全 文 ：Characterization of HMW Glutenin Subunit Gene Dy12t from Aegilops
tauschii Accession with Subunit Combination Dx5 t+Dy12t
DA I Shou-f en , Y AN Ze-hong , WE I Yu-ming , ZHENG Y ou-l iang
(T riticeae Research Institute, Sichuan Agricultural University , Dujiangyan 611830 , Sichuan , China)
Abstract:To understand the molecular bases for HMW glutenin subunit Dx5t+Dy12t endowing w heat
f lours with prominent end use qualities , the electrophoresis mobility of Dy12t in this subuni t combina-
tions w as determined by SDS -PAGE analy sis and the gene fo r this subunit w as isolated and se-
quenced.Results show ed that the elect rophoresis mobili ty of HMW glutenin Dy12 t of Aegilops tauschi i
and Dy12 of w heat are the same , while bo th are distinctively different f rom Dy10 of wheat.However ,
at amino acid sequence level , HMW glutenin Dy12t dif fers f rom Dy10 only by four amino acid replace-
ment , while they show ed great difference wi th Dy12 by tw elve amino acid replacements and tw o hex-
peptide insertions and four amino acid insertions/deletions.The results suggested that the main reason
for Ae.tauschi i HMW glutenin Dx5 t+Dy12t endow ing w heat w ith good baking quali ty could ascribe
to the high similarity betw een HMW glutenin Dy12t and Dy10 at amino acid sequence level , which
makes the quali ty potential of HMW glutenin subunit pai r Dx5
t+Dy12 t is very like that of Dx5+
Dy10.
Key words:Aegi lops tauschii;HMW glutenin gene;cloning;sequencing
节节麦高分子量谷蛋白 Dx5t +Dy12t 亚基组合中
Dy12t 亚基的序列测定与分析
代寿芬 , 颜泽洪 , 魏育明 , 郑有良
(四川农业大学 小麦研究所 , 四川 都江堰　611830)
摘要:为了认识节节麦 5 t+12 t亚基品质表现突出的分子基础 , 利用 SDS-PAGE 分析研究了该亚基组合中 12 t 亚
基的电泳迁移率并克隆和测序了该亚基基因。结果表明 ,该 12 t亚基在 SDS-PAGE 上的电泳迁移率与普通小麦中
的 Dy12 具有一致的电泳迁移率 , 但与 Dy10 的电泳迁移率差异明显。而氨基酸序列比较结果显示 , 12t 亚基的分子
序列与 Dy10 的相似程度非常高 , 二者仅存在 4 个氨基酸的替换 ,而它与 Dy12 的分子序列存在较大的差异 ,不但包
括 12 个氨基酸的替换 , 同时包括 2 个六肽氨基酸和另外 4 个氨基酸部位的插入和缺失变化。本研究结果表明 , 节
节麦高分子量谷蛋白 Dx5 t+Dy12t 亚基赋予小麦优良加工品质的主要原因可能与 12 t 亚基与小麦 Dy10 非常相似 ,
导致这一亚基组合更倾向与 Dx5+Dy10 有一定关系。
关键词:节节麦;高分子量谷蛋白基因;克隆;测序
中图分类号:S512.1　　文献标识码:A　　文章编号:1000-2650(2008)01-0001-04
　　普通小麦种子胚乳中的贮藏蛋白主要有谷蛋白
和醇溶蛋白 。其中 ,谷蛋白的含量可占种子蛋白总
量的 70%以上。因此 ,谷蛋白对小麦加工品质有直
接的影响和主要的决定作用[ 1 , 2] 。依据分子量的大
小 ,谷蛋白又可以划分为高和低分子量谷蛋白两大
类 ,前者占种子蛋白含量的 10%左右 ,而后者则达
60%或以上 ,虽然前者的数量远不及后者 ,但对小麦
加工品质的影响比后者的作用更大[ 1 , 2] 。
第 26 卷　第 1 期
2008 年 3 月 　　　　　　　　 　
四川农业大学学报
Journal of Sichuan Ag ricultural University
　　　　　　　　 　Vol.26 No.1
Mar.2008
收稿日期:2007-12-19
基金项目:国家自然科学基金(30370882 , 30671272);教育部全国高等学校优秀博士论文作者专项基金(200458);四川
省青年基金(04ZQ026-040);四川省教育厅科研项目。
DOI :10.16036/j.issn.1000-2650.2008.01.007
在六倍体普通小麦(Tri ticum aest ivum , AABB-
DD , 2n=6x=42)的 1A ,1B和 1D染色体长臂上 ,各
有1个编码高分子量谷蛋白亚基的基因位点 ,分别
称为 Glu -A 1 , Glu-B 1和 Glu -D1。每个基因
位点可分别编码 2个高分子量谷蛋白亚基 ,其中 1
个分子量较大的被称为 x 型亚基 ,而分子量较小的
1 个被称 为 y 型 亚基[ 3 , 4] 。节 节麦(Aegi lops
tauschii ,DD ,2n=2x =14)是六倍体普通小麦 D 染
色体组的二倍体祖先供体物种。在节节麦中也有 1
个编码高分子量谷蛋白亚基的基因位点 ,称为 Glu
-D1 t ,位于 1D 染色体长臂上[ 5] 。在节节麦 D 染
色体中存在很多高分子量谷蛋白的等位变异类型 ,
如 Dx1.5＊t +Dy12.3t , Dx1.5 t +DyT2 t , Dx1.5 t +
Dy10.3t , Dx1.5t +Dy10.3＊t , Dx1.5t +Dy12.3t ,
Dx1.5t+Dy12.4t ,Dx1.5 t+Dy12.5 t , Dx2 t+DyT2t ,
Dx2 t+Dy12 t , Dx2 t +Dy10 t , Dx2t +Dy11t , Dx2t +
Dy12.4＊t , Dx2 t+DyT2t , Dx2.1t +Dy10.1 t , Dx2.1 t
+Dy10.3 t , Dx2.1t +Dy10.4 t , Dx2.1 t +Dy10.5t ,
Dx2.1t+DyT2 t , Dx3 t+Dy10t ,Dx3t+Dy10.3 t , Dx3 t
+Dy10.5t , Dx3 t +Dy11t , Dx3t +Dy12 t , Dx3t +
DyT2
t ,Dx4.1 t+Dy10t ,Dx4t+Dy10 t , Dx5 t+Dy10t ,
Dx5 t+Dy12t , Dx5 t+Dy12.2 t , Dx5.1 t+Dy10.2 t 和
Dxnull
t+Dy12.1＊t等 ,而这些等位变异类型中的绝
大多数仅存在于节节麦 D染色体组中 ,而在普通小
麦 D染色体组中是没有的[ 5-7] 。因此 ,这些节节麦
所特有的高分子量谷蛋白等位变异类型是改良普通
小麦加工品质的重要基因来源[ 8-10] 。为了充分认
识和利用这些特有遗传等位变异类型 ,研究者们利
用人工合成六倍体小麦的方法合成了一系列硬粒小
麦-节节麦的双二倍体 ,发现节节麦中的高分子量
谷蛋白亚基均可在六倍体人工合成小麦的遗传背景
下正常表达[ 8-10] 。在研究中发现 , 用含 Dx5t +
Dy12t 和 Dx1.5t+Dy10t 亚基的节节麦与硬粒小麦
形成的人工合成六倍体小麦的加工品质参数和面包
体积优于含其他高分子量谷蛋白亚基的节节麦所形
成的六倍体小麦[ 8] 。
研究表明 ,在普通小麦中 D染色体组编码的高
分子量谷蛋白亚基组合 Dx5+Dy10 比其他类型的
亚基组合具有更优良的加工品质[ 11] 。在前期研究
中 ,我们发现 1份节节麦材料的高分子量谷蛋白亚
基组成为 Dx5 t+Dy12 t ,在同一 SDS -PAGE胶上 ,
Dx5与 Dx5t 具有相同的迁移率 , Dy12 t 与 Dy10 的
迁移率存在明显差异[ 12] 。因此 ,为了认识节节麦中
这一亚基组合与 Dx5+Dy10亚基组合的关系 ,更好
的利用于小麦品质遗传改良 ,本文对 Dx5t+Dy12 t
亚基组合中的 Dy12 t 亚基进行了克隆和测序 ,以期
认识 Dx5 t+Dy12 t亚基品质表现突出的分子基础 。
1　材料与方法
1.1　材　料
节节麦材料 As63具有 Dx5 t+Dy12 t亚基组成 ,
是四川农业大学小麦研究所资源研究室从加拿大收
集的节节麦材料中的其中一份[ 12] 。
1.2　方　法
1.2.1　SDS-PAGE分析
按照Yan等的方法[ 13]对种子蛋白进行提取 ,以
小麦品种中国春(Axnull ,Bx7+By8 ,Dx2+Dy12)和
川育 12(Ax1 ,Bx7+By8 ,Dx5+Dy10)进行 10%的
SDS-PAGE分析。
1.2.2　基因组 DNA 提取及 PCR扩增
采用 2×CTAB 法进行基因组 DNA 提取。利
用 1对扩增 HMW -GS 基因编码区的特异性引物 ,
P1F , 5 -ATGGCTAAGCGGT TGG TCCT -3 ,
P1R , 5 -GGCTAGCCGACAATGCGTCG -3 ,以
As63的基因组 DNA 为模板进行扩增。PCR反应
体系及扩增条件参照 Yan等[ 13] 的方法进行 ,在 50
μL 反应体系中 , 包括 1.25 U 的 ExTaq 酶 , 0.2
mmol/L 的各种 dN TP ,引物各 1μmol/L ,模板 DNA
200 ～ 300 ng , PCR条件为 94 ℃预变性 5 min ,然后
以 94 ℃变性 40 s ,68 ℃退火和延伸 8min进行24个
循环 ,最后以 68 ℃延伸 15 min 结束 ,扩增产物于
0.8%的琼脂糖凝胶中电泳检测并回收。
1.2.3　PCR产物克隆 、序列测定与分析
PCR扩增产物回收纯化后 ,与 pMD18-T 载体
(大连宝生物公司)连接 ,转化并筛选阳性克隆。参
照 Yan等[ 13]的方法制备系列梯度亚克隆 ,筛选差异
在 300 ～ 400 bp的克隆 ,分别测序 ,然后进行序列拼
接 。序列分析与比较采用 NCBI 网址(http://
www .ncbi.nlm .nih.gov)的相关软件。
2　结果与分析
2.1　SDS-PAGE分析 As63的高分子量谷蛋白亚
基组成
SDS-PAGE 结果显示(图 1), As63 含有的
Dx5t与普通小麦川育 12 的 Dx5+Dy10 组合中的
Dx5具有完全相同的电泳迁移率 ,而 Dy12 t与其中
的 Dy10迁移率差异较大 ,而与普通小麦中国春的
Dx2+Dy12亚基组合中的 Dy12 迁移率没有差异 ,
进一步证明了 As63具有的高分子量谷蛋白亚基组
成为 Dx5 t+Dy12 t。
2　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　四川农业大学学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 26 卷
图 1　SDS-PAGE 分析节节麦 As63 的
高分子量谷蛋白亚基组成
1.川育 12;2.As63;3.中国春
Figure 1　Analysis of HM W glutenin composition of
Aegilops tauschii accession As63 using SDS-PAGE
1.Chuanyu12;2.As63;3.Chinese spring
2.2　PCR扩增和克隆 As63的 12t 高分子量谷蛋白
亚基基因
利用扩增小麦高分子量谷蛋白基因编码区的引
物 ,在节节麦材料 As63中分别扩增出了 2个 DNA
片段 ,大小分别为 2.5 kb 和 2.0 kb(图 2),其中的
2.5 kb片段与小麦 x 型高分子量谷蛋白亚基基因的
片段大小相当 ,而 2.0 kb片段与小麦 y 型基因的片
段大小相当 ,故回收 2.0 kb片段(图中箭头所示)并
克隆到 pMD -18T 载体 , 转化大肠杆菌菌株
DH10B ,获得阳性克隆 ,此阳性克隆被进一步用作亚
克隆 ,选取差异在 300 ～ 400 bp的亚克隆 ,分别进行
测序 ,然后对序列进行拼接获得全序列 。
图 2　PCR扩增节节麦 As63 的高分子量谷蛋白基因
1.DNA 分子量标准;2.As63
Figure 2　PCR amplification of HMW glutenin genes
from Aegilops tauschii accession As63
1.DNA Marker;2.As63
2.3　As63的 12 t高分子量谷蛋白亚基基因序列比
较与分析
根据通用三联体密码 ,将测得的 Dx5t+Dy12 t
亚基组合中的 Dy12 t亚基的核苷酸序列翻译为氨基
酸 ,然后与小麦Dy10[ 14]和Dy12[ 15]亚基的氨基酸序
列进行比较。从图 3 可以看出 ,节节麦 Dy12t 与小
麦 Dy10的差异非常小 ,而与 Dy12 的差异非常大。
Dy12t与 Dy10的氨基酸数目完全一致 ,整个编码区
均为 648个氨基酸 ,二者的差异仅在于 4 个部位氨
基酸的替换 ,其中 1 个位于 N 端区 ,另外 3个位于
重复区;而 Dy12t 与 Dy12的差异比较大 ,不仅表现
在氨基酸的替换上 ,二者之间分别有 12个部位的氨
基酸发生替换 ,其中 1个位于 N 末端区 ,另外 11个
位于重复区 ,同时表现在氨基酸数目不同 , Dy12的
氨基酸总数为 660个 ,Dy12比 Dy12 t多 2个六肽重
复单元外加 2个氨基酸 ,同时 1个部位的 2个氨基
酸缺失 。
3　讨　论
在本研究中 ,我们对来自节节麦 Dx5t +Dy12t
亚基组合中的 Dy12t 亚基基因进行了克隆和测序 ,
结果表明它与普通小麦 Dx5+Dy10亚基组合中的
Dy10[ 14] 氨基酸序列非常相似 ,它们的氨基酸数目
相等 ,仅有 4个氨基酸发生替换 ,但也就是这 4个氨
基酸的差异 ,直接导致了它与 Dy10在 SDS-PAGE
上电泳迁移率的差异 。虽然 Dy12t 与 Dy12[ 15]的氨
基酸序列差异较大 ,二者的差异不仅表现在氨基酸
的替换上 ,数目达 12个之多 ,同时还有 2 个六肽的
缺失 ,但二者在 SDS -PAGE上电泳迁移率的却没
有明显的差异 。这说明 SDS-PAGE 所反应的电泳
迁移率差异与高分子量谷蛋白亚基氨基酸序列的差
异可能没有直接的对应关系 ,即使是电泳迁移率没
有差异的蛋白亚基 ,它们的分子序列也可能存在较
大的差异;或者是电泳迁移率差异较大的蛋白亚基 ,
它们的分子序列差异也可能很小。产生以上的结
果 ,可能与 SDS -PAGE 电泳分离蛋白质主要与蛋
白亚基的分子量有关 ,而与蛋白亚基所带的电荷无
关 ,也即与氨基酸的极性无关。
前人研究认为节节麦 Dx5 t+Dy12t亚基组合具
有改良小麦加工品质的良好潜力[ 8 ,9] ,本文的研究
结果表明 ,该组合中的 Dy12t 与 Dx5+Dy10 亚基中
的 Dy10更相似而与 Dy12差异较大 ,导致了节节麦
中存在的这一特有的亚基组合可能更类似于普通小
麦中存在的具有优良品质的 Dx5+Dy10亚基。
参考文献:
[ 1] 　Kreis M , Shew ry P R , Forde B G , et al.S t ructure and evolu-
tion of seed storage proteins and thei r genes w ith particular refer-
ence to those of wheat , barely and rye[ J] .O xford S urveys of
3第 1 期　　　　代寿芬(等):节节麦高分子量谷蛋白 Dx5 t+Dy12 t亚基组合中 Dy12 t亚基的序列测定与分析　　　　　　
图 3　节节麦 Dy12t 与小麦 Dy10和 Dy12 亚基的氨基酸序列比较
“＊”指示 Dy12t与 Dy10 间的氨基酸替换;“△”指示 Dy12 t与 Dy12 间的氨基酸替换;方框和“.”分别表示 Dy10 和 Dy12t 与
Dy12相比较, Dy12 氨基酸的增加 , Dy12t和 Dy10氨基酸的缺失;“-”指示 Dy10和 Dy12氨基酸序列与Dy12t一致。
Figure 3　A Comparison among HMW glutenin Dy12 t of Aegilops tauschii
and Dy10 and Dy12 of Triticum aestivum at amino acid sequence
Stars and triangle ar rowheads indicted amino acids replacement between Dy12 t and Dy10 , and between Dy12t and Dy12 , re-
spectively;boxes and do ts indicted the amino acids insertion in Dy12 , and deletion in Dy12t and Dy10 , respectively;short bars in-
dicated the identity amino acid in Dy12 t , Dy10 and Dy12.
Plant Molecu lar a nd Cell Biology , 1985 , 2:253-317.
[ 2] 　Payne P I , Harri s P A , Law C N , et al.The high molecular-
weigh t subunit s of glu tenin:st ructu re , genetics and relationship
to bread-making quality [ J] .Annals Tech nology Agricu lture ,
1980 , 29:309-320.
[ 3] 　Law rence G J , Shepherd K W.C hromosomal location of genes
cont rolling seed proteins in species related to wheat[ J] .Theoret-
i ca l an d App lied Genet ics , 1981 , 59:25-31.
[ 4] 　Payne P I , Law C N , Nudd E E.Cont rol by homoloeologous
group 1 ch romosomes of the high-molecular-weigh t subunit s of
glutenin , a major protein of w heat endosperm[ J] .Theoretica l
and Applied Genetics , 1980 , 58:113-120.
[ 5] 　Lagudah E S , Halloran G M .Phylogenetic relat ionships of
Tri ticum tauschi i the D genome donor to hexaploid w heat 1
Variat ion in HMW subunit s of glu tenin and gliadins[ J] .Theo-
ret ical and Applied Genet ics , 1988 , 75:592-598.
[ 6] 　William M D H M , Peńa R J , Mujeeb-kazi A.Seed protein and
isozyme variations in Tri ticum tauschi i (Aegi loips squar rosa)
[ J] .Theoret ical and A pplied Genet ics , 1993 , 87:257-263.
[ 7] 　Yan Y M , Hsam S L K , Yu J Z , et al.Allelic variat ion of the
HMW glutenin subunit in Aegi lops tausch ii accessions detected
by sodium dodecyl sulphate(SDS-PAGE), acid polyacrylamide
gel(A-PAGE)and capillary electoresis[ J] .E uphytica , 2003 ,
130:377-385.
[ 8] 　Peńa R J , Zaroco Hernandez J , Mujeeb-kKazi A.glutenin sub-
unit composit ion and bread baking quality characteristics of syn-
thetic hexaploid w heats derived f rom Tri ticum turgidum ×
Tri ticum tausch ii(Coss.)schamal crosses[ J] .Journa l of Cere-
al Science , 1995 , 21:15-23.
[ 9] 　Hsam S L K , Kief fer R , Zeller F J.Significance of Aegi lops
tausch ii glutenin genes on breadmaking properties of w heat[ J] .
Cerea l Chemistry .2001 , 78(5):521-525.
[ 10] 　Lagudah E S , Macri tchie F , Halloran G M.The influence of
high-molecular-weight subunit of glutenin f rom Trit icum
tausch ii on flour qualit y of synthet ic hexaploid w heat[ J] .Jour-
na l of Cerea l S cience , 1987 , 5:129-138.
[ 11] 　Weegels P L , Hamer R J , Schof ield.Function proterties of wheat
glutenin[ J] .Journal of Cereal Science , 1996 , 23:1-18.
[ 12] 　颜泽洪.山羊草物种高分子量麦谷蛋白基因的分子克隆[ M ] .
北京:高等教育出版社 , 2005.26-33.
[ 13] 　Yan Z H , Wan Y F , Liu K F , et al.Ident ification of a novel
HMW glu tenin subunit and comparison of it s amino acid sequence
wi th those of homologous subunit s[ J] .Ch inese Science B ul letin ,
2002 , 47(3):220-225.
[ 14] 　Thompson R D , Bartels D , Harberd N P.Nucleotide sequence of
a gene from chromosome 1D of w heat encoding a HMW -
glutenin subunit[ J] .Nucleic Acids Research , 1985 , 13:6833-
6846.
[ 15] 　Anderson O D , Greene F C , Yip R E, et al.Nucleot ide sequences of
the two high-molecular-weight glutenin genes f rom the D-genome of
a hexaploid bread wheat , Tr iticum aest ivum L.cv Cheyenne[ J] .
Nucleic Acids Research , 1989 , 17(1):461-462.
(本文审稿:刘登才)
4　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　四川农业大学学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 26 卷