全 文 ：书山 东 农 业 科 学 2011，9:1 ～ 6 Shandong Agricultural Sciences
收稿日期:2010 －03 －15;修回日期:2011 －07 －12
基金项目:国家自然科学基金项目(30671177)、山东省优秀中青年科学家科研奖励基金项目(2006BS06001)、山东省农业科学院博
士基金项目(2006 － 2009)资助。
* 同等第一作者:王凤德(1979 －) ，男，博士后，研究方向为植物分子生物学。叶 帅(1981 －) ，男，硕士研究生，研究方向为植物分
子遗传学。
＊＊通讯作者，E － mail:jianweigao3@ yahoo. com
小立碗藓细胞色素 P450 基因 CYP73A49
的克隆与功能分析
王凤德1* ，叶 帅1，2* ，王 保1，李利斌1，王淑芬1，朱正歌2，高建伟1＊＊
(1. 山东省农业科学院蔬菜研究所 /山东省设施蔬菜生物学重点实验室 /国家蔬菜改良中心山东分中心，
山东 济南 250100;2. 河北师范大学生命科学学院，河北 石家庄 050016)
摘 要:本研究克隆了一个小立碗藓(Physcomitrella patens)P450 基因 CYP73A49，其 cDNA全长 1 629 bp，
预测编码 542 个氨基酸。为了进一步研究其生物学功能，利用同源重组技术对 CYP73A49 基因实施定点突
变，成功构建了能诱导其功能缺失的载体，并获得了苔藓的功能缺失突变体。
关键词:小立碗藓(Physcomitrella patens) ;细胞色素 P450;CYP73A49
中图分类号:Q785 文献标识号:A 文章编号:1001 －4942(2011)09 －0001 －06
Cloning and Functional Analysis of Cytochrome P450 Gene
CYP73A49 in Moss Physcomitrella patens
WANG Feng － de1* ，YE Shuai1，2* ，WANG Bao1，LI Li － bin1，
WANG Shu － fen1，ZHU Zheng － ge2，GAO Jian － wei1＊＊
(1． Institute of Vegetables，Shandong Academy of Agricultural Sciences /Shandong Key Laboratory of
Greenhouse Vegetable Biology /Shandong Branch of National Vegetable Center，Jinan 250100，China;
2． College of Life Science，Hebei Normal University ，Shijiazhuang 050016，China)
Abstract The cytochrome P450 gene CYP73A49 in the moss Physcomitrella patens was isolated in this
paper． The full length cDNA of CYP73A49 gene was 1 629 bp and predicted to encode a 542 － amino acid pol-
ypeptide． For further study of the function of CYP73A49 gene，the loss － of － function vectors were constructed
successfully by homologous recombination． After transformation with these vectors，some transgenic moss mu-
tant lines of CYP73A49 were obtained．
Key words Physcomtrella patens;Cytochrome P450;CYP73A49
细胞色素 P450 酶系是一类广泛分布于生物
体内、分子量约为 45 ～ 62 ku、含血红素的氧化还
原酶类。到目前为止，细胞色素 P450 超家族已发
现 480 多个成员，分属 74 个家族，而且不断有新
家族、新成员被发现［1］。仅拟南芥中就有 45 个
P450 家族，包括 273 个不同的 P450 基因。尽管
P450 基因及其家族不同，但各类 P450 蛋白的三
维结构具有保守性［2，3］。例如，最保守的序列是
靠近 C末端的一段 Phe － xx － Gly － x － Arg － x －
Cys － Gly序列，其中半胱氨酸(Cys)的 － SH 基团
可与血红素共价结合，而整个 P450 则通过 N 末
端和内质网、线粒体、质体及高尔基体等细胞器相
结合［3］。
各种 P450 催化的反应广泛而复杂［3］。包括
DOI:10.14083/j.issn.1001-4942.2011.09.001
羟基的氧化，氮位的羟化及氧化，烷基的羟化，烯
基的环氧化，硫位的氧化，氧化性的碳碳键断裂及
一些还原反应等。目前，许多细胞色素 P450 基因
已被鉴定和克隆，并在转基因培育多抗性植物、提
高植物降解残留化学农药等污染物的能力、创造
植物雄性不育系以及有效生产具有药用价值的化
合物等方面取得可喜进展。随着对 P450 蛋白组
成及结构等生化特征的阐明日益全面，目前关于
细胞色素 P450 的研究更多地集中在它所参与的
生物体内代谢途径及催化机制。P450 催化的代
谢途径可产生一些重要的次生代谢物，使植物抵
抗病虫害及逆境胁迫［4］。而且，由细胞色素 P450
催化所合成的异黄酮类物质对人类预防癌症及心
血管疾病有较好作用［5］。
小立碗藓(Physcomitrella patens)是目前发现
的唯一具有高频率同源重组特性的植物［6］。由
于其具有生命周期短、易于培养、个体小、易于转
化(PEG介导的原生质体转化)、具有很强的再生
能力等特点，目前已成为研究植物代谢和发育的
理想模式系统。
已有研究表明，苔藓中有 71 个 P450 成员，与
其它植物，如番茄、拟南芥、水稻等相比，它们的氨
基酸序列同源性并不高［7］，从而推测其 P450 不
同成员参与的生化反应在功能上也存在一定程度
的差异。本研究首先从小立碗藓中克隆了一个细
胞色素 P450 基因 CYP73A49，然后利用同源重组
技术对其实施定点突变，并转化小立碗藓。这为
弄清 CYP73A49 基因的生物学功能奠定了基础。
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂
小立碗藓(Physcomitrella patens)由德国 Ralf
Reski 教授惠赠。
大肠杆菌菌种(DH5α)购自山东济南朋远公
司;连有 GFP的 PJIT163 质粒由本实验室王保提
供;BioFlux 胶回收试剂盒(3S Spin DNA Agarose
Gel Purification Kit)购自山东济南朋远公司;Taq
酶、EX Taq 酶、T4 DNA 连接酶、限制性内切酶、
dNTP 购自 TaKaRa 公司;pGEM － T easy vector
System购自美国 Promega 公司;引物由北京博尚
生物技术有限公司合成;Trizol 购自 Invitrogen 公
司;反转录试剂盒(First － Strand cDNA Synthesis
Kit)购自上海申能博彩生物科技有限公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 CYP73A49 的全长 cDNA编码序列的克隆
利用 Trizol法提取小立碗藓总 RNA，采用上海
申能博彩生物科技有限公司的反转录试剂盒反转
录合成 cDNA 第一条链。通过 NCBI(http:/ /
www. ncbi. nlm. nih. gov /)公布的苔藓细胞色素
P450 的 EST库，拼接出 CYP73A49 的 5端和 3端
contig，设计特异性引物分别为 P73A49F (5 －
GGACACGAAGCCAGGGTTTAC － 3)和 P73A49R
(5 － AGTCCACATTGCGCTTGAGCTTA － 3)。以
小立碗藓反转录产物为模板进行 PCR扩增。
1. 2. 2 CYP73A49 基因组 DNA 的克隆 小立碗
藓基因组 DNA提取参照 Kajia 和 Ralf 的方法［8］。
CYP73A49 的特异性引物同 1. 2. 1。以小立碗藓
基因组 DNA为模板进行 PCR扩增。
1. 2. 3 功能缺失载体的构建 根据基因组克隆
结果，找出外显子区域及内含子区域，确定打靶位
点(定向打靶位点应在外显子区域) ;而后确定用
于构建基因敲除载体(在 pCAMBIA － 1301 质粒
载体基础上进行改进)的 5端同源序列 DNA 片
段、3端同源序列 DNA 片段(两个片段长度均约
为 500 bp，分别被命名为Ⅰ片段和Ⅱ片段)。在
基因敲除载体中，5端、3端同源序列之间是 35S
启动子以及新霉素磷酸转移酶基因(neo)。
Ⅰ片段 CYP73A49 － F1:5 － GGTTGATAAT-
GCAGCGGTGTCGAGTT －3;
Ⅰ片段 CYP73A49 － R1:5 － CCATGGTGAGA-
CATCTCAGCCAAGTT －3 ，划线处为 NcoⅠ酶切位
点;
Ⅱ片段 CYP73A49 － F2:5 － GTCGACGAAG-
TATGGCGATGTGGTTT － 3，划线处为 SalⅠ酶切
位点;
Ⅱ片段 CYP73A49 － R2:5 － GCAACACGGG-
GATGAAGTCACCATA －3。
1. 2. 4 小立碗藓转化(PEG 介导的原生质体转
化) 小立碗藓培养及保存方法参照德国 Ralf
Reski 实验室的方法(htttp:/ /www. plant － bio-
tech. net /)。小立碗藓原生质体再生体系的建立
及基因敲除转化体检测的 PCR 技术，参照 Meiri
等［9］的方法。
2 山 东 农 业 科 学 2011 年
2 结果与分析
2. 1 细胞色素 P450 基因 CYP73A49 cDNA 编码
序列的克隆与分析
经 PCR扩增，得到一个全长为 1 629 bp、预测
编码 542 个氨基酸的序列(图 1)。对其结构域的
分析发现该基因含有保守的 P450 结构域(图 2) ，
表明该序列即为目的序列。
图 1 苔藓 CYP73A49 全长 cDNA编码序列及预测的氨基酸序列
图 2 苔藓细胞色素 CYP73A49 蛋白保守的结构域
进一步的分析发现，苔藓 CYP73A49 编码的
氨基酸序列与拟南芥、水稻、小麦的同源序列相似
性分别为 65%、61%、60%(图 3) ，说明植物细胞
色素 P450 在进化过程中保守性比较高。利用网
上 预 测 软 件 SignalP 3. 0 Server (http:/ /
www. cbs. dtu. dk /services /SignalP /)分析发现苔
藓 CYP73A49 编码的氨基酸序列 N －端的 23 － 24
氨基酸残基之间是一个信号肽剪切位点，其编码
的蛋白 N －端比其他物种多了 37 个氨基酸残基，
3第 9 期 王凤德等:小立碗藓细胞色素 P450 基因 CYP73A49 的克隆与功能分析
可能是一个信号肽，但具体定位到何处有待于进 一步研究。
图 3 几种生物 CYP73A49 同源蛋白之间的多重序列比对
2. 2 细胞色素 P450 基因组 DNA 的克隆及启动
子分析
图 4 结果显示，CYP73A49 扩增出 1 992 bp的
含有完整阅读框的 DNA片段。
根据本试验克隆得到的 CYP73A49 基因组序
列，通过 NCBI找到了 CYP73A49 的启动子序列。
图 4 PCR扩增 CYP73A49
分析发现，该序列含有 2 个“ACCTA”序列和一个
“CACGTA”序列。而这两个序列都是一些顺式作
用元件的核心序列，如许多参与苯丙烷类物质代
谢途径的启动子元件即 AC －Ⅰ、AC －Ⅲ、box 1、
box 2 和 box L 元件中都含有“ACCTA”序列，而
“CACGTA”序列则与光诱导相关的 G － box 核心
序列“CACGTG”极为类似。
2. 3 CYP73A49 功能缺失载体的 PCR 检测及酶
切鉴定
分别用Ⅰ片段两个引物、Ⅱ片段两个引物以
及Ⅰ片段 5端引物 /Ⅱ片段 3端引物进行 PCR扩
增，结果如图 5。分别以 NcoⅠ、SalⅠ单酶切，结
果如图 6。PCR检测和酶切鉴定结果表明载体构
建成功，可以用于下一步的苔藓转化。
4 山 东 农 业 科 学 2011 年
图 5 功能缺失载体的 PCR鉴定
图 6 功能缺失载体的酶切鉴定
2. 4 CYP73A49 功能缺失载体在原核生物中的验
证
将构建好的 CYP73A49 功能缺失载体转化大
肠杆菌，转化菌株在含有 50 mg /L卡那霉素的 LB
培养基上能正常生长，而对照菌不能生长，说明构
建载体中的抗卡那霉素基因(Hpt)能在大肠杆菌
中表达(图 7) ，表明载体构建成功。
图 7 CYP73A49 功能缺失载体原核表达鉴定
2. 5 转基因小立碗藓的 PCR鉴定
随机选取 7 株在选择性培养基上筛选出来的
CYP73A49 基因功能缺失的小立碗藓植株，分别
提取其 DNA 以及野生型小立碗藓 DNA。野生型
与转基因植株照片如图 8、图 9。分别以筛选出的
小立碗藓 DNA、构建的功能缺失载体质粒、野生
型小立碗藓 DNA 为模板，用 Hpt 基因引物做
PCR。结果如图 10，其中 1 ～ 7 号为转基因植株，
但是 3、7 号植株未扩出目的片段，是假阳性植株;
8 号为野生型对照，9 号为构建的质粒载体对照。
图 8 野生型小立碗藓植株
图 9 转基因小立碗藓植株
图 10 转基因(CYP73A49 功能缺失小藓)的 PCR鉴定
3 结论与讨论
细胞色素 P450 广泛存在于动植物及微生物
体内，是一类具有混合功能含血红素的氧化还原
酶，参与多种生化反应，可通过还原、氧化及水解
等作用代谢多种化合物。目前已发现的 P450 成
员，低等的衣藻中有 39 个，苔藓中有 71 个，水稻
中有 356 个，拟南芥中有 246 个，杨树中有 312
个［7］，可以看出:细胞色素 P450 在整个植物进化
过程中数目不断增加。苔藓在进化上高于藻类和
低等的衣藻，而低于蕨类和种子植物，研究苔藓细
胞色素 P450 可以鉴定 P450 古老的起源问题及其
在进化过程中所起的作用。
本课题组利用 PCR 扩增从小立碗藓中克隆
到了一个细胞色素 P450 基因 CYP73A49。利用生
物学分析软件和 Internet 网络资源对其测序结果
进行分析发现，CYP73A49 属于 CYP71 族的
5第 9 期 王凤德等:小立碗藓细胞色素 P450 基因 CYP73A49 的克隆与功能分析
CYP73 亚族。对 CYP73A49 启动子序列的分析发
现，该序列含有 2 个保守的“ACCTA”序列，许多
参与苯丙烷类物质代谢途径的启动子中的元件也
含有此序列［10 ～ 12］。另外，拟南芥中编码 C4H 的
基因启动子中，接近 C4H 转录起始位点的含有
“ACCTA”序列的元件包含有“CACGTA”序列，而
在 CYP73A49 的启动子序列中也发现了该序列。
“CACGTA”序列与 G － box 序列“CACGTG”很相
似，“CACGTG”早已在一些光诱导相关启动子中
得到了鉴定［13］。
同源比对分析结果表明，小立碗藓 CYP73A49
编码的氨基酸序列与拟南芥、水稻、小麦的同源序
列相似性分别为 65%、61%、60%，说明植物细胞
色素 P450 在进化过程中保守性比较高。而这种
进化上的保守性可能表明它们在生物学功能上也
具有一定程度的类似。因此，我们推测小立碗藓
CYP73A49 基因编码的蛋白可能具有桂皮酸盐 －
4 －羟化酶(C4H)活性，也参与催化苯丙烷类物质
代谢途径中许多生化反应。为了进一步验证我们
的推测，利用基因打靶技术将 CYP73A49 基因敲
除，得到了小立碗藓的 CYP73A49 功能缺失突变
体，但没有发现明显的表型变化。下一步我们将
对筛选得到的 CYP73A49 功能突变体做进一步的
检测，验证 CYP73A49 的功能。
参 考 文 献:
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6 山 东 农 业 科 学 2011 年