全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第6期，2005年12月 745
类大麦材料y型高分子量谷蛋白基因不表达的鉴定
颜泽洪* 郭志富 代寿芬 魏育明 郑有良
四川农业大学小麦研究所，四川都江堰 611830
提要 利用 SDS-PAGE 检测了 2 份类大麦属植物的高分子量谷蛋白亚基组成，在小麦的高分子量区域仅检测到 1 条蛋白
带，因此怀疑其 y 型亚基没有表达。根据其它高分子量谷蛋白提取方法的结果以及基因编码区部分序列测定，确认其 y
型高分子量谷蛋白基因是沉默的。
关键词 类大麦属；高分子量谷蛋白基因；基因沉默
Identification of An Inactive y-Type High-Molecular-Weight Glutenin Gene in
Crithopsis delileana (Schult.) Roshev.
YAN Ze-Hong*, GUO Zhi-Fu, DAI Shou-Fen, WEI Yu-Ming, ZHENG You-Liang
Triticeae Research Institute, Sichuan Agricultural University, Dujiangyan, Sichuan 611830, China
Abstract Using SDS-PAGE analysis, the high-molecular-weight glutenin subunits (HMW-GS) of two Crithopsis
delileana (Schult.) Roshev. accessions were detected. It was found that the two accessions had the same
HMW-GS. Only one HMW-GS with the similar electrophoresis mobility to the y-type HMW-GS of hexaploid
wheat was observed in C. delileana. It was not sure whether the y-type HMW glutenin genes were silenced or
not. By using other protein extraction methods and sequencing of partial gene coding region, it was confirmed
that, in fact, the y-type HMW glutenin gene in C. delileana accessions was silenced.
Key words Crithopsis delileana (Schult.) Roshev.; high-molecular-weight (HMW) glutenin gene; gene silence
收稿 2005-04-07 修定 　2005-09-26
资助 高等学校全国优秀博士学位论文作者专项基(200458)、
教育部重点项目、国家自然科学基金(30370882)、四
川省青年基金、四川省科技厅应用基础项目( 0 3 T Y -
029-028-1)。
*E-mail: zhyan104@163.com, Tel/Fax: 028-87283949
作为小麦种子贮藏蛋白之一的高分子量麦谷
蛋白含量占种子贮藏蛋白总量的约 10%，其数量
和质量对小麦面筋含量及烘烤品质有直接影
响[1~3]。正因为如此，高分子量谷蛋白基因的表
达与沉默备受关注。依基因编码区结构特征，可
分为x和 y型[1~4]。在普通小麦中，由于基因沉默
效应，可正常表达的高分子量谷蛋白基因数目为
3~5 个[4]。其中，Ay 经常不表达[5~7]，Dx、Dy
和 Bx 经常表达，By 和 Ax 有时表达[4]。
类大麦属材料[Crithopsis delileana (Schult.)
Roshev.，2n=2x=14, KK]是小麦族植物中少见的二
倍体单种属之一。主要分布在亚洲西南部、非洲
北部、中东地区及地中海沿岸，染色体组为K[8]。
Catalan等[9]根据叶绿体NADH脱氢酶亚基F部分基
因序列的结果，阐述了类大麦属的系统演化关
系；Petersen和Seberg[10]根据类大麦属叶绿体的
rpoA基因以及它所编码的RNA聚合酶a-亚基的序
列结构研究的结果，确立了该属在小麦族中的系
统分类地位；Hsiao等[11]根据 rDNA中的内部转录
间隔区(internal transcribed spacer, ITS)的序列差
异，从分子水平分析了该属与其它小麦族二倍体
物种的亲缘关系。迄今，尚未见对此物种的种子
贮藏蛋白的报道。
本文研究类大麦属中不表达的 y 型高分子量
谷蛋白基因，以期能为认识和利用类大麦属物种
的谷蛋白基因提供参考。
材料与方法
以2份类大麦属材料[Crithopsis delileana
(Schult.) Roshev.]作种子高分子量谷蛋白组成分
析。由我所从丹麦引入并收藏。
采用3种方法提取种子蛋白：(1)常规种子蛋
白提取方法，按照我们以前发表的方法[12]进行。
( 2 ) 高分子量谷蛋白的选择性沉淀提取，参照
植物生理学通讯 第41卷 第6期，2005年12月746
Macike等[13]的方法进行，具体步骤为：半粒种子
磨碎，悬浮于625 mL含 1% (W/V) DTT 的 50%正
丙醇中，60℃提取1 h，其间不断混匀；12 000×g
离心 10 min，取 400 mL 上清液置于新管中，加
100 mL 含 1% (W/V) DTT 的正丙醇进行沉淀，混
匀后于室温放置 30 min；12 000×g 离心 5 min，
收集沉淀，再用含 1% (W/V) DTT 的 60% 正丙醇
洗1次，沉淀物用100 mL常规提取方法中所用的
提取液溶解，沸水变性5 min 后上样。(3)丙酮沉
淀提取法，参见Verbruggen等[14] 和Melas等[15]的
方法，具体操作为：按300 mg面粉加 15 mL 70%
乙醇的比例悬浮面粉，于室温下提取30 min，不
断摇动，5 000×g 离心 5 min，弃上清，重复提
取1次；残渣中加15 mL 50%异丙醇混匀后于60℃
下提取30 min，5 000×g 离心 5min，弃上清，重
复提取1次，并用7.5 mL 50% 异丙醇洗涤1次；
残渣中加 3 mL 含 50% 异丙醇、1% DTT (W/V)、
0.08 mol·L-1 Tris-HCl (pH 8.0)的提取液，60℃下提
取30 min (不断摇动)，5 000×g离心5 min，保留
上清液。残渣中再加 3 m L 相同的提取液混匀，
5 000×g离心 5 min，弃去沉淀，合并上清液。于
上清液中加入丙酮至 40% (加 4 mL 左右)，静置
10 min 后，5 000×g 离心 5 min，此沉淀主要为
高分子量谷蛋白质亚基(high molecular weight glu-
tenin subunit, HMW-GS)。
然后，对以上以 3 种方法提取的蛋白进行
SDS-PAGE 分析。由于以前没有类大麦属高分子
量谷蛋白的报道，故以小麦品种“中国春”和
“川育 12”所含有的高分子量谷蛋白作为相对分
子量标准[高分子量谷蛋白组成分别为( n u l l，
7+8，2+12)和(1, 7+8, 5+10)]，根据迁移率区分
类大麦属材料中的高分子量谷蛋白和低分子量谷蛋
白以及醇溶蛋白。
参见文献11 的方法，采用2×CTAB 法进行基
因组 DNA 提取。利用扩增 HMW - G S 基因编码区
的特异性引物 P1 (5 AGCTGCAGAGAGTTCTATCA
3)和 P2 (5 ATCACCCACAACACCGAGCA 3)，对
基因组 DNA 进行扩增。PCR 反应体系及扩增条件
按照我们以前发表的方法[11 ]进行。扩增产物于
0.8% 的琼脂糖凝胶中电泳检测和回收。
PCR 扩增产物回收纯化后，与 pMD18-T 载
体连接，转化并筛选阳性克隆。测定阳性克隆序列。
实验结果
1 类大麦材料的 HMW-GS 的 SDS-PAGE 分析
图 1 显示，2 份来自于丹麦的材料种子蛋白
带型完全一致，在小麦的高分子量谷蛋白区域，
仅有 1 条带(图 1，箭头所示)，电泳迁移率介于
普通小麦 By8 和 Dy10 亚基之间，应为 1 个 HMW-
GS。根据每个染色体组可编码 1 个 x 型和 1 个 y
型 HMW-GS，y 型亚基的分子量比 x 型小而电泳
迁移率较快，认为箭头所示应是 x 型高分子量谷
蛋白。其中的y亚基有两种可能：一种是 y型亚
基在此材料中沉默；另一种是 y 亚基比普通小麦
中最小的y型亚基Dy12还小(即迁移率比Dy12还
快)。我们发现三角形指示的带纹与箭头所示的带
纹的染色强度一致，它可能是 y 亚基。
2 其它蛋白提取方法的验证
如果二倍体类大麦中的x和y型高分子量谷蛋
白基因均可表达，则特异提取高分子量谷蛋白的
选择性沉淀法或丙酮沉淀法提取的高分子量谷蛋白
SDS-PAGE 分析可得到 2 条带；如果有亚基不表
达，则肯定会少于 2 条。于是，应用选择性沉
淀法和丙酮沉淀法分别提取类大麦材料的高分子量
谷蛋白。结果显示，选择性沉淀高分子量谷蛋白
法所得到的蛋白电泳图谱(图未列出)除与图1结果
类似外，还多出了 1 条带。以往用该方法证明被
图1 类大麦属材料的 HMW-GS
Fig.1 The HMW-GS in C. delileana
　　1 ：小麦“中国春”；2 和 3 ：类大麦属材料；4 ：小
麦“川育 1 2”。箭头指示的可能为 x 型亚基；三角形指示的
带纹可能为 y 型亚基。
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认为有3个 HMW-GS的节节麦材料中实际只有2个
HMW-GS 时非常有效[12]。后经进一步研究，其中
的一条被认为是多出的所谓“HMW-GS”实际上
是高分子量的醇溶蛋白(也即分子量较大的醇溶蛋
白)[16]。因此，本方法不能排除图1第2泳道三角
形指示的蛋白带，揭示它有可能不是醇溶蛋白，
也有可能它就是 y 亚基。于是，丙酮沉淀法又被
用于此研究。当丙酮浓度达到 80% 时，所沉淀出
的产物电泳结果便不再包含图1箭头下方的三角形
指示的蛋白带，而箭头所示的带纹在两种方法的
结果中均存在。因此，该类大麦材料仅包含 1 个
HMW-GS (图 2)。
3 PCR扩增和克隆
因 2 份材料的 HMW-GS 带型一致，故选取其
中 1 份材料作研究对象。为了验证 y 型谷蛋白基
因的存在，利用特异性扩增高分子量谷蛋白基因
的引物P1 和 P2，同时扩增出2条 DNA片段(图 3)，
分别为2.1和 1.7 kb，对应其中的x和 y型基因。
分别回收2.1和 1.7 kb片段，并克隆于pMD18-T
载体，获得阳性质粒并测序。
4 序列分析
通过测定2.1和1.7 kb片段的部分DNA序列，
发现2.1和1.7 kb片段分别对应其中的x和y型高
分子量谷蛋白基因。对2.1 kb片段进行了体外表
达，发现其所表达的蛋白与种子来源的蛋白带(图
中的箭头指示带)有一致的迁移率，这证实了x型
基因是表达的(另文报道)。对1.7 kb片段的N端
序列进行部分测序，发现有 y 型高分子量谷蛋白
基因特有的5个半胱氨酸(图4)。而对C端部分DNA
序列测定后发现，在重复区的倒数第 2 个六肽重
复单元PGQGQQ中的第2位氨基酸甘氨酸(Gly, G)
的密码子由于 G/A 突变，使编码甘氨酸的密码子
GGA变为TGA (图4)而成为一编码区内的提前终止
密码，导致了y型谷蛋白基因不能编码任何蛋白。
讨 论
类大麦材料的 SDS-PAGE 分析结果显示，在
小麦的高分子量区域仅检测到 1 条可能的 HMW-
GS 的蛋白带。分别通过3种提取高分子量谷蛋白
的方法，最终确认在该材料中仅表达 1 个高分子
量谷蛋白基因。用高分子量谷蛋白基因编码区特
异引物对其进行扩增，得到2个对应于x和y型谷
蛋白基因的 DNA 片段。对大片段测序显示其为 x
型亚基，在细菌表达系统中所表达的 x 型亚基与
种子来源的迁移率一致，这表明表达的是 x 型基
因(另文报道)。由于在普通小麦中存在单个亚基
独自出现的情况[4]，所以为了明确y型基因是沉默
还是缺失(不存在此基因位点)，又对1.7 kb片段
进行了部分测序。结果显示，其 N 端含有 y 型高
分子量谷蛋白基因特有的 5 个半胱氨酸，C 端存
在编码区内的提前终止密码子。这说明 y 型基因
是存在的，但不表达蛋白。
关于 y 型谷蛋白基因不表达以 A y 研究最
多[5,7,17,18]。在普通小麦“Cheyenne”中，Ay 不
表达可能是由于编码区内的提前终止密码子[5]，
也可能是由于启动子区域接近转录起始位置的特殊
图3 PCR扩增高分子量谷蛋白基因编码区
Fig.3 Amplification of the complete coding regions
of HMW glutenin by PCR method
1 ：D N A 分子量标准；2 ：P C R 扩增产物。
图2 丙酮沉淀法提取的类大麦 HMW-GS
Fig.2 The HMW-GS in C. delileana extracted
by acetone precipitation method
　　1 ：小麦“中国春”；2 和 3 ：类大麦材料用常规提取
方法；4 和 5：类大麦材料用丙酮沉淀法提取；6：小麦“川
育 1 2”。箭头指示 x 型 H M W - G S；三角形为图 1 中指示的可
能的 y 型亚基。
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部位核苷酸序列的替换[17 ]。“中国春”Ay 不表
达可能是由于编码区内的转座子类似序列的插入[7]。
“乌拉尔图”小麦 Ay 的不表达也可能与编码区内
的提前终止密码子有关[18]。根据以上几种情况，
我们认为，在类大麦材料中，y 型谷蛋白基因不
表达可能主要是由于编码区内的提前终止密码子造
成 的 。
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图 4 y 型谷蛋白基因编码区N和 C端 DNA 部分序列
Fig.4 Partial DNA sequencing of y-type HMW glutenin gene in terms of N and C terminals
下划线指示 y 型基因特有的 5 个半胱氨酸，星号指示终止密码子。