全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 5期，2007年 10月 917
激光显微切割植物细胞的研究新趋势
张栋，唐威华 *
中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所，上海 200032
Trends in Laser Microdissection of Plant Cells
ZHANG Dong, TANG Wei-Hua*
Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai
200032, China
提要：2006年以来，激光显微切割技术(LM)逐渐发展成为植物及植物 -微生物互作领域的常用技术。从激光技术方面，
激光捕获显微切割(LCM)和激光显微切割及压力弹射(LMPC)成为两大主流技术。在材料准备方面，改良的石蜡包埋切片
技术在植物成熟组织切割中应用日益广泛，而冰冻包埋切片则在幼嫩组织切割中十分有效。激光显微切割所得样品主要
仍用于RNA水平的基因表达分析，而且能从全基因组规模上深度分析基因表达谱。此外，对激光显微切割所得细胞进行
小分子代谢物的分析也取得了实质性成果。总之，激光显微切割技术作为从复杂背景中直接分离特定细胞(群)的一种有效
工具，在植物分子生物学研究中的应用已经成熟，正为提高植物研究的精准度做出贡献。
关键词：激光捕获显微切割；激光显微切割及压力弹射；样品准备；固定剂
收稿 2007-08-20
资助 国家“9 7 3”计划( 2 0 0 6 C B1 0 1 9 0 1 )。
* 通讯作者(E-mai l：whtang@sippe.a c.cn；Tel：02 1-
5 4 9 2 4 0 7 2 )。
激光显微切割(laser microdissection，LM或
LMD)是显微观察和分子生物学研究之间的桥梁。
它将在显微镜下观察到的目标细胞直接用激光取
出，从而与旁邻的其他细胞分开，并且可以将目
标细胞放入试管中进行分子生物学的分析研究。
利用激光分离细胞的研究开始得较早(例如
Berns等 1981)，但是直到 1996年基于近红外激光
熔膜原理的激光捕获显微切割( l a s e r c a p t ur e
microdissection，LCM)成功应用于动物细胞的切
割和DNA、RNA分析(Emmert-Buck等 1996)后，
这一技术才在生物研究中迅速发展并被广泛应用。
而在植物研究中的成功应用，则又滞后了 6 年
(Asano等 2002；Nakazono等 2003)。2003~2005
年间，激光显微切割技术在植物研究中的应用逐
渐发展，越来越受重视(聂玉哲等 2006；蔡民华
等 2006；Nelson等 2006)。本文结合本研究组的
实际经验，针对自 2006年以来激光显微切割在植
物研究中应用的新趋势进行介绍。
1 激光捕获显微切割和激光显微切割及压力弹射
(laser microdissection and pressure catapulting，
LMPC)两大主流技术
从激光类型和技术原理上分，目前主要存在
基于近红外激光(810 nm波长)的激光捕获显微切割
(以Arcturus PixCell系列为代表)和基于紫外激光
(337~355 nm波长)的激光显微切割及压力弹射(以
Zeiss PALM和 Leica LMD系列为代表)两种。两
种技术各有优缺点(表 1)，以往由于激光捕获显微
切割的近红外激光具有对DNA、RNA分子基本无
损伤、收集稳定等优点，被大多数实验室采用
(Nakazono等 2003)。近年来，紫外激光对DNA、
RNA损伤的顾虑通过实践被逐渐消除，例如Tang
等(2006)研究中显示采用PALM公司激光显微切割
及压力弹射得到 RNA样品仍具有良好的完整度。
而且紫外激光的精准度高、切割速度快等优点逐
渐显示出来，因此采用激光显微切割及压力弹射
的实验室逐渐增多。目前，两种技术均有多个成
功应用于植物研究的报道(表 1)。Arcturus公司近
年还推出了同时采用紫外激光切割和近红外激光捕
获的新机型Veritas，它不仅保留了 PixCell系列激
光捕获显微切割的优点，还克服了原有的切割速
度慢的缺点。例如，本研究组就用 A r c t u r u s
Veritas成功分离小麦胚芽鞘的单细胞(图 1)。预计
将来这两种技术仍是激光显微切割用于植物研究领
域的两大主流技术。
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2 样品准备趋于标准化
样品准备包括固定、包埋、切片等步骤，激
光显微切割对样品准备有特殊的要求，既要保持
其细胞学形态，又要保证其中的RNA等生物分子
的完整度。样品准备一度曾是阻碍激光显微切割
在植物研究中推广应用的瓶颈。通过各实验室的
技术改良与经验，以丙酮或乙醇:乙酸(3:1)混合液
等沉淀型固定剂的石蜡包埋、切片技术已经成为
标准化方法(例如Kerk等2003；Balestrini等2007)，
普遍适用于各类植物、各种组织，尤其是成熟组
织细胞的制片。而对于幼嫩的植物组织，如胚
等，冰冻切片仍是十分有效的(Spencer等 2007)。
几个小的技术改进使石蜡制片成功地广泛应用于植
物研究，首先采用微波辅助缩短了制片时间，显
著提高了RNA的完整度(Inada和Wildermuth 2005) ；
其次石蜡切片转移系统应用于乙醇固定的样品避免
了复水带来的 RNA降解的问题(Cai和 Lashbrook
2006) ；另外，真空渗透提高了固定效率(参见
http://maize-meristems.plantgenomics.iastate.edu/re-
sources/protocols/网页中 Paraffin Sectioning for
LCM)。最后值得一提的是，丙酮固定材料能在
一定程度上保持荧光蛋白的荧光活力，为辨别切
割目标提供了便利(Tang等 2006)。
由于石蜡切片的技术含量要求比冰冻切片
低，而且切片机器也比较廉价，同时石蜡切片对
细胞组织形态的保存度较高，便于识别，所以用
石蜡制片进行激光显微切割的样品准备已成为一项
常规操作。
3 激光显微切割得到的植物细胞可以用于RNA、
DNA和代谢物分析
2006年以来，激光显微切割在植物研究中的
应用明显增加，主要仍以供 RNA分析为主。用
定量RT-PCR等方法检测激光显微切割得到的细胞
中个别基因的表达已经成为原位杂交方法的一个替
代选项或补充(Raab等 2006；Wu等 2006；Jiang
图 1 激光显微切割单个的小麦胚芽鞘表皮细胞
　　样品经丙酮固定、石蜡包埋和切片后，采用 A r c t u r u s
V e r i t a s 进行激光捕获显微切割。具体样品准备方法见文献
(Tang等 2006)。Scale bar=50 µm。
表 1 激光显微切割系统技术比较

技术体系 代表机型 　 激光类型(波长) 对 RNA完整度的影响 分离、收集细胞方式 目标细胞 旁邻细胞
收集率 污染度
激光显微切割 Zeiss PALM 紫外激光(337~340 nm) 基本无损伤 紫外激光切割及紫外激光 中等 轻度
及压力弹射 弹射(向上)
Leica LMD 紫外激光(355 nm) 基本无损伤 紫外激光切割及重力 +紫 中等 中度
外激光弹射(向下)
激光捕获 Arcturus PixCell 近红外激光(810 nm) 无损伤 近红外激光熔膜粘附捕获 高 中度
显微切割 Arcturus Veritas 近红外激光(81 0 nm)、 基本无损伤 紫外激光切割、近红外激 高 轻度
紫外激光(349 nm) 光熔膜粘附捕获

技术体系 代表机型
分离精度 * 细胞分离 对制片 植物研究应用论文数
**
显微镜 是否适用于
收集速度 要求 装置 活细胞分离
40×物镜 100×物镜 RNA 代谢物
激光显微切割 Zeiss PALM 1 µm (紫外) 1 µm (紫外) 快 一般 8 3 倒置 是
及压力弹射 Leica LMD 2 µm (紫外) 1 µm (紫外) 快 一般 3 2 正置 是
激光捕获 Arcturus PixCell 5 µm (红外) 5 µm (红外) 慢 很高 8 0 倒置 不了解
显微切割 ArcturusVeritas 5 µm (红外)、 5 µm (红外)、 快 很高 新型号尚 新型号尚 倒置 不了解
1 µm (紫外) 1 µm (紫外) 未有报道 未有报道
　　*以激光最小直径来衡量，光径越小，精度越高。**截至 2 0 0 7 年 6 月的不完全统计(Pu bmed)，植物及植物 - 微生物互作领域
采用激光显微切割发表研究论文总数 3 0 篇，其中用于 R N A 分析 2 1 篇，用于代谢物分析 5 篇。
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等 2006；Corpas等 2006；Henderson等 2006；
Yu等 2007；Ohkama-Ohtsu等 2007；Balestrini等
2007)。例如，Raab等(2006)在报道草莓芳香分
子合成途径中关键酶之一FaQR是一个烯酮氧化还
原酶一文中，采用激光显微切割证实了 FaQR基
因在草莓果实皮质细胞中表达。对于激光显微切
割得到的细胞进行全基因组规模的表达谱分析目前
也有了更多的成功报道(Cai和 Lashbrook 2006；
Tang等 2006；Spencer等 2007；Zhang等 2007；
Ithal等 2007)。Zhang等(2007)报道将激光显微切
割与芯片分析结合使用，比较了野生型玉米和
Narrow Sheath突变型的茎尖分生组织和叶原基中
的表达谱，并确定出了为数不多的几个基因的表
达存在差异，从而揭示出Wox类基因和部分专一
的激素信号途径可能决定了玉米早期叶的发育。
Singh和 Bhalla (2006)还指出，植物干细胞发育研
究常常受困于无法了解某一两个关键细胞中的特异
性事件，激光显微切割技术的应用可以直接取到
这些关键的干细胞，将大大促进植物干细胞的研
究向深度和广度发展。
对于用激光显微切割所得的少量细胞，能够
进行芯片分析得益于微量 RNA抽提和高保真的
RNA扩增两项技术。目前最常用的 PicoPure试剂
盒抽提激光显微切割所得微量细胞的RNA效果较
好，而Epicentre的RNA线性扩增试剂盒能够将低
于 1 ng的总RNA作为起始材料特异性扩增 100万
倍，足以进行芯片分析，而且其保真度达到约
80% (Tang等 2006)。对于用交联型固定剂(如福
尔马林等)准备的样品，以往由于其在保持RNA完
整度方面表现极差而无法用于RNA分析。Arcturus
公司新推出的ParadiseTM RNA抽提试剂盒可以显著
提高从该类样品中抽提出的RNA的完整度，在动
物研究中已有成功应用(Ma等 2004)，预期可能也
适用于植物材料。
对于没有全基因组序列信息的植物对象，无
法进行全基因组芯片分析，但是也能用 454测序
进行表达谱分析(Emrich等 2007)。
由于DNA分子比 RNA分子稳定性好，用于
DNA分析的激光显微切割的样品准备比较容易。
已有多个报道成功应用激光显微切割分离植物染色
体(Liu等 2004；Hobza 和 Vyskot 2007)。例如，
Liu等(2004)采用激光显微切割技术分离到水稻第4
号染色体(单条)，然后通过加接头的 PCR扩增构
建成第 4号染色体专一性基因组文库。新近 Zeiss
PALM等发展出的光镊(MicroTweezer)系统，将可
能更适用于染色体或其他亚细胞结构、乃至活细
胞分离。
更为可喜的是，对于用激光显微切割所得到
的细胞进行代谢物分析也有了多个成功的报道
(Kajiyama等2006 ；Li等2007；Holscher和Schneider
2007；Angeles等 2006)。例如，Li等(2007)对激
光显微切割得到的挪威云杉(Norway spruce)树皮中
的石细胞，采用核磁共振(NMR)和质谱(MS)分析
揭示其代谢物中富含 2种酚类化合物，可能与抗
虫机制相关。目前用于代谢物分析的激光显微切
割的样品准备均采用不经固定直接冷冻包埋制冰冻
切片的方法，以避免由固定剂可能导致的化学污
染。虽然目前用于RNA分析和代谢物分析的激光
显微切割的样品准备方法有所不同，但是我们预
期随着进一步的技术改进，将来可能达到对激光
显微切割得到的同一样品可以分别进行RNA和代
谢物分析的目标。
总之，近年来激光显微切割技术的样品准备
趋于标准化，显微切割操作自动化，使这一技术
正成为植物研究者的常用工具。
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