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蜘蛛杀虫肽与Bt-toxin C肽融合蛋白(BGT)基因的原核表达与蛋白质纯化



全 文 :植物生理学通讯 第 43卷 第 5期,2007年 10月 869
蜘蛛杀虫肽与Bt-toxin C肽融合蛋白(BGT)基因的原核表达与蛋白质纯化
孙冬,詹亚光 *,曾凡锁
东北林业大学生命科学学院,哈尔滨 150040
提要:从质粒 pCAMBIA2301-BGT中获得蜘蛛杀虫肽与 Bt-toxin C肽融合蛋白(BGT)基因编码区全长,并构建了原核表
达载体 pET28a-BGT。将此质粒转入大肠杆菌 BL21 (DE3)中,获得有效表达,新蛋白的分子量约为 51 kDa,主要以包
涵体形式存在。在变性条件下以不同的咪唑和pH值洗脱方式进行比较,确定以咪唑为金属鳌合亲和柱层析的洗脱条件,
获得了纯BGT蛋白。
关键词:蜘蛛杀虫肽;Bt;原核表达;蛋白纯化
Prokaryotic Expression and Protein Purification of Spider Insecticidal Pep-
tide and Bt-toxin C Peptide Gene
SUN Dong, ZHAN Ya-Guang*, ZENG Fan-Suo
College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: The complete sequence of BGT gene was amplified from the plasmid pCAMBIA2301-BGT, and the
prokaryotic expression vector of pET28a-BGT was constructed successfully. The recombinant vector pET28a-
BGT was transformed into Esherichia coli BL21 (DE3) and expressed in efficiency. The expressed protein was
in the form of inclusion bodies with the molecular weight 51 kDa. Different pH and imidazole elution methods
were investigated for the purification of BGT fusion protein by immobilized metal ion affinity chromatography
under denaturing conditions, showing that imidazole was better, and the electrophoresis purity BGT protein
was acquired.
Key words: spider insecticidal peptide; Bt; prokaryotic expression; protein purification
收稿 2007-05-30 修定  2007-08-27
资助  国家自然科学基金(30 4 71 4 1 3)。
* 通讯作者(E-m a i l:ya gu a ngzha n@1 2 6 .com;T el:
0 45 1-8 21 91 75 2)。
近些年来,用基因工程方法成功地将许多抗
虫基因,如苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因(Bacillus
thuringiensis,Bt)、胰蛋白酶抑制剂基因(trypsin
i n h i b i t o r,T I )、抗菌肽基因(a n t i m i c r o b i a l
p e p t i d e,A P )、豇豆胰蛋白酶抑制剂基因
(cowpean typsin inhibitor,CpTI)等导入不同的
植物中,转基因植物可通过代谢过程产生抗虫物
质,如咖啡因(Kim等 2006),抑制不同种类的害
虫对植物的破坏。本文中研究的蜘蛛杀虫肽和Bt-
toxin C肽融合蛋白(spider insecticidal peptide and
Bt-toxin C peptide,BGT)基因是具有 2种不同杀
虫机制的抗虫基因(Eun等 2002;林良斌和官春云
1997)。迄今,人们相继采用农杆菌介导法将此
融合基因导入棉花、白桦、小黑杨和欧美杨 108
号等植物中(郑树松等 2002;詹亚光等 2003;姜
静等 2004;张国财等 2005),并获得抗虫的转基
因植株。但目前针对此目的基因尚缺少蛋白水平
上的检测手段,转基因植物广泛应用于生产的关
键在于所转基因能否在遗传转化体内稳定整合和表
达(华志华和黄大年 1999)。因此,建立快速而有
效的外源蛋白检测技术对研究转基因植物外源基因
在受体植物中的表达稳定性来说相当重要,而获
得纯化的外源蛋白则是建立外源蛋白检测技术的基
础,它可为转基因产品的检测、监测与安全性评
价等研究提供支持。
材料与方法
大肠杆菌感受态菌株 JM109菌株购自博大泰
克公司,大肠杆菌 BL21 (DE3)菌株和原核表达载
体 p E T 2 8 a ( + )购自 N o v a g e n 公司,质粒
pCAMBIA2301-BGT由北京大学生命科学学院安成
才教授馈赠。色谱柱购自 Novagen公司,Ni2+-
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NTA购自Qiagen公司。PrimerStar高保真酶购自
大连宝生物工程公司,T4 DNA连接酶和限制性
内切酶 NheI和 XhoI购自New England Biolabs公
司。扩增引物的合成和核苷酸测序均由大连宝生
物工程公司完成。
根据BGT基因编码区设计引物,分别加入酶
切位点。上游引物 P1:AGAGAGCTAGC(NheI)
ATGTCTCCAACTTGCATTC,下游引物 P2:
CCCGGCTCGAG(XhoI)TTAATCAATATGATA-
ATCC。扩增反应体系:1 µL模板 pCAMBIA2301-
BGT (1 ng·µL-1)、5 µL 10×PCR缓冲液、4 µL
dNTP混合液(2.5 mmol·L-1)、引物 P1和 P2 (10
µmol·L-1)各 1 µL、0.3 U 高保真DNA聚合酶(2.5
U·µL-1),以双蒸水补足至 50 µL。反应条件:94
℃预变性 5 min;98 ℃变性 10 s,68 ℃退火 2
mi n,共运行 30 个循环。
纯化后的 PCR产物和原核表达载体 pET28a
(+),分别用 NheI和 XhoI双酶切处理,酶切产物
切胶回收,T4 DNA连接酶在 16 ℃下连接过夜,
转化大肠杆菌 JM109,在含卡那霉素(50 mg·L-1)
的 LB平板上于 37 ℃中过夜培养。挑取单菌落培
养过夜,提取重组质粒经酶切及测序鉴定。
重组质粒 pET28-BGT转化 BL21 (DE3),挑
取单菌落,37 ℃振荡培养至菌液浓度为 OD600
0.5~0.8时,加入终浓度为 1.0 mmol·L-1的 IPTG,
37 ℃下诱导表达 4 h后,取 1 mL菌液,离心收
集菌体,进行 12% SDS-PAGE 电泳检测,用
BandScan 5.0软件分析重组蛋白的含量。
分析重组蛋白的可溶性时,将上述诱导所得
菌液离心收集菌体,将沉淀重悬于裂解缓冲液(50
mmol·L-1 NaH2PO4、300 mmol·L-1 NaCl,pH 8.0)
中,以液氮反复冻融 5次后加入 10 µg·mL-1溶菌
酶,在室温下反应 30~60 min。裂解液于 4 ℃下
以 12 000×g离心 10 min后,收集上清液和沉淀
进行 12% SDS-PAGE电泳检测。
以pH值为洗脱方式对重组蛋白纯化时,经大
规模诱导表达培养菌液离心后的菌体加入5 g·mL-1
的裂解缓冲液(同上),裂解约 1 h,12 000×g离
心 20 min,收集上清液,并用 0.45 µm微孔滤膜
过滤,每 4 mL上清液与 1 mL 50%的 N2+-NTA
树脂亲和层析填料混合,于 4 ℃下振荡约 1 h后
上柱。纯化具体操作按照The QIA expressionist™:
a handbook for high-level expression and purification
of 6×His-tagged proteins操作手册进行并作适当修
改 。
以咪唑为洗脱方式纯化重组蛋白时,裂解和
上柱同前述,用 2×4 mL的洗涤缓冲液(50 mmol·L-1
NaH2PO4、300 mmol·L-1 NaCl、20 mmol·L-1咪唑、
8 mol·L-1尿素,pH 8.0)洗柱;用 3×0.5 mL的洗
脱缓冲液(50 mmol·L-1 NaH2PO4、300 mmol·L-1
NaCl、250 mmol·L-1咪唑、8 mol·L-1尿素,pH
8.0)洗脱。每步的收集液均进行 12% SDS-PAGE
电泳检测。
蛋白质含量测定参照Bradford (1976)的方法。
实验结果
1 BGT基因的PCR扩增
以质粒 pCAMBIA2301-BGT为模板进行PCR
扩增,扩增产物用 1%琼脂糖凝胶进行电泳分析
的结果(图 1)表明,目的基因 PCR扩增产物在约
1 500 bp处有 1条特异性带,大小约为 1 400 bp,
与目的基因片段的大小(1 392 bp)相吻合。
2 重组质粒pET28-BGT的鉴定
将BGT基因的PCR纯化产物与原核表达载体
pET28 a ( +)连接后,导入大肠杆菌感受态菌株
JM109中。挑取阳性重组表达质粒,重组质粒用
NheI和XhoI酶切后,在酶切产物中发现目的基因
图 1 BGT基因的 PCR扩增电泳图谱
Fig.1 Electro-phoretogram of BGT gene
amplification with PCR
M:分子量标准;1 和 2:B G T 基因 P C R 扩增产物。
植物生理学通讯 第 43卷 第 5期,2007年 10月 871
和载体片段(图 2)。测序结果进一步证实,BGT
基因正确插入原核表达载体 pET28a(+)中。据此
认为,重组质粒 pET28-BGT构建成功。
图 2 重组质粒 pET28-BGT的酶切鉴定
Fig.2 Identification of recombinant plasmid
pET28-BGT by restriction analysis
M:分子量标准;1 和 2:重组质粒 p E T 2 8 - B G T。
3 BGT蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
挑取BL21 (DE3) [pET28-BGT]和BL21 (DE3)
[pET28a(+)]的单菌落,在 LB培养液中培养至菌
液浓度为 OD600 0.5~0.8后,加入终浓度为 1.0
mmol·L-1的 IPTG,在 37 ℃下诱导表达 4 h后,
取 1 mL菌液,离心收集菌体,以 12% SDS-PAGE
电泳分析。结果(图 3)显示,与空载质粒相比较,
图 3 BGT基因在大肠杆菌中表达的 SDS-PAGE检测
Fig.3 Expression of BGT gene in E. coli by SDS-PAGE
  M:标准分子量蛋白;1:未诱导质粒;2 和 3:诱导
表达质粒;4:空载体的诱导表达。箭头指示约 5 1 k D a 的重
组蛋白。
重组表达质粒在 51 kDa处显著增加 1条蛋白质条
带,这与BGT蛋白的预测的分子量一致。软件分
析表明,特异条带占细菌总蛋白含量的 15%左右。
4 重组蛋白的可溶性分析
收集的菌体放在液氮中反复冻融 5次,加入
溶菌酶后,取部分上清液和沉淀进行 SDS-PAGE
的结果表明,外源蛋白富集于沉淀中,重组蛋白
主要以包涵体的形式存在(图 4)。
图 4 重组蛋白的 SDS-PAGE检测
Fig.4 Determination of recombinant protein by SDS-PAGE
箭头指示为重组蛋白。
5 重组蛋白的纯化
采用金属螯合亲和柱层析纯化重组蛋白,将
菌体在变性条件下裂解后,与 Ni2+-NTA树脂混
合,振荡约 1 h后上柱。以咪唑和 pH 值两种洗
脱方式,分别纯化重组蛋白。每步的收集液,取
10 µL上样。以 SDS-PAGE电泳分析的结果表明,
以pH值方式洗脱时,只能洗脱下很少一部分重组
蛋白(图 5) ;而以咪唑方式洗脱时,能够洗脱出
结合在树脂中的大部分重组蛋白,而且杂质蛋白
较少,纯化后的重组蛋白在分子质量约为 51 kDa
处有 1条明显的蛋白质带(图6)。纯蛋白质浓度为
0.3 mg·mL-1。
讨  论
以质粒 pCAMBIA2301-BGT为模板,通过设
计的基因特异性引物的PCR扩增获得BGT基因的
成熟肽编码区,构建了原核表达载体 p E T 2 8 -
植物生理学通讯 第 43卷 第 5期,2007年 10月872
效率高和抗污染能力强等优点(李育阳 2001)。
本文用的 pET28a (+)原核表达载体,具有
6×His的编码序列,可与BGT蛋白N端融合有6个
His残基,易于纯化,尤其是适合抗原蛋白的制
作。根据 pH 值和咪唑两种不同的纯化方式,并
以 SDS-PAGE电泳分析的结果,我们认为,咪唑
洗脱方式更好些。
迄今,双价抗虫BGT基因主要应用于林木抗
虫基因工程中,其对舞毒蛾等林业害虫有良好的
抗性(詹亚光等 2003;姜静等 2004)。但树木的世
代周期较长,为了让外源基因在树木中稳定表达
很重要。由于许多转基因植物常产生转基因沉默
现象,这已成为植物遗传转化技术用于基础研究
和应用研究的严重障碍。本文中表达的蛋白可以
替代植物外源蛋白,用于转 B G T 基因植物中
ELISA检测的抗体制备。
参考文献
华志华, 黄大年(1999). 转基因植物中外源基因的遗传学行为. 植
物学报, 41: 1~5
姜静, 常玉广, 董京祥, 王志英, 刘桂丰(2004). 小黑杨转双价抗
虫基因的研究. 植物生理学通讯, 40 (6): 669~672
李育阳(2001). 基因表达技术. 北京: 科学出版社, 1~13
林良斌, 官春云(1997). Bt毒蛋白基因与植物抗虫基因工程. 生
物工程进展, 17 (2): 51~55
詹亚光, 王玉成, 王志英, 杨传平, 刘志华, 李彩华(2003). 白桦的
遗传转化及转基因植株的抗虫性. 植物生理与分子生物学学
报, 29 (5): 380~386
张国财, 邹传山, 王志英(2005). 欧美杨 108 号转蜘蛛杀虫肽与
Bt毒蛋白嵌合基因转化系统的建立. 东北林业大学学报, 33
(6): 43~44, 54
郑树松, 安成才, 李启任, 陈章良(2002). 蜘蛛杀虫肽与 Bt-Toxin
C 肽融合蛋白基因转入棉花的研究. 棉花学报, 1 4 (6 ) :
348~351
Bradford MM (1976). A rapid and sensitive method for the
quantitation of microgram quantities of protein utilizing the
principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 72: 248~254
Eun HC, Kwang KL, Ji HH, Yeon HJ, Jin HC, Jong YR, Hung DS,
Byung RJ (2002). Molecular cloning of two cDNAs encod-
ing an insecticidal toxin from the spider, Araneus ventricosus,
and construction of a recombinant baculovirus expressing a
spider toxin. Int J dust Entomol, 4 (1): 43~49
Kim YS, Uefuji H, Ogita S, Sano H (2006). Transgenic tobacco
plants producing caffeine: a potential new strategy for in-
sect pest control. Transgenic Res, 15: 667~672
图 6 以咪唑为洗脱方式的重组蛋白的纯化
Fig.6 Purification of recombinant protein by
imidazole elution method
  1:未诱导质粒;2:诱导表达质粒;3:裂解液;4:
穿透液;5 :洗涤液;6 :洗脱液;M:标准分子量蛋白。
箭头指示为纯化重组蛋白。
BGT,并实现了重组蛋白在大肠杆菌 BL21 (DE3)
中的诱导表达。SDS-PAGE电泳分析表明,重组
蛋白得以表达,主要以包涵体的形式存在。但重
组蛋白在大肠杆菌BL21 (DE3)中的表达量并不高,
约占细菌总蛋白的 15%左右,其原因可能是由于
BGT基因的编码区序列采用的是植物偏爱的密码
子之故。但此种用原核表达载体的BGT基因,可
以满足实验的进一步要求。大肠杆菌原核表达系
统在基因表达技术中发展最早、应用最广泛,与
其他系统相比具有遗传背景清楚、繁殖快、表达
图 5 以 pH值为洗脱方式的重组蛋白的纯化
Fig.5 Purification of recombinant protein
by pH elution method
  1:未诱导质粒;2:诱导表达质粒;3:穿透液;4:
洗涤液;5:洗脱液 I;6:洗脱液 I I;M:标准分子量蛋
白。箭头指示为纯化重组蛋白。