌的一类确定的化学
信号，包括真菌的表面结构性成分和分泌的代谢
产物，如真菌孢子、菌丝体、匀浆、真菌细胞
壁成分、真菌培养物滤液等。从化学结构上分主
要包括：甲壳素、N - 乙酰基葡萄糖低聚物、多
糖、β - 葡聚糖、乙酰葡萄糖醛酸、糖蛋白、蛋
白质、短肽、麦角固醇、不饱和脂肪酸等(Boller
1995)。自然情况下真菌等病害侵染植物后能诱发
植物体在感染区域建立局部过敏反应，产生抗毒
素等次生代谢产物。将真菌匀浆后高温灭菌制备
成的真菌诱导子同样具有诱导植物细胞中防御基因
表达、诱发植物过敏反应和促进植物细胞中特定
次生代谢产物合成等多种功能。采用真菌诱导子
激活植物细胞中的次生代谢途径已成为提高植物细
胞培养物中目标产物产量的有效手段之一(Roberts
和 Shuler 1997)。真菌诱导子虽能抑制长春花细胞
或毛状根的生长，但对其生物碱合成却有促进作
用(Moreno等 1996)。
真菌诱导子对长春花生物碱合成的诱导效果
与真菌种类、诱导剂量、诱导时间长短及诱导时
细胞或毛状根的日龄等具有密切关系。不同种类
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的真菌对长春花生物碱合成的影响不同。一般能
够导致植物产生过敏反应和细胞程序化死亡的病原
性真菌的促进作用更明显。腐霉菌属的真菌对生
物碱合成具有强烈的刺激作用，如瓜果腐霉
(Pythium aphanidermatum)。而非致病性真菌的作
用不明显，如毛霉菌属(Mucor)的种类诱导作用就
很弱(Zhao等 2001b)。钟器腐霉(Pythium vexans)
诱导子 0.87~8.7 mg·L-1 (Nef等 1991)，稻曲霉
(Ustilaginoidea virens)诱导子 10 mg·L-1 (Zhao等
2001b)，黑曲霉(Aspergillus niger)诱导子 20 mg·L-1
(Zhao等 2001b)的诱导效果最好。可见，不同种
类真菌诱导子的最适诱导剂量是不同的。诱导子
浓度过高(约26 mg·L-1的钟器腐霉诱导子)会抑制细
胞生长并导致其死亡，甚至使生物碱产量大幅下
降(Nef等 1991)。不同日龄的长春花悬浮培养细
胞对诱导子的敏感性和反应不同。培养 20 d的长
春花悬浮细胞对绿色木霉(Trichoderma viride)诱导子
较敏感，能够显著刺激阿玛碱的产生(Namdeo等
2002)。在指数前期(5 d)用稻曲霉诱导子处理长春
花细胞 CR8C能促进色胺的积累，而在指数期(7
d)处理则能显著促进阿玛碱和长春质碱的积累
(Zhao等 2001b)。诱导子处理天数通常以 2~4 d为
宜，时间过长会抑制生物碱合成并导致细胞死亡
(Zhao等 2001b；Nef等 1991；Namdeo等 2002)。
真菌诱导子通过多糖或信号物质与植物细胞
表面的特异受体结合，激发胞内的信号传递，诱
导生物碱合成相关基因(图 1)的表达，进而诱导生
物碱的合成与积累。瓜果腐霉诱导子处理后，长
春花悬浮培养细胞中色氨酸脱羧酶( t ryptophan
deca rb ox yl a s e，TDC)、氨基苯甲酸盐合成酶
图 1 长春花萜类吲哚生物碱的生物合成途径
单箭头表示单一酶催化，双箭头表示多步反应，虚线剪头表示步骤不清楚。
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(anthranilate synthase，AS)、异胡豆苷合成酶
(strictosidine synthase，STR)的活性立即得到诱
导，异胡豆苷 β - 葡萄糖苷酶( st r ic tos idine β -
glucosidase，SGD)的活性没有明显变化，而牻牛
儿醇 10-羟化酶(geraniol 10-hydroxylase，G10H)的
活性则受到抑制(Moreno等 1996)。研究证实，诱
导后色氨酸脱羧酶和异胡豆苷合成酶两种酶活性的
增强是由于在转录水平上发生了强烈的瞬时积累，
而在未作诱导处理的材料中色氨酸脱羧酶的转录刚
刚能检测到，异胡豆苷合成酶的转录则检测不到
(Pasquali等 1992)。酵母激发子(yeast elicitor，YE)
诱导包括 TDC和 STR在内的多种吲哚生物碱合成
酶基因的表达，其诱导作用由蛋白质磷酸化、
Ca2+内流和 JA所介导(Menke等 1999a，b；Me-
melink等 2001；Pauw等 2004)。不同种类真菌
诱导子所含的多糖或信号物质的差异导致其对长春
花生物碱合成的促进效果不同，而不同细胞系细
胞表面受体的差异导致其对同一诱导子的敏感性和
反应不同(Zhao等 2001b)。
2 信号分子
2.1 茉莉酸类化合物(jasmonates，JAs) 茉莉酸
类物质是一类特殊的环戊烷衍生物，具有促进衰
老和抑制生长的作用，并作为一种重要的内源信
号分子参与植物伤反应，诱导植物产生生物碱、
酚酸等次生代谢物质。在长春花中茉莉酸类物质
通常能够促进所有目标生物碱的产生。
茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MJ)能够激活
长春花幼苗中水甘草碱、文多灵、长春质碱等单
萜吲哚类生物碱的合成(Aerts等 1994)，促进长春
花悬浮细胞、毛状根培养物中阿玛碱、蛇根碱等
生物碱的合成与积累(Gantet等 1998；Lee-Parsons
等 2004；Rijhwani和 Shanks 1998)。生物碱的产
量与 JA的浓度、细胞和毛状根的日龄有关。培
养 4 d处于活跃生长期的细胞对MJ比较敏感，但
生物碱的积累则发生在培养 6~10 d 的平台期细胞
中(Gantet等 1998)。在毛状根培养物的指数期后
期添加 JA，阿玛碱产量提高了 80%，蛇根碱提
高了 60%，洛克新碱提高了 150%，hörhammericine
提高了 500% (Rijhwani和 Shanks 1998)。生物碱
产量与添加的MJ浓度呈相关性，10~100 µmol·L-1
的MJ对阿玛碱合成的诱导效果较好(Lee-Parsons
等 2004)，水甘草碱的产量随着MJ浓度的增加而
增加(Aerts等 1994)。
外源施加 JA或MJ能促使生长素抑制的长春
花细胞恢复产生生物碱的能力。在无生长素的培
养基中长春花细胞能超量合成阿玛碱，这可能是
由于生长素缺失这一应急信号引起细胞内源性 JA
大量合成，进而引起阿玛碱超量合成(Gantet等
1998)。
用十八烷酸途径抑制剂处理长春花细胞，其
生物碱合成大大降低，如同时外源施加MJ则细胞
能够恢复产生生物碱的能力。因此可以推测长春
花的生物碱合成依赖于十八烷酸途径合成的JA来
传导信号(Menke等 1999b；Gantet等 1998)。外
源施加 JAs一方面可以直接诱导相关基因的表达，
促进酶活性，另一方面可以刺激内源 JA的合成，
通过内源 JA介导的信号途径诱导相关基因的转
录、翻译等。在长春花中多种生物碱合成关键酶
基因，如 G10H、TDC、SGD、STR、D4H等，
均在转录水平上受M J 诱导与调控( M oreno 等
1 9 9 6；G a nt e t 等 1 9 9 8；P a s q ua l i 等 1 9 9 9；
Ouwerkerk和Memelink 1999；Menke等 1999a，
b；Geerlings等 2000；Collu等 2001)。JA在长
春花的诱导子响应过程中起重要作用(Memelink等
2001)。真菌诱导子对STR基因表达的诱导需要JA
作为第二信使(Menke等 1999a，b)。
2.2 Ca2+ Ca2+信号通路是已确认的植物信号转导
的主要途径，Ca2+作为第二信使在其中发挥重要
作用。在诱导因子诱导的长春花信号转导中 Ca2+
也发挥着重要作用。
在长春花细胞培养物中，Ca2+内流增加促进
生物碱的合成。在真菌诱导子、MJ 和激素诱导
的生物碱合成中 Ca2+内流起着关键的调节作用。
真菌诱导子能够促进生物碱的合成，但在没有
Ca2+的培养基中，此种效应受到明显影响。如果
在真菌诱导的长春花悬浮细胞中加入 Ca2+螯合剂
(EGTA)和Ca2+通道阻断剂(verapamil)以减少Ca2+内
流，也会降低蛇根碱、阿玛碱和长春质碱等生物
碱产量。而将真菌诱导子和 200 mmol·L-1 CaCl2一
起加入则能更强地诱导生物碱的合成。说明真菌
诱导子诱导的生物碱合成在一定程度上依赖于Ca2+
的存在(Zhao等 2001a)。真菌诱导子刺激后，由
于一些膜蛋白的磷酸化和去磷酸化，钙通道开
放，引起 Ca 2+、H +内流，K +、Cl - 外流，细胞
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膜发生短暂的去极化。胞内 Ca2+浓度的升高引起
与钙信使耦联的胞内信号转导和级联放大，最后
引起细胞内大量抗性相关基因的表达，并合成与
抗性相关的结构蛋白、细胞壁多糖及次生代谢物
质。加入 Ca2+螯合剂或钙通道阻断剂后，细胞内
过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、
苯丙氨酸氨基裂解酶等酶活性降低，而加入
CaCl2则几种酶活性也急剧升高(Zhao等 2005)。
可见，钙离子在传导真菌诱导子的刺激信号中起
作用。
JA和Ca2+都是参与长春花生物碱合成调控的
信号分子，二者在介导反应过程中相互影响
(Gantet等 1998；Lee-Parsons等 2004；Lee-Parsons
和 Ertürk 2005)。Ca2+能够调节植物内源 JA的生
物合成(van der Fits等 2000)。Ca2+抑制剂能够抑
制墨西哥柏细胞培养物中的脂氧合酶活性，该酶
参与 JA的生物合成(Zhao和 Sakai 2003)。在长春
花悬浮培养细胞中添加 10和100 µmol·L-1 MJ的同
时添加 CaCl2，随着外源 Ca2+浓度的增加(23、43
mmol·L-1)，MJ诱导的阿玛碱合成受到抑制。在
添加 1 00 µmol · L- 1 MJ 的同时加入 E GTA 和
verapamil，对MJ诱导的阿玛碱合成同样有抑制作
用。这说明在MJ诱导的信号转导途径中必须有适
宜浓度的 Ca2+参与才能促进生物碱的生成。胞内
Ca2+浓度过高或过低都会抑制MJ的作用。在外源
添加 3 mmol·L-1 Ca2+和 100 µmol·L-1的MJ时阿玛
碱产量达到最高(Lee-Parsons和 Ertürk 2005)。
钙和钙调素介导细胞分裂素诱导的吲哚生物
碱合成。如果培养基中没有 Ca2+存在，则细胞分
裂素诱导的阿玛碱和蛇根碱合成会受到抑制
(Mérillon等1991)。单独向培养基中添加细胞分裂
素或Ca2+都能促进长春花细胞C20合成阿玛碱，二
者同时添加则阿玛碱产量可得到更大提高，比不
添加的提高 5~17倍(Decendit等 1992)。
但长春花毛状根对 Ca2+内流的反应则相反，
减少 Ca 2+内流能够提高总生物碱和蛇根碱的产
量。verapamil和 CdCl2能够阻止胞外 Ca2+通过质
膜流入细胞内。在长春花毛状根培养物中加入
verapamil和 CdCl2，总生物碱产量提高 25%，其
中培养液中的产量提高 10倍。而经EGTA处理的
毛状根可促进90%的总生物碱向培养液中分泌。用
细胞内Ca2+流动抑制剂如TMB-8 [8,8-(diethylamino)
octyl-3,4,5-trimethoxy-benzoate]和 thapsigargin处理
后，总生物碱产量提高 74%，培养液中的分泌量
提高 4~6倍(Moreno-Valenzuela等 2003)。
2.3 NO NO是一种水溶性和脂溶性兼具的小分子
物质，是动物和植物体内常见的信号分子。NO
参与植物的抗病作用，能够诱发大豆和烟草细胞
中植保素合成基因的表达，并能够诱发长春花细
胞中次生代谢产物合成与积累，其诱导作用与MJ
和真菌诱导子存在交互作用(Xu等 2005；Xu和
Dong 2005)。
Xu等(2005)将不同浓度的NO供体亚硝基铁
氰化钠(sodium nitroprusside，SNP)添加到长春花
悬浮培养细胞中，测定细胞的生长和长春质碱的
合成。结果显示，高浓度(10和 20 mmol·L-1)的
SNP促进长春质碱的形成但抑制细胞的生长；低
浓度(0.1和 0.5 mmol·L-1)的 SNP则促进细胞的生
长，但对长春质碱的合成没有影响。在培养起始
(0 d)和 10 d加入 0.5和 10.0 mmol·L-1 SNP，总长
春质碱产量提高 2倍。NO诱导的长春质碱合成受
MJ生物合成抑制剂布洛芬(ibuprofen，IBU)和去
甲二氢愈创木酸(nordihydroguaiaretic，NDGA)的
抑制。说明NO诱导的长春质碱合成部分地依赖
于 JA。用桔青霉细胞壁制备的诱导子处理长春花
悬浮细胞会引起培养液中NO迅速产生，并伴随
长春质碱产量升高，这一诱导作用能够被NO清
除剂[2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5- tetramethylimida-
zoline-1-oxyl-3-oxide，cPTIO]和 NO合成酶抑制
剂[S,S’-1,3-phenylene-bis(1,2-ethanediyl)-bis-
isothiourea，PBITU]所抑制。PBITU抑制真菌诱
导子诱导的长春质碱合成，这种抑制作用能被外
源施加NO供体 SNP所恢复，这表明真菌诱导子
诱导的长春质碱合成可能部分地依赖于NO介导的
信号转导(Xu和Dong 2005)。
2.4 水杨酸 水杨酸是一种能够激发植物细胞产生
系统抗性的信号物质。低浓度的水杨酸能够诱导
长春花幼苗中蛇根碱和水甘草碱的积累，而高浓
度的则诱导文多灵的积累(El-Sayed和Verpoorte
2004)。水杨酸对长春花悬浮培养细胞的阿玛碱、
蛇根碱合成也有促进作用(Zhao等 2000b)。
3 植物生长调节物质
植物生长调节物质能够显著影响悬浮培养细
胞的次级代谢。其中生长素和赤霉素是强烈的抑
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制剂，而细胞分裂素、脱落酸和乙烯起促进作用。
3.1 生长素类似物(auxins) 生长素类化合物能够
抑制吲哚生物碱合成相关基因的表达，抑制上游
合成途径或代谢流，影响生物碱前体供应，进而
抑制生物碱的合成(El-Sayed和Verpoorte 2002)。
NAA和 2,4-D能够下调 STR和 TDC基因的表达
(Pasquali等 1992)。长春花细胞C20在维持培养基
中只积累痕量的生物碱，当把 2,4-D从培养基中
移除则能够促进生物碱产生，向无 2,4-D的培养
基中添加细胞分裂素、6-苄氨基嘌呤和反玉米素
能进一步提高这种促进作用。而将长春花细胞从
含有 2,4-D的培养基中转移到不含 2,4-D的培养基
中也能诱导生物碱的合成。证明 2,4-D对生物碱
的合成和积累有抑制作用。生长素对生物碱合成
的抑制作用主要发生在培养的前 3 d (Arvy等
1994)。
3.2 细胞分裂素(cytokinin) 如苄基腺嘌呤，能够
促进细胞分化并刺激生物碱的产生。在长春花悬
浮细胞和愈伤组织培养物中添加细胞分裂素可提高
阿玛碱和蛇根碱的产量。而内源产生的细胞分裂
素则不能模拟添加的外源细胞分裂素对长春花生物
碱合成的促进作用(Garnier等 1996)。关于细胞分
裂素影响次生代谢的机制目前知之甚少，推测它
可能是通过与其他植物生长调节物质的相互影响而
发挥作用的。
在长春花细胞C20D培养基中添加细胞分裂素
和乙烯都能强烈促进阿玛碱生成。但外源细胞分
裂素对生物碱的促进作用与内源乙烯含量的增高没
有相关性，说明乙烯不能介导细胞分裂素对生物
碱合成的促进作用，添加的外源细胞分裂素和乙
烯是通过不同途径促进长春花生物碱合成的(Yahia
等 1998)。
添加外源乙烯和脱落酸能够促进长春花幼苗
合成阿玛碱、蛇根碱、水甘草碱、长春质碱和
文多灵(El-Sayed和Verpoorte 2004)。
4 其他小分子物质
Rijhwani和 Shanks (1998)用 72个单位的果胶
酶添加到指数期后的毛状根中，48 h后检测发现
水甘草碱提高 2.5倍，但对其他生物碱无影响。纤
维素酶和果胶酶诱导长春花细胞系A11后，裂环
马钱子苷降解酶类受到激活，异胡豆苷 -β-葡萄糖
苷酶活性没有变化，细胞对马钱子苷的吸收受
阻，细胞内裂环马钱子苷和异胡豆苷的含量降低
而色胺含量增加，阿玛碱含量没有变化(Contin等
1999)。
5 光照
光照是影响长春花细胞中酶活性进而影响其
生物碱合成与积累的重要因素。文多灵合成途径
中的 3个酶，包括水甘草碱 16-羟化酶(tabersonine
16-hydroxylase，T16H)、脱乙酰氧基文多灵 4-羟
化酶(desacetoxyvindoline 4-hydroxylase，D4H)、
脱乙酰基文多灵4-O-乙酰转移酶(deacetylvindoline 4-
O-acetyltransferase，DAT)都需要在光照条件下才
能表达。在长春花受光幼苗中，D4H表达量是黄
化幼苗中的 8~9倍，而暗室培养的长春花幼苗进
行光照培养后其DAT的表达也逐渐增加。光适应
的长春花毛状根培养较暗室培养的生长速率高，
蛇根碱合成增加而水甘草碱减少，但没有检测到文
多灵和脱乙酰文多灵，而洛柯因和 hörhammericine
则有所增加，说明水甘草碱流向了其他支路。长
春花生物碱的光依赖合成可能是由一些细胞色素或
光敏色素介导的(Vazquez-Flota和De Luca 1998)。
6 金属离子
金属离子作为胁迫因子也可促进长春花积累
生物碱。硫酸氧钒可强烈促进长春花细胞合成吲
哚生物碱。稀土元素铈、钇、钕能促进长春花
悬浮培养细胞积累阿玛碱和长春质碱，而镧、
钐、铬、钛、硒等则对生物碱合成无影响(Zhao
等 2000a)。重金属离子镉可促进指数中期细胞合
成阿玛碱，并促进阿玛碱向培养基中释放(Zheng
和Wu 2004)。
7 结语
综上所述，施用外源理化诱导因子能够有力
地促进长春花幼苗、悬浮培养细胞和毛状根的生
物碱积累，是提高药用生物碱产量的有效途径。
目前采用长春花细胞和毛状根培养只能生产用于降
压和镇痛的阿玛碱、蛇根碱和长春质碱，而长春
碱、长春新碱则检测不到。这可能是由于长春花
细胞和毛状根培养体系中不能或极少合成双吲哚生
物碱的重要前体物文多灵。长春花细胞中文多灵
的合成在转录水平上受抑制时，即检测不到D4H
和 D A T 基因的表达，但两种基因并未丢失
(Vázquez-Flota等 2002)。因此，诱导细胞和毛状
根中D4H和 DAT基因在转录与翻译水平上的表
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达，以促进文多灵的生物合成，将有可能突破长
春花细胞和毛状根培养物不能合成双吲哚生物碱这
一障碍，从而为工业化生产长春花药用生物碱打
开新局面。
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