全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 3期，2004 年 6 月 369
收稿 2003-07-21 修定 　 2003-12-02
资助　 北京市自然科学基金重点项目(5021001)。
* 通讯作者(E-mail:xlliu@mail.cnu.edu.cn, Tel:010-
68902345)。
基因打靶技术在模式植物小立碗藓的应用
习阳 刘祥林* 何奕昆
首都师范大学生物系，北京 100037
Application of Gene Targeting in Physcomitrella patens
XI Yang, LIU Xiang-Lin*, HE Yi-Kun
Department of Biology, Capital Normal University, Beijing 100037
提要 介绍了基因打靶技术在新型模式植物小立碗藓(Physcomitrella patens)中的应用。
关键词 小立碗藓(Physcomitrella patens); 基因打靶; 同源重组；基因敲除
所谓基因打靶(gene targeting)，是将携带有选
择标记的外源目的基因采用一定的实验方法导入受
体细胞，再通过外源 DNA 序列与受体细胞染色体
上同源 D N A 序列间发生重组，最终将外源 D N A
定点整合入受体细胞基因组某一确定的位点，或
对某一预先确定的受体位点进行定点突变，导致
受体细胞基因功能敲除或者点突变发生的技术[1]。
由于其可对基因产生特异性突变，这就避免了由
于随机突变方法带来的许多限制，成为功能基因
组学研究中最直接的遗传操作工具[2]。
从 1988 年以来，人们对植物基因打靶就以
各种不同形式进行了尝试。如直接将基因转入原
生质体[3] ，或者用根癌农杆菌介导转化人工座
位，或者基因组上原来座位 [4]。但其随机整合频
率很低(小于 10-4)，这使得基因打靶技术在植物
基因功能组学领域的研究中受到严重的阻碍[5]。
苔藓植物中的小立碗藓(Physcomitrella patens)是
一种极具分子生物学研究前景的新的遗传模式系
统。它以单倍的配子体主导生活史和外源 D N A
的绝大部分可以同源重组整合入特定位点等特征为
人们所重视[1]。被视为植物王国中新的“绿色酵
母”，在植物基因功能的研究中有巨大的潜在应
用价值[2]。
1 作为模式植物的小立碗藓
苔藓是地球上陆生植物最古老的种群之一，
起源于5亿年前,分布及其广泛[6]。进化学认为苔
藓植物和维管植物是单起源系统进化上的一个姐妹
进化支[7]。从苔藓植物在进化树上的相对位置说
明它是研究陆生植物进化的理想材料。
小立碗藓以单倍的配子体形态占据主要生活
世代，生活史经历 3 个发育阶段：幼小配子体时
的丝状体、成熟配子体时的茎叶体和二倍体的孢
子体时期。这为研究基因在不同发育阶段的表达
调控提供了良好的材料[8]。
虽然小立碗藓具有相对简单的植体结构，但
它的组成却与其他陆生植物无异。基因组约为
511 Mb, 是拟南芥的4倍，和水稻基因组相差不
多，有 27 条染色体[9~12]。基因组相对较小，这
为遗传操作带来了极大方便。
当然，小立碗藓最吸引生物学家的是它有极
高的同源重组频率。为了验证基因打靶在小立碗
藓中的可行性以及确定是否具有很高的同源重组频
率，Schaefer和Zryd[13]在1997年构建了3个不同
的转化载体，对小立碗藓基因组中 3 个不同的染
色体座位进行了基因打靶试验，结果证明在含有
2.3~3.6 kb同源序列的情况下，小立碗藓同源重组
频率可达到 93%。如此高的同源重组频率在陆地
植物中绝无仅有，因而它是植物功能基因组学研
究的有利工具。
2 基因打靶在小立碗藓中的应用
自1997年在小立碗藓中基因打靶获得成功以
后[13]，人们采用基因打靶技术研究小立碗藓基因
功能逐渐进入新的阶段。主要采用插入型或者替
研究通讯Research Letter
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代型载体经聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)介
导对小立碗藓原生质体进行转化(图 1)。
FtsZ蛋白是在细菌中发现的一种与细胞分裂
有关的蛋白质，在细胞分裂过程中对分裂环的形
成起主要作用。迄今为止，只在一种高等真核生
物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中发现过与FtsZ具
有同源性的核编码 cDNA 序列，在氨基酸序列的
N 端有延伸部分，可能在细胞器的植入方面起引
导肽的作用，并且分析ftsZ基因可能与质体分裂
相关，但具体功能目前仍未知[14]。1998 年 Reski
研究组[15]从小立碗藓中通过PCR 方法扩增到与细
菌ftsZ基因同源的cDNA序列PpftsZ，编码378个
氨基酸，此为真核生物中第二个ftsZ同系物。与
拟南芥ftsZ基因不同，小立碗藓ftsZ基因的产物
缺少明显的N端延伸部分。当与大肠杆菌(E. coli)
ftsZ基因比较时发现N端多出一个具有10个氨基酸
的延伸部分，具体功能仍不清楚。为获得PpftsZ
基因的功能，在此基因的编码区插入一个由 35S
启动子驱动的nptⅡ选择标记基因，两侧分别含有
247 和 658 bp 的 PpftsZ cDNA 序列，用线性DNA
经 PEG 介导转化小立碗藓原生质体，进行基因敲
除，结果以 14% 的重组频率得到转基因植株。与
正常细胞含50个左右的叶绿体相比，转基因个体
的每个细胞中只含有 1 个大的叶绿体。他们在真
核生物中首次证明FtsZ蛋白与细胞分裂有关，它
为原核生物细胞器分裂和真核生物细胞器分裂之间
是保守的学说第一次提供了分子水平上的证据。
但是在维管植物的叶绿体中是否也存在类似结构，
仍需进一步研究。不管怎么样，在苔藓植物中进
行的此项工作，可为进一步了解质体分裂提供新
的视点[2]。
小 立 碗 藓 含 有 高 水 平 的 花 生 四 烯 酸
(arachidonic acid)，它是由亚油酸经过脱氢和延长
而来，需要D5和D6-不饱和脱氢酶的参与。1998
年，Girke 等[16]以 PCR 为基础在小立碗藓中得到
一个全长的 cDNA 序列，并推测它可能是一个新
的脱氢酶。氨基酸序列显示含 3 个区域：N 端含
100 个氨基酸左右，无任何同源性，紧接着是一
个细胞色素b5相关区和一个与acyl-lipid desaturase
具有 27% 的较低同源性的 C 端。为阐明此蛋白的
功能，他们用2 kb的同源序列构建载体，即用一
段含有正向选择标记的序列插入此基因中间，并
替代中间一小段序列，线性 D N A 进行转化，使
此基因失活。随机选取 5 个转基因植株进行验
证。结果所有 5 个个体都把基因整合进相应的基
因组座位上，并且在转基因个体中脂肪酸合成模
式发生剧烈改变，亚油酸、g- 亚麻酸和花生四烯
酸含量大大提高。从而证实新的 cDNA 编码的是
D6-不饱和脱氢酶。这说明可以用小立碗藓对其目
标基因进行敲除破坏，从而发现新的植物基因，
并用以阐述某些代谢物质的新生化途径。
由腺苷-5′- 磷酸硫酸酐还原酶(APR)催化将
腺苷-5′-磷酸硫酸酐(adenosine- 5 ′-phosphosulfate,
APS)还原成亚硫酸盐的途径是高等植物硫酸盐同
化的关键步骤。但类似于肠细菌，由3′- 磷酸腺
苷- 5′-磷酸硫酸(3′-phosphoadenosine adenosine -5′-
phosphosulfate, PAPS)介导的硫酸盐还原作用也有
人提出过。而在植物中是否也存在此途径，目前
仍不十分清楚。为证实是否存在此种硫酸盐的同
化途径，2002年 Koprivova等[17]在小立碗藓中将
图1 小立碗藓转化中常用的载体设计[8]
A.插入型载体。将选择标记放在目的基因的一端，可以单拷贝或者多拷贝形式通过同源重组整合入基因组。B.替代型载体。将
选择标记放在目的基因中间，能够对目的基因进行点突变和精细打靶。灰色部分为目的基因，黑色部分为选择标记。
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APR 基因敲除，即用抗性标记基因插入基因编码
区，并替代其中一小部分序列之后，进行线性转
化。由于 APR 基因在小立碗藓中以单拷贝存在，
因此，如果小立碗藓只存在此种硫酸盐的同化途
径的话，那么，APR 基因的失活即会使得植株中
不出现硫醇或者其含量大大降低。但是他们却惊
奇地发现转基因个体中硫醇的含量与野生个体没有
任何差异，说明在小立碗藓中存在3′-磷酸腺苷-
5′-磷酸硫酸还原酶基因。这也是首次在植物中从
分子水平上证实有3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸还原
酶基因的存在，同时小立碗藓也是第一个被证实
同时存在相互独立的腺苷-5′-磷酸硫酸酐(APS)和
3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸 (PAPS) 两个硫酸盐消
化吸收途径的植物。这说明用基因敲出的方法可
以发现某些单个基因的互补生化途径。
大基因家族如蛋白质二硫异构酶(protein disul-
fide isomerase, PDI)类似蛋白基因家族在同一基因
组中具有很高的同源性和多样性，运用反向遗传
学的方法研究某一基因功能时，往往由于基因的
多样性很难对目标基因进行精确打靶，而序列间
高的同源性又会导致某些特异基因特殊位点的突变
被其他表型所掩盖。小立碗藓由于具有相当高的
同源重组频率，用基因打靶技术能够对基因进行
精确打靶。2002年 Meiri等[18]以 PCR为基础在小
立碗藓中得到3个 PDI类似蛋白: PDI-H、PDI-M、
PDI-L。与绿藻(Chlamydomonas reinhardtii)叶绿
体 RB60 蛋白分别具有 57%、60%、53% 的相似
性。PDI-H、PDI-M 蛋白都具有典型的 PDI 类似
蛋白的保守N和 C端氧化还原激活位点，而PDI-
L在C端的氧化还原位点具有一个短的内含子。但
是它们的具体功能还不十分清楚，推测可能起内
质网定位信号的作用。为了解基因的功能，他们
用约1 kb的基因组DNA和由 35S启动子启动的新
霉素磷酸转移酶基因(neo)构建基因敲除载体，对
此3个基因进行了敲除。即在此3个基因的中间插
入neo 基因，然后用 PCR 方法扩增到含有插入抗
性基因的 PDI 类似蛋白基因，纯化之后，线性转
化小立碗藓原生质体，得到 3 种突变株。但是突
变株在正常生长条件下与野生株基本一致，说明
在此蛋白家族中可能存在某些蛋白能够在功能上进
行互补。初步研究认为与野生株相比，突变株在
生长方面要稍微迟缓一些，进一步工作仍在进行
当中。但不管将来结果如何，利用小立碗藓有效
的同源重组进行基因敲除的方法将有助于解决那些
由于大基因家族相似性和多样性而给分析单个基因
的功能带来的巨大问题。
基因打靶技术在小立碗藓中具有如此高的成
功率可能与以下3方面有关系：(1)与小立碗藓以
单倍配子体占据主要世代有关。单倍体细胞不存
在严格的可在等位基因序列间阻止重组发生的机
制。当转化 D N A 与个体本身存在同源序列时，
就可以通过同源重组而将其导入相应位点[13,19]。
(2)与实验所选材料有关。大多数实验室用来进
行基因打靶的材料都是选取生长 1个星期左右的
原生质体。此时材料幼嫩，生长旺盛，只含有
1种主要处于 G2/M 期的细胞类型(chloronema)。
而随着培养时间的延长植株体内将出现第二种主
要含有 G1/S 期的细胞类型茎丝体(caulonema)，
如 额 外 施 加 酒 石 酸 氨 将 使 小 立 碗 藓 保 持
chloronema 状态和处于 G2/M 期，但外施生长素
或细胞分裂素将使caulonema 细胞增加，减少处
于 G 2 / M 期的细胞数量。另外，植物生长调节
因子能提高核内染色等倍数化。因此，认为细
胞周期和细胞分化在小立碗藓中是紧密相连的，
并推测这种独特的组织特异性细胞周期可能是小
立碗藓核 DNA 具有如此高的同源重组频率的原
因[9,15,19]。 (3)在芽殖酵母中，通过广泛的遗传和
生化研究认为有效的基因打靶技术与 DNA 双链断
裂修复机制相关。但迄今尚未得到一个在转化过
程中可以特异改变随机整合频率的突变株[2 0 ]。
2001年，Brun等[21]在小立碗藓中首次报告存在错
配修复基因MSH-2(MutS homologues)，并认为可
能与 DNA 的修复及重组有关。其可能作用是在发
生同源重组时阻止异源序列之间发生重组。2002
年，Markmann-Mulish等[22]发现RAD51(resistance
to ionizing radiation)基因使得人们对小立碗藓的
同源重组机制的认识更进了一层。一般认为有内
含子是 RAD51 基因的显著特征，内含子具调控
作用[23]。而在小立碗藓中发现的2个 RAD51 基因
都不具有内含子。这也可能就是小立碗藓的同源
重组机制与其他真核生物不同之所在，对此仍需
进一步证明。
3 结语
作为遗传模式植物的小立碗藓，除了有极高
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的同源重组频率以外，它自身还有许多特点，
如：基因组较小，生活周期不长，个体小，以
及有与其他陆生植物相似的结构和功能特征等。
因此用小立碗藓为材料研究生物学系统进化和遗传
进化很有意义，小立碗藓的有效基因打靶技术是
研究植物基因精确功能的新的技术平台。用它可
以研究复杂的发育过程，如器官形成或者建立特
定基因缺失突变株[2]。相信今后有“绿色酵母”
之称的小立碗藓可能成为研究真核多细胞生物功能
基因组学的主要工具[1]。
参考文献
1 Schaefer DG. Gene targeting in Physcomitrella patens.Curr Opin
Plant Biol,2001,4:143~150
2 Schaefer DG. A new moss genetics:targeted mutagenesis in
Physcomitrella patens.Annu Rev Plant Biol,2002,53:477~501
3 Paszkowski J,Baur M,Bogucki A et al. Gene targeting in plants.
EMBO J,1988,7:4021~4026
4 Lee KY,Lund P,Lowe K et al. Homologous recombination in
plant cells after Agrobacterium-mediated transformation.Plant
Cell,1990,2:415~425
5 Vergunst AC,Hooykaas PJJ. Recomibination in the plant genome
and its application in biotechnology.Crit Rev Plant Sci,1999,
18:1~31
6 Heckman DS,Geiser DM,Eidell BR et al. Molecular evidence for
the early colonization of land by fungi and plant.Science,2001,
293:1129~1133
7 Kenrick P,Crane P. The origin and early evolution of plant on
land.Nature,1997,389:33~39
8 Schaefer DG,Zryd JP. The moss Physcomitrella patens,now and
then.Plant Physiol,2001,127:1430~1438
9 Schween G,Gorr G,Hohe A et al.Unique tisse-specific cell cycle
in Physcomitrella patens.Plant Biol,2003,5:1~9
10 Reski R. Physcomitrella and Arabidopsis:the david and goliath
of reverse genetics.Trends Plant Sci,1998,3:209~210
11 Reski R. Molecular genetics of Physcomitrella.Planta,1999,208:
301~309
12 Reski R,Faust M,Wang XH et al. Genome analysis of the moss
Physcomitrella patens.Mol Gen Genet,1994,244:352~359
13 Schaefer DG, Zryd JP. Efficient gene targeting in the moss
Physcomitrella patens. Plant J,1997,11:1195~1206
14 Osteryoung KW,Vierling E. Conserved cell and organelle
division.Nature,1995,376:473~474
15 Strepp R,Scholz S,Kruse S et al. Plant nuclear gene knockout
reveals a role in plastid division for the homolog of the bacterial
cell division protein FtsZ,an ancestral tubulin.Proc Natl Acad
Sci USA,1998,95:4368~4373
16 Girke T, Schmidt H, Zahringer U et al. Identification of a novel
D6-acyl-group desaturase by targeted gene disruption in
Physcomitrella patens.Plant J,1998,15:39~48
17 Koprivova A,Meyer AJ,Schween G et al. Functional knockout of
the adenosine 5′-phosphosulfate reductase gene in Physcomitrella
patens revives an old route of sulfate assimilation. J Biol Chem,
2002,277:32195~32201
18 Meiri E,Levitan A,Guo F et al. Characteration of three PDI-like
genes in Physcomitrella patens and construction of knock-out
mutants.Mol Genet Genomics,2002,267:231~240
19 Hohe A,Reski R.A tool for understanding homologous
recomibination in plants.Plant Cell Rep,2003,21:1135~1142
20 Paques F,Haber JE. Multiple pathways of recombination induced
by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae.Microb
Mol Biol Rev,1999,63:349~404
21 Brun F,Gonneau M,Doutriaux MP et al. Cloning of the PpMSH-
2 cDNA of Physcomitrella patens,a moss in which gene target-
ing by homologous recombination occurs at high frequency.
Biochimie,2001,83:1003~1008
22 Markmann-Mulish U,Hadi MZ,Kerstin KC et al. The organiza-
tion of Physcomitrella patens RAD51 genes is unique among
eukaryotic organisms.Proc Natl Acad Sci USA,2002,99:
2959~2964
23 Hartung F,Puchta H. Molecular characterization of homologues
of both subunits A(SPO11) and B of the archaebacterial
topoisomerase 6 in plants.Gene,2001,271:81~86