全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第3期，2005年6月 371
Prd29A 及 DREB1A 的克隆和干旱诱导型植物表达载体的构建与鉴定
押辉远* 秦广雍 霍裕平
郑州大学离子束诱变育种及生物工程重点实验室，郑州450052
Cloning of Prd29A and DREB1A and Construction and Identification of Plant
Expressing Vector Induced by Drought
YA Hui-Yuan*, QIN Guang-Yong, HUO Yu-Ping
Key Laboratory of Ion Beam Mutation Breeding and Biotechnology, Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China
提要 从拟南芥中克隆了RD29A基因的启动子(Prd29A)及DREB1A基因的DNA片段，构建Prd29A:DREB1A融合基因，采
用合成的接头将该融合基因插入到植物表达载体 pBI121 中，经鉴定，确认正确。
关键词 RD29A基因；DREB1A基因；基因克隆；抗干旱基因工程
收稿 2004-07-19 修定 　2004-12-10
资助 国家“十五”科技攻关项目(200 1B A 30 2 B- 0 3)。
* E-mail: yahy96@sina.com.cn, Tel: 0371-7767728
DREB (dehydration responsive element binding
protein)转录因子(含AP2/EREBP 结构域)是与DRE
(dehydration responsive element)顺式作用元件相结
合，调控对干旱、高盐、低温等逆境应答相关
基因表达的蛋白质[1,2]。很多干旱、高盐、低温
诱导的基因的启动子调控区域有 D R E 核心元件
(GCCGAC/ACCGAC)，如 rd29A、rd17、kin1、
cor6、cor15、erd10、BN115 等基因的启动子调
控区域[3,4]。现在，有人已经从拟南芥中克隆到5
个具有高度同源性的水分胁迫诱导的转录因子基因
( D R E B 1 A、D R E B 1 B、D R E B 1 C、D R E B 2 A、
DREB2B)，它们编码的蛋白质调控含有 DRE 元件
的启动子所驱动的基因转录[3,4]。已有的实验结果
表明，他们可能是控制对干旱、高盐、低温等
逆境应答基因表达的主要转录因子[3,4]。实验证
明，DREB1s 由低温诱导表达，而不为干旱、高
盐所诱导[5]; 与之相反，DREB2s由干旱或高盐所
诱导，而不是为低温诱导表达[5,6]。
RD29A 是 DREB1s 调控的目的基因，在植物
细胞缺水时能够大量表达。RD29A 的启动子区域
含有 DRE 核心序列和 ABRE(ABA-responsive
element，保守序列：CACGTGGC/ACACGTGGC)
顺式作用元件。植物细胞缺水时，植物产生的内
源ABA 通过信号传导产生与RD29A 启动子的ABRE
序列结合的转录因子(含 bZIP 结构域的蛋白质)，
可以启动 RD2 9 A 的表达，DREB 1 s 转录因子与
RD29A 启动子 DRE 核心序列结合也可以诱导该基
因的表达。但 R D 2 9 A 在细胞不缺水时并不表
达[7,8]，它是一个干旱诱导型启动子。以 RD29A
启动子驱动 DREB1A 转录因子在转基因植物中的
表达，在干旱时 DREB1A 基因表达，不干旱的时
候不表达，可以大大减小因基因组成型表达(如植
物基因工程中常用的35S启动子驱动下的表达)给
转基因植株带来的不利影响。同时，DREB1A 基
因的整套表达系统的 D N A 片段很大，而且，其
表达还需要一系列的信号传递，不便于进行基因
操作和基因的高效率表达，因此构建 Pr d 2 9 A :
D R E B 1 A 融合基因进行基因转移来获得抗干旱、
高盐、低温的植物是较为理想的一种策略。
根据NCBI 核苷酸数据库的序列可知 DREB1A
基因的编码框中没有内含子，因此可以用 PCR 的
方法扩增到 DREB1A 基因编码框的 DNA 片段。为
了表达的需要和便于基因重组操作，本文从拟南
芥中克隆了 RD29A 基因的启动子和 DREB1A 基因
编码框的 DNA 片段，然后以正确的方向将克隆到
的启动子和基因融合在一起，并插入植物表达载
体 pBI121 中。
信息与资料 Imformation and Data
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材料与方法
大肠杆菌工程菌株 DH5a 为本实验室保存，
拟南芥[Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.] 哥伦比亚
(Columbia)生态型，由中国科学院合肥等离子体
研究所惠赠。寡聚核苷酸均由上海生物工程公司
合成。Pdrebla l：5 CATGCATCAATGAACTCAT-
TTTCTGCTTTTTC 3，Pdrebla 2：5 CTCTAGA-
C T G A G T T T T A A T A A C T C C A T A A C G A T A C 3 ，
Prd29A1：5 GGAATTCTCGAATGAGAAGATG-
TGCCG 3，Prd29A2：5 CATGCATTCCAATA-
GAAGTAATCAAACCCT 3，Linker 1：5 GATT-
CAGTCGACTGAGCT 3，Linker 2：5 GTCA-
GCTGAC 3。ExTaq Premix、PMD18 克隆载体
(TA 克隆载体)、T4 DNA 连接酶均购自 Takara 公
司，限制性内切酶、D N A 凝胶回收试剂盒购自
上海生物工程公司，植物表达载体pBI121由中国
科学院合肥等离子体研究所余增亮研究员惠赠，
DNA 凝胶回收试剂盒购自上海生物工程公司。
拟南芥总 DNA 的提取方法参照 CTA B 法。
以寡聚核苷酸 Prd29A1、Prd29A2 为引物，
拟南芥总 DNA 为模板，按照如下 PCR 反应程序
扩增到了RD29A基因的启动子Prd29A (0.42 kb):
94℃变性4 min；94℃ 40 s，53℃ 30 s，72℃ 30 s，
共30个循环；最后72℃保温7 min结束反应。按
照如下 PCR 反应程序扩增到了 DR E B 1 A 基因的
DNA片段DREB1A (0.67 kb): 94℃变性 4 min；94℃
40 s，48℃ 30 s，72℃ 30 s，共30个循环；最后
72℃保温 7 min 结束反应。扩增到的 2个 DNA 片
段插入到克隆载体 pMD18 中并转化导入到大肠杆
菌工程菌株DH5a中，在含有X-gal 和 IPTG 的培
养基平板上挑取蓝斑克隆作 PCR 鉴定后，寄送到
上海生物工程公司完成序列测定工作。测序用的
通用引物是M13(+)48和M13(-)47。将得到的2个
重组克隆载体分别命名为 pMDRD 和 pMDDRE。
用限制性内切酶HindIII、NisI酶切 pMDRD，
回收小片段DNA (Prd29A, 0.42 kb)。用限制性内
切酶 NisI、BamHI 酶切 pMDDRE，回收小片段
DNA (DREB1A, 0.67 kb)。用限制性内切酶SacI、
HindIII 酶切植物表达载体pBI121，回收大片段
DNA。两条寡核苷酸linker 用无菌水溶解后混合
在一起，70℃处理 10 min后，慢慢降温到4℃使
其碱基配对变成双链 D N A 分子。这个双链 D N A
分子两端分别有突出的 BamHI、SacI 的粘性末
端，分别和 DREB1A 上的 BamHI、pBI121 上的
SacI 相匹配。在 T4 DNA 连接酶的作用下，将上
述得到 4 种处理后的 DNA 分子按正确的方向连接
在一起，成为一个 cccDNA 分子。将连接产物导
入到大肠杆菌工程菌株 DH5a中，经过 PCR 鉴定
和限制性内切酶 (HindIII和NisI) 酶切鉴定后，得
到的阳性克隆寄送到上海生物工程公司完成测序工
作。将获得的重组植物表达载体命名 pR D D R E。
用软件Dnasist2.0分析了重组后的pRDDRE上的酶
切位点及融合基因序列的正确性。
实验结果
1 基因的分离、克隆、测序
将扩增到的 2 个 D N A 片段插入到克隆载体
p M D 1 8 中，并转化导入到大肠杆菌工程菌株
DH5a，经过 PCR 鉴定得到的阳性克隆(pMDRD)
多个，经测序后选择与NCBI中序列最为相近的一
个克隆 pMDRD1 作为备用克隆，将此质粒称为重
组质粒 p M D R D。图 1、2 分别是 p M D R D 1 ~ 4、
pMDDRE1~4 不同阳性克隆的 PCR 检测(其中，质
粒名称后面的数字代表着不同的克隆)。图1中的
4个克隆中都检测到了0.42 kb左右大小的DNA片
段。图2中的4个克隆中都检测到了0.67 kb左右
大小的 D N A 片段。
得到的阳性克隆 pMDRD 经测序，与 NCBI 核
苷酸数据库中的序列相比较，有 1 个碱基的差
别。启动子 DNA 中有 4 个保守的顺式作用元件都
完整且核苷酸序列正确，其中2个是 DRE 核心元
件，这些是 DR E B 转录因子结合的保守序列；1
个是 ABRE 顺式作用元件；1 个是 TATA box 区
(TATAA)。
得到的 pMDDRE 阳性克隆经测序，选择一个
NCBI核苷酸数据库中的序列最为相近的阳性克隆
p M D D R E 4 做为备用，将此质粒称为重组质粒
pMDDRE。由该克隆的 DREB1A 基因序列推导出
所编码蛋白质的氨基酸序列与NCBI上公布的氨基
酸序列有 2 个氨基酸的差别：一个是 Y(酪氨酸，
其R基不带电荷但有极性)变成了H (组氨酸，其
R基带正电荷); 另一个是E (谷氨酸，其R基带负
植物生理学通讯 第41卷 第3期，2005年6月 373
电荷)变成了V (缬氨酸，其R基不带电荷且无极
性)。但是这2个氨基酸都不在该蛋白的功能序列
AP2/EREBP 结构域中，克隆到的基因编码的蛋白
质的 AP2/EREBP 结构域的保守序列与报道的一
致，可推测该转录因子蛋白能够结合到基因启动
子 GCC box 上面。蛋白质 N 端的 NLS (N 端定位
序列)与报道的一致，也可以推测它可以被输送到
细胞核中，即所克隆到的 2 个 DNA 分子可以行使
正确的功能。
2 植物表达载体的构建、鉴定、分析
表达载体构建方案如图 3，连接产物转化大
肠杆菌工程菌株 DH5a后，从平板上挑选卡那霉
素抗性的菌落，进行 P C R 鉴定，既能检测到
0.42 kb (图4-A箭头指示处)又能检测到0.67 kb (图
图 1 PCR 检测 pMDRD 克隆
　　泳道 1：D L 2 0 0 0 D N A 分子对照；泳道 2：p M D R D 阳
性克隆 1 的质粒；泳道 3：p M D R D 阳性克隆 2 的质粒；泳道
4：以阳性克隆 1 为模板的 PCR 产物；泳道 5：以阳性克隆 2
为模板的 PC R 产物；泳道 6：以阳性克隆 3 为模板的 PC R 产
物；泳道 7：以阳性克隆 4 为模板的 P C R 产物；泳道 8：以
拟南芥总 D N A 为模板的 P C R 产物。
图 2 PCR 检测 pMDDRE 克隆
　　泳道 1：DL 2 0 0 0 D N A 分子对照；泳道 2：pM D D R E 阳
性克隆 1 的质粒；泳道 3：p M D D R E 阳性克隆 2 的质粒；泳
道 4：以阳性克隆 1 为模板的 P C R 产物；泳道 5：以阳性克
隆 2 为模板的 PCR 产物；泳道 6：以阳性克隆 3 为模板的 PCR
产物；泳道 7：以阳性克隆 4 为模板的 P C R 产物；泳道 8 ：
以拟南芥总 D N A 为模板的 P C R 产物。
图3 表达载体构建示意
　　HindIII、NisI、BamHI、SacI 为不同的限制性内切酶；LB、RB 为植物[表达载体上的左右边界序列元件；Pnos、Tnos
分别为 nos 基因的启动子和终止子；NPTII 为抗卡那霉素基因，Prd2 9A 为克隆的启动子；DREB 1A 为克隆的转录因子基因。
植物生理学通讯 第41卷 第3期，2005年6月374
4-B 箭头指示处)的克隆 3即为阳性克隆。
阳性克隆3经限制性内切酶(HindIII和NisI)酶
切(图5)后电泳，切出0.45 kb左右和0.70 kb左
右的 DNA 片段。由于 DREB1A 0.27 kb 处有一个
SacI酶切位点，所以切出应该是0.45 kb左右和
0.70 kb左右的2条DNA片段(因为融合基因两端多
出酶切位点和 DNA 接头，所以切出的片段比 PCR
扩增出的片段长出来一些)。同时，这样的酶切
结果也说明融合基因构建的方向的正确性。序列
测定由上海生物工程公司完成，测序是从融合基
因的两端测的(用的引物是Prd29A1和Pdreb1a2)，
大约为1.1 kb左右，如果得到的两个序列在融合
基因的中间有序列重叠(Prd29A 3端和DREB1A 5
端都有NisI酶切位点)，说明融合基因的拼接是正
确的，反之则说明试验结果不符合预期。将测定
的序列进行拼接、分析与所预期的一样，Prd29A
启动子与 DREB1A 方向符合基因表达的要求，并
且，Prd29A启动子中启动基因表达的基本元件与
克隆的 pMDRD 中的序列相比没有变化，DREB1A
的 DNA 序列与克隆的序列也没有变化。
讨　　论
运用转基因技术培育抗逆的农作物新品种是
一种有效的育种途径，目前已有通过转化单一基
因(如 TPS、P5CS、BADH、Ath-ALDH3、ImtI
mtLD、gutD、otsBA、bets)获得了较为抗干旱、
高盐的转基因农作物，但不能使转基因植物获得
综合性状较为理想的农艺改良[7,9~11]。植物的抗逆
性是很复杂的基因相互作用的过程，对干旱、盐
碱、低温的耐性的强弱往往不是取决于单一基因
的作用[11,12]，而是多个基因相互作用的结果。因
此，要提高植物综合的抗逆性，重要的还是要从
一些关键的转录因子着手[1]。
本文克隆了拟南芥的干旱诱导性启动子和干
旱相关转录因子基因，并构建了其融合基因，可
以在一定程度上改善上述问题。从试验的结果分
析来看，克隆的 D N A 分子是正确的，构建的融
合载体的构件理论上符合基因表达的要求，这就
为植物的抗干旱转基因奠定了物质基础。现在，
作者正在将构建植物表达载体在离子束的介导下转
图4 PCR 检测 pRDDRE 阳性克隆
　　泳道 1：DN A D L 2 0 0 0 分子对照；泳道 2：以阳性克隆
1 为模板的 PCR 产物；泳道 3：以阳性克隆 2 为模板的 PCR 产
物；泳道 4 ：以阳性克隆 3 为模板的 P C R 产物。
图 5 酶切检测pRDDRE 阳性克隆
　　泳道 1：DL2000 DNA 分子对照；泳道 2：NisI 和 SalI 酶
切 pRDDR E；泳道 3：l/ Hi ndI II DN A 分子对照；泳道 4：
p R D D R E 质粒。
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化小麦，希望能得到抗逆性较强的小麦品种以适
应干旱、盐渍等中低产田小麦生产的需要。
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