全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 5期，2007年 10月 831
cDNA微阵列技术研究干旱胁迫下星星草基因的表达
梁也男，王玉成 *，刘桂丰， 延广
东北林业大学林木遗传育种实验室，哈尔滨 150040
提要：运用 cDNA微阵列技术研究干旱胁迫下星星草基因的表达。制备了载有 660条星星草单一基因的 cDNA微阵列。
分别对干旱胁迫和对照星星草的mRNA进行荧光标记，并与载有星星草基因的cDNA微阵列进行杂交，通过芯片的杂交
信号强度分析，共获得22个下调表达和17个上调表达的基因。BLASTX分析表明这些基因按功能可以分为脱水保护、信
号转导与调控、活性氧清除、代谢、核糖体蛋白等几大类。发现了一些与干旱胁迫相关的功能未知基因和新基因。
关键词：DNA微阵列；星星草；干旱胁迫；基因表达
Gene Expression in Puccinellia tenuiflora (Turcz.) Scribn. et Merr. under
Drought Stress Using cDNA Microarray
LIANG Ye-Nan, WANG Yu-Cheng*, LIU Gui-Feng, CHU Yan-Guang
The Laboratory of Forest Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: The gene expression pattern in Puccinellia tenuiflora under drought stress was investigated using
cDNA microarray. We constructed a cDNA microarray containing 660 unique genes from P. tenuiflora. The
mRNA from drought treatment and control sample labeled with fluorescence dyestuff was used for cDNA
microarray hybridization. Gene expression patterns in response to drought stress were studied through scan-
ning and analysis of cDNA microarray. Totally 22 down-regulated genes and 17 up-regulated genes were
identified under drought stress. BLASTX analysis showed that these differentially expressed genes involved in
the functional groups such as dehydration protection, signal transduction and regulation, reactive oxygen spe-
cies eliminated, metabolism. Among them, some function unknown genes and novel genes related to drought
stress were also found. This research revealed some important pathways involved in drought-resistance in P.
tenuiflora, and the gene expression profiles of P. tenuiflora after exposure to drought stress were constructed.
Key words: cDNA microarray; Puccinellia tenuiflora; drought stress; expression of genes
收稿 2007-06-13 修定 2007-09-04
资助 国家自然科学基金面上项目(30571509)和黑龙江省攻关
重点项目(GB06B303)。
* 通讯作者(E-mai l：Wa ngyu cheng1 0 2 9 @ 1 2 6 . co m；
T el：0 4 5 1 -8 2 1 9 1 6 2 7 )。
星星草为禾本科碱茅属多年生草本植物，根
系发达，有较强的抗旱和耐碱能力。在我国东
北、西北、华北均有分布，是优良的防风固沙
水土保持和盐碱地的绿化造林树种，是抗旱研究
的理想材料。另外，cDNA微阵列技术具有高通
量、快速、准确性高等优点，一次可研究大量
的基因表达，并可细微地观察其表达特征，由于
其有高组分高通量特点而在基因表达分析领域得到
广泛应用。植物抗旱和抗盐碱受多基因控制(Apse
和 Blumwald 2003；Haseqawa等 2000)，涉及大
量基因的表达。cDNA微阵列技术是研究植物抗
旱和抗盐碱的比较理想的技术。有人用 cDNA微
阵列技术研究拟南芥在脱水后再水合过程中(Oono
等 2003)以及渗透、盐、冷等胁迫下(Kreps 等
2002)的基因表达，Rabbani等(2003)又曾以之研究
冷、旱和盐胁迫下水稻基因的表达谱。本文以星
星草作为试材，用 cDNA微阵列技术研究干旱胁
迫前后星星草的基因差异表达，从而为深入研究
抗旱分子机制建立基础。
材料与方法
星星草[Puccinellia tenuiflora (Turcz.) Scribn.
et Merr.]在温室中培养，将其种子种在花盆中，
生长基质为沙和草炭土(2:1)。温室的温度控制在
24 ℃，平均光强为 400 µmol·m-2·s-1，相对湿度在
65%~75%之间，每天浇水，保证土壤水分充足。
以二月龄的星星草幼苗进行干旱胁迫。在上述培
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养条件下，将栽植星星草的土壤裸露于空气中，
用变色硅胶吸附土壤中水分，盆内土壤水分降到
相对含水率 32%左右，以土壤水分供应充足的材
料作为对照，处理 27 h后，取叶及嫩茎为试材。
引物、dNTP、Taq酶为宝生物工程(大连)有
限公司产品，RNA纯化试剂盒购自 QIAGEN公
司，逆转录酶(Superscript II)为 Invitrogen公司产
品，C y 3 / C y 5 荧光标记试剂盒为 A m e r s h a m
Pharmacia Biotech公司产品，其他试剂为国产分
析纯。
星星草 cDNA文库为本实验室构建(Wang等
2006)，从 cDNA文库所得的样品中挑选出 660条
单一基因(unique gene)作为靶基因，并用载体两端
的 T3、T7启动子序列作为引物对插入片段进行
PCR扩增。用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物质
量。将质检合格的 PCR产物加入异丙醇离心沉淀
后，用 75%乙醇洗涤沉淀，0.5 g·L-1 PCR产物溶
解于 3×SSC (15 mmol·L-1柠檬酸钠、0.45 mol·L-1
NaCl)溶液中，用Omni Grid点样仪(Majer Preci-
sion公司)将 660个靶基因、8个阴性对照基因和 8
个空白对照点样在硅烷化玻片上(上海博星公司)。
点样后的玻片经水合(2 h)和室温干燥(0.5 h)后紫外
交联(能量设定 6 5 mJ · cm- 1)，再分别用 0 . 2 %
SDS、水和 0.2% NaOH溶液处理 10 min，晾干
备用。共制备 2个相同的芯片(重复 1次)。
作探针标记时，于一已灭菌的1.5 mL Eppendorf
管内依次加入以下 RNase-free的试剂(反应终体积
为 50 µL) ：23 µL双蒸水、5 µL逆转录引物、
50 µg总 RNA，振荡混匀后，置于 70 ℃水浴中
10 min，取出后，迅速置于冰上。分别加入以
下试剂：10 µL 5×逆转录酶缓冲液、5 µL二硫
苏糖醇(DTT)、4 µL dNTP (10 mmol·L-1)，然后
转入暗室中加入以下试剂：2 µL逆转录酶、3 µL
Cy5-dCTP或 Cy3-dCTP，用手指弹打管壁以混匀
样品。将 Eppendorf管置于 42 ℃水浴中 2 h。依
次在Eppendorf管中加入4 µL标记试剂 I，置于65 ℃
水浴中 10 min后加入 4 µL标记试剂 II。混匀，
合并对照组、实验组。避光，真空抽干至 50 µL
左右。用 S-200 DNA纯化柱(Amersham Pharmacia
Biotech公司)纯化，以后向纯化后的含有探针的溶
液中加入 8 µL标记试剂 III，真空抽干。
芯片杂交和洗片时，将抽干的探针溶于 6.5
µL杂交试剂 I中，再加入杂交试剂 II，混匀。将
芯片放入 95 ℃预杂交液(已于 95 ℃变性 2 min)中
变性 30 s，室温下晾干。将探针与芯片分别在 95 ℃
水浴中变性 2 min和 30 s，将探针置于芯片上，
用盖玻片封片，于杂交箱中(42 ℃)杂交过夜 18 h。
杂交结束后揭开盖玻片，用 0.5%洗涤液 1冲洗玻
片，去除盖玻片，再将玻片依次在 0.5%洗片试
剂1+2%洗片试剂2、5%洗片试剂3中洗涤10 min，
最后用 0.5%洗涤液 1冲洗玻片，室温下晾干。
信号扫描用 G e n e r a l S c a n n i n g 公司的
ScanArray 4000扫描仪扫描芯片，获得芯片杂交
图像。用GenePixPro3.0软件分析扫描图，获得
每个基因点的 Cy3和 Cy5信号值，数据根据以下
原则进行均一化(normalization)处理：(1)该基因点
的 Cy3、Cy5信号值皆大于 200，或者其中之一
大于 800；(2)该基因点的 Cy5信号值 /Cy3信号值
的比值在 0.1~10之间。计算每个有效基因点 Cy5
信号值 /Cy3信号值的比值，求出其相应的自然对
数值 r=ln (Cy5/Cy3)，算出全部有效基因点 r值的
平均值 R，实验的均一化系数为 EXP(R)。将所
有基因点的 Cy3信号值乘上均一化系数，得出调
整后的 Cy3*。为了避免弱信号对实验结果的干
扰，将所有小于 200的 Cy3*值以 200取代。计
算每个基因点在本次实验中的表达差异值(Ratio)，
Ratio=Cy5/Cy3*。计算基因点的平均 Ratio值为 2
次杂交 Ratio值的平均值。2次实验结果一致，即
都有相同的上调或下调表达趋势，且程度相似，
其中 Ratio值都大于 2，说明该基因点有明显上调
表达，两次杂交的 Ratio值都小于 0.5，说明有明
显下调表达。
采用 Trizol试剂(Promega公司)提取星星草总
RNA，并用 DNase (Promega公司)消化，去除
DNA。取 5 µg总 RNA，加入 2 µL 10×RT缓冲
液、1 µL RNase Inhibitor、1.5 µL Oligo(dT) (10
mmol·L-1)、3 µL dNTP (10 mmol·L-1)、AMV反转
录酶 2 U，用水补足体积 20 µL进行逆转录。反
应程序为：25 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min。将逆转
录产物稀释 10倍，用作定量 RT-PCR模板。
实时定量RT-PCR反应试剂盒为SYBR Green
Realtime PCR Master Mix (Toyobo Co.，Ltd，
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Osaka，Japan)。反应体系为：2×SYBR Green
Realtime PCR Master Mix 10 µL、引物各0.3 µL (20
µmol·L-1)、水 6.9 µL、模板 2.5 µL。定量 PCR
反应条件为：94 ℃预变性 30 s，94 ℃ 12 s，58 ℃
30 s，72 ℃ 40 s，78.4 ℃读板 1 s，45个循环。
然后在荧光定量 PCR仪上完成 RT-PCR。用 α-
Tublin (CN487692)基因作为内参基因，各引物序
列见表 1。用 2-∆∆CT方法(Livak和 Schmittgen 2001)
表 1 荧光定量 PCR所用引物序列
Table 1 Primer sequences of real-time PCR
引物名称 引物序列
α-Tublin (CN487692) 5 TCATCGCCCTCATCATCTGC 3 5 CGACTTGGCAAAGGTTCAGC 3
蛋白磷酸酶 2AB 调节亚基(CN487535) 5 GGTGGCAATGCATCTCGTAG 3 5 GAGGAGCAACGGGAGTCAGC 3
ABC家族蛋白激酶类蛋白(CN486760) 5 GTACAACCTTTCCACCGACG 3 5 TACACGAGATTGCTGGCTCC 3
谷胱甘肽硫转移酶(CN487374) 5 CAACAGCGTCAAGCTCATCC 3 5 TGCATTTCAAGCGGCACTGC 3
酰基载体蛋白 III (CN487349) 5 GTACAGCAACAGGCACCACG 3 5 TGCCACACTCATCGACAAGC 3
转录因子 APFTI (CN487062) 5 GCTACTCCTGCCCAATAAGC 3 5 ACCACATGCTCTGCAACACG 3
进行基因表达量的计算。
实验结果
1 cDNA微阵列的杂交和分析
用Agilent扫描仪(G2655AA)对杂交后的cDNA
微阵列的扫描，获得星星草 cDN A 微阵列杂交
图，通过对杂交信号强度的计算，绘制两组
图 1 两次 cDNA微阵列双色荧光叠加图
Fig.1 The overlay map of the two fluorescent signals on cDNA microarray
cDNA微阵列的杂交信号强度的双色荧光叠加图和
散点图(图 1、2)。从图中可以看出，杂交信号
强度高，说明芯片实验成功。
2 定量RT-PCR对cDNA微阵列结果的验证
为验证 cDNA微阵列结果的可靠性，我们选
取了5个cDNA微阵列中差异表达的基因进行荧光
定量RT-PCR分析，cDNA微阵列结果与定量RT-
图 2 两次 cDNA微阵列的散点图
Fig.2 The scatter plots of cDNA microarray
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PCR的结果比较如图 3。
从图 3可见，选取的 5个基因在 cDNA微阵
列和定量 RT-PCR中表达的趋势一致，均下调表
达。证明 cDNA微阵列的结果可信。
3 cDNA微阵列表达谱分析
2次杂交显示，阴性对照和空白对照杂交信
号均很低，计算表明 2组芯片的数据相关系数(R2)
为 0.93，说明重复性好，数据结果可信。2组芯
片的均一化系数分别为 1.141和 1.086，干旱处理
前后 Cy5/Cy3*的 Ratio值大于 2或小于 0.5，且同
一基因的 2个重复点表达上调、下调趋势相同的
基因共有 39条，其中表达上调的有 17条，表达
下调的有 22条(表 2)。
讨　　论
许多已知功能的基因在干旱胁迫下的差异表
达明显，显示它们可能在星星草抗干旱胁迫中起
作用。其中，cap结合蛋白基因(CN487518)表达
量上升。一般认为，此种蛋白对 R N A 代谢、
mRNA前体剪切及RNA的输出等均起作用，其表
达量增加可能会加速干旱胁迫下星星草体内RNA
的代谢过程。干旱胁迫下，ET域蛋白(CN487580)、
同源异型域转录因子(HDZip，CN487669)和类
MYB DNA结合蛋白(CN487484)等基因表达量明显
升高。说明ET蛋白可能参与染色质结构修饰、植
物胚胎与花器官的发育过程(Alvarez-Venegas和
Avramova 2002)。HDZip基因的表达在叶部和根
部均受脱水和 ABA的诱导(Jin和Martin 1999)。
MYB类转录因子基因家族在细胞次级代谢调控、
抗逆反应及细胞周期调控等过程中发挥作用
(Rahinowicz等 1999)。
干旱胁迫下，一些抗逆相关基因的表达明显
上升，如类甜味蛋白(TLP，CN487555)基因、病
程相关蛋白(CN486869)等。这些基因都与植物抗
逆相关，它们可能在星星草干旱的细胞防御系统
中起作用。干旱诱导下依赖谷氨酸的天冬酰胺合
成酶(CN487110)的表达量上调。一般认为此酶可
调节氮元素的运输，从而维持植物体内合宜的N/
C比(Romaqni和Dayan 2000)，以保证植物的正常
生长发育，其基因的上调表达说明它可能有维持
或保护干旱胁迫下星星草体内的N/C比的作用。
干旱胁迫下，与抗逆相关基因如谷胱甘肽硫
转移酶(GST，CN487374)表达受抑制，此种基因
是植物抵御氧化胁迫的酶类(Tsuchiya等 2004)，
其在植物受干旱和盐胁迫的后期受抑制而表达
(Moons 2003)。在旱胁迫下，作为脂肪酸生物合
成过程中催化碳链延伸的酰基载体蛋白 III基因
(Kanesaki等 2002)表达量下降，说明干旱胁迫下
图 3 cDNA微阵列结果与定量RT-PCR的结果比较
Fig.3 Comparison on cDNA microarray and RT-PCR
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表 2 干旱胁迫下上调或下调表达的基因
Table 2 Genes differentially regulated by drought stress
GenBank登录号 平均 Ratio值 　　　　　　 BLASTX比对结果 　　　　　　　 E值 　　　 匹配物种
CN487535 0.080 蛋白磷酸酶 2AB调节亚基(B regulatory subunit of protein 4E-18 水稻(Oryza sativa)
phosphatase 2A)
CN486099 0.113 FMN结合蛋白(FMN-binding) 0.75 Psychromonas ingrahamii
CN486760 0.134 ABC家族蛋白激酶类蛋白(ABC1 family protein kinase- 3E-12 水稻(Oryza sativa)
like protein)
CN487374 0.154 谷胱甘肽硫转移酶(glu tathione S-transferase，putative) 1E-16 水稻(Oryza sativa)
CN487062 0.223 转录因子 APFTI (transcription factor APFTI) 4E-04 水稻(Oryza sativa)
CN486040 0.251 无匹配
CN487349 0.269 酰基载体蛋白 III (acyl carrier protein 3) 1E-25 大麦(Hordeum vulgare)
CN487387 0.322 假定蛋白(hypothetical protein) 5 斑马鱼(Danio rerio)
CN487707 0.342 β-1,3-葡聚糖酶(putative β-1,3-glucanase) 4E-29 水稻(Oryza sativa)
CN486813 0.343 苯丙酸氨基水解酶(phenylalanine ammonialyase) 1E-37 青藏青稞(Hordeum
vulgare subsp. vulgare)
CN486777 0.375 无匹配
CN487385 0.377 磷脂酸磷酸酶(phosphatidic acid phosphatase-like) 6E-17 水稻(Oryza sativa)
CN487028 0.379 bZIP转录因子家族蛋白(bZIP transcription factor family 0.78 水稻(Oryza sativa)
protein)
CN486216 0.401 无匹配
CN487410 0.420 小核糖核蛋白G (putative small nuclear ribonucleoprotein G) 1E-21 水稻(Oryza sativa)
CN486938 0.421 未知蛋白 4E-27 水稻(Oryza sativa)
CN487223 0.422 未知蛋白 3E-33 水稻(Oryza sativa)
CN486390 0.428 假定 RNA结合蛋白(putative RNA-binding protein) 3E-04 水稻(Oryza sativa)
CN486073 0.431 无匹配
CN487451 0.451 未知蛋白 3E-36 水稻(Oryza sativa)
CN486811 0.462 无匹配
CN486345 0.471 OSJNBa0086P08.14 0.001 水稻(Oryza sativa)
CN486351 2.066 无匹配
CN487555 2.119 类甜味蛋白(thaumatin-like protein) 3E-09 大麦(Hordeum vulgare)
CN486894 2.162 β-内酰胺酶前体(β-lactamase precursor) 0.005 洋葱伯克霍尔德菌
(Burkholderia cepacia)
CN486869 2.291 病程相关蛋白(pathogenesis-related protein) 4E-52 大麦(Hordeum vulgare)
CN487579 2.415 Yip互作因子(putative Yip1 interacting factor) 1E-25 水稻(Oryza sativa)
CN486880 2.452 表达蛋白(expressed protein) 6E-31 水稻(Oryza sativa)
CN487580 2.550 含 SET结构域蛋白(SET domain-containing protein) 4E-63 水稻(Oryza sativa)
CN487516 2.581 P0504D03.19 1E-30 水稻(Oryza sativa)
CN487518 2.606 cap结合蛋白(cap-binding protein CBP20) 3E-04 水稻(Oryza sativa)
CN487139 2.697 无匹配
CN487012 2.773 无匹配
CN487669 2.801 同源异型域转录因子(homeodomain leucine zipper protein) 3E-16 水稻(Oryza sativa)
CN487484 2.809 MYB DNA结合蛋白(MYB-like DNA-binding protein) 0.004 水稻(Oryza sativa)
CN486617 2.935 CG33249-PA 1 黑腹果蝇(Drosophila
melanogaster)
CN487110 3.153 依赖谷氨酸天冬酰胺合成酶(glutamine-dependent 4E-64 小麦(Triticum aestivum)
asparagine synthetase)
CN487492 3.248 鞘氨醇激酶(putative sphingosine kinase) 2E-22 水稻(Oryza sativa)
CN487139 3.541 富含甘氨酸蛋白(glycine rich protein) 0.006 大麦(Hordeum vulgare)
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星星草体内的脂肪酸合成受抑。干旱胁迫下，蛋
白磷酸酶 2A (CN487535)的表达也受到抑制，这
显示干旱胁迫下星星草体内DNA损伤修复有可能
增强，因而抗旱能力增大。
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