全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 3期，2008年 6月404
与番茄花柄脱落相关的多聚半乳糖醛酸酶的分离纯化和特性
齐明芳，徐杨，李天来 *，许涛
沈阳农业大学园艺学院，辽宁省设施园艺重点实验室，沈阳 110161
提要：为弄清番茄花柄脱落相关酶——多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase, PG)的性质，采用离体培养条件下经乙烯处
理的番茄花柄，分离和纯化了多聚半乳糖醛酸酶并测定其性质。结果表明 ：用Sephadex G-75凝胶过滤层析和CM Sepharose
CL-6B阳离子交换层析方法可分离纯化得到分子量约为 30.2 kDa的多聚半乳糖醛酸酶，纯化倍数为 30.85；纯化的PG活
性最适 pH值为 5.0，最适反应温度为 40 ℃；Km值为 26.14 mg·mL-1；1 mmol·L-1 Ca2+、Cu2+、Ba2+、Co2+和Mn2+可抑制 PG
活性，而 1 mmol·L-1的Mg2+、K+、Fe2+、Zn2+、Fe3+促进 PG活性，20 mmol·L-1的 Fe2+和 Fe3+促进效果尤为显著。
关键词：番茄花柄；脱落；多聚半乳糖醛酸酶；纯化；酶的性质
Separation, Purification and Characterization of Polygalacturonase of Tomato
Pedicel Related to Abscission
QI Ming-Fang, XU Yang, LI Tian-Lai*, XU Tao
Key Laboratory of Protected Horticulture of Liaoning Province, College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang
110161, China
Abstract: In order to clarify the characterization of the polygalacturonase (PG) related to abscission in tomato
pedicel abscission zone, a polygalacturonase was separated and purified from the ethylene-treated tomato pedicels
cultured in vitro and characterized. The results indicated that the molecular mass of the purified polygalactur-
onase was 30.2 kDa and the extent of purification was 30.85-fold by Sephadex G-75 chromatography gel and
CM Sepharose CL-6B ion exchange chromatography. The pH optimum for activity was determined to be 5.0,
temperature optima to be 40 ℃ and Km was 26.14 mg·mL-1. The enzyme activity was inhibited by 1 mmol·L-1
Ca2+, Gu2+, Ba2+, Co2+ and Mn2+, and was activated by 1 mmol·L-1 Mg2+, K+, Fe2+, Zn2+ and Fe3+, especially by 20
mmol·L-1 Fe2+ and Fe3+.
Key words: pedicel of tomato; abscission; polygalacturonase; purification; characterization of enzyme
收稿 2007-10-30 修定 2008-04-03
资助 国家自然科学基金( 3 0 5 7 1 2 6 5 )、教育部博士点基金
( 2 0 0 4 0 1 5 7 0 0 4 )和沈阳农业大学青年教师科研基金
(2 0 0 5 0 2 7 )。
* 通讯作者(E-mail：ltl@syau.edu.cn；Tel：024-88487166)。
番茄栽培中常因落花和落果而影响产量，尤
以设施番茄栽培为重，长期以来受到生产者的极
大关注。许多研究表明，植物器官脱落与其离区
细胞壁降解酶系统密切相关，其中多聚半乳糖醛
酸酶(polygalacturonase, PG)活性升高与植物器官离
区脱落进程相一致，且位于细胞分离的部位
(Bonghi等 1992；Taylor等 1993；Tucker等 1984)，
被认为是植物离区发生脱落的主要水解酶之一。
有关多聚半乳糖醛酸酶的研究，目前已经深入到
基因水平，现已在番茄中确定了 7个多聚半乳糖
醛酸酶基因，即：TAPG1、TAPG2、TAPG3、
TAPG4、TAPG5、TAPG6与 TPG7，而且明确
了 TAPG1、TAPG2、TAPG4和 TAPG5在乙烯诱
导的叶片和花柄脱落区中表达(Hadfield和 Bennett
1998；Kalaitzis等 1997；Hong和 Tucker 1998)。
但这些基因的表达非常复杂，现仍未明确在番茄
花柄脱落中起决定作用的基因，尤其是在短期内
尚难以通过基因工程方法控制番茄花柄脱落(王彦
昌等2003)，因此采取一些措施调控多聚半乳糖醛
酸酶的活性，以达到防止番茄花柄脱落的目的仍
不失为一种有效方法之一。然而，有关多聚半乳
糖醛酸酶的性质尚不够清晰，特别是尚未见到有
关番茄花柄中多聚半乳糖醛酸酶纯化及其性质研究
的报道。本文对番茄离体花柄的多聚半乳糖醛酸
酶进行了分离和纯化，并对其一些性质进行了研
究，以期能为番茄花柄脱落调控的深入研究建立
基础。
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材料与方法
番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)品种为
‘辽园多丽’，在日光温室内育苗和栽培，其方
法与一般生产相同。参照王彦昌等(2003)文中的
方法，于番茄开花当天上午剪取各株相同或相近
位置花序上正常开放的花，放入盛有蒸馏水的烧
杯中，用自来水冲洗后，再用蒸馏水冲洗 3 次，
剪去花柄上端花冠，只留花柄部分，插入装有
1%琼脂培养基的培养皿中。并将其放入含有 20
µL·L-1乙烯培养箱中，于 25 ℃下恒温培养，连续
照光 24 h，光照强度为 32 µmol·m-2·s-1。花柄离
区发生分离时，取脱落区上下 1 cm处的花柄贮藏
于 - 70 ℃冰箱中，用于多聚半乳糖醛酸酶的提
取。
提取酶时，用 50 mmol·L-1的乙酸钠缓冲液
(pH 5.5)于研钵中研磨离体花柄后，于 4 ℃条件下
以 12 000×g离心 20 min，取上清液在冻干仪上浓
缩，其浓缩物即为多聚半乳糖醛酸酶粗提液，贮
于 4 ℃条件下备用(Zainon 和 Brady 1982)。
酶纯化时，取适量酶的粗提液上样于
Sephadex-G75凝胶过滤层析柱(柱长 100 cm，直
径 1.6 cm)上，用 50 mmol·L-1的乙酸钠缓冲液(pH
5.5)洗脱(流速为 0.2 mL·min-1)，收集有多聚半乳
糖醛酸酶活性的部分，经冻干仪浓缩后再经 CM
Sepharose CL-6B阳离子交换层析纯化，以 50
mmol·L-1的乙酸钠缓冲液(pH 5.5)洗脱(流速为 0.3
mL·min-1)，收集有活性的部分，以冻干仪浓缩，
即为纯化的多聚半乳糖醛酸酶。
测定酶蛋白质分子量时，用12%SDS-聚丙烯
酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法(Shen等 1991)。基
本条件是：12%分离胶，3%浓缩胶，0.1 mol·L-1
pH 8.3的 Tris-甘氨酸缓冲液；考马斯亮蓝 R-250
染色；甲醇:冰醋酸:蒸馏水(1:1:8)脱色(汪家政和范
明 2000) ；标准蛋白采用牛血清白蛋白。蛋白质
含量测定用 Bradford (1976)的方法。
做酶活性最佳反应的pH值试验时，将加入多
聚半乳糖醛酸钠底物的酶液放在以磷酸氢二钠-柠
檬酸缓冲液配制的 pH 3~10，间隔为 pH 0.5的条
件下反应；做酶活性最佳反应温度的试验时，将
加入多聚半乳糖醛酸钠底物的酶液分别放在 30、
40、50、60 ℃条件下反应；做酶活性的最佳热
稳定性试验时，反应前将酶液放在 30、40、50、
60 ℃中保温 1 h后加入多聚半乳糖醛酸钠底物，
再于 40 ℃下反应；做矿质离子对 PG活性的影响
试验时，在加入多聚半乳糖醛酸钠底物的酶液中
分别加入 1、10、20、50 mmol·L-1的MgCl2、
KCl、FeCl3、FeSO4、ZnSO4和 1 mmol·L-1 BaCl2、
CoCl2、MnCl2、CaCl2、CuSO4，而后置于 40 ℃
下反应；反应 3 h后，以 3,5-二硝基水杨酸(DNS)
法(Miller 1959)测定葡萄糖的含量。多聚半乳糖醛
酸酶活性以每分钟催化生成 1 µmol葡萄糖的酶量
为一个酶活单位(U)表示。用比活性(U·mg-1)即每
毫克蛋白所含的酶活性单位数来表示酶的纯度。
结果与讨论
1 PG的纯化和鉴定
PG的粗提液，经 Sephadex G-75凝胶过滤层
析后得到 3个蛋白峰(图 1)，其中第 2个峰酶活性
较高，将其浓缩后上样于 CM Sepharose CL-6B阳
离子交换层析柱上，得到 2个蛋白峰(图 2)，其
中第 1个蛋白峰与酶活性峰相一致，为纯化的 PG
蛋白。分离纯化后的 PG，以聚丙烯酰胺凝胶电
泳检测，得到一条蛋白带(图 3)，其分子量约为
30.2 kDa。各纯化步骤所得到的纯化倍数和回收
率见表 1，以 Sephadex G-75层析柱分级分离的
P G，其纯化倍数达到 1 7 . 3 8 倍；而后以 C M
Sepharose CL-6B柱纯化的倍数为 30.85倍。目
前纯化的倍数较低，这可能是本试验采用的低
温真空浓缩未能使蛋白完全溶解所致。但这一
方法比采用硫酸铵沉淀与丙酮沉淀法浓缩条件下
的 PG活性明显高，是目前研究采用的方法中较
图 1 PG的 Sephadex G-75层析洗脱图
Fig.1 Elution profiles of PG on Sephadex G-75
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图 2 PG的CM Sepharose CL-6B层析洗脱图
Fig.2 Elution profiles of PG on CM Sepharose CL-6B
图 3 PG的聚丙烯酰胺电泳图谱
Fig.3 Electrophorgram of PG by polyacrylamide
表 1 番茄花柄中 PG的纯化
Table 1 Purification of PG from tomato pedicel
纯化步骤 总蛋白量 /mg PG 活性 /U 比活性 /U·mg-1 纯化倍数 回收率 /%
粗提液 1.121 0.97 0.87 1 100
Sephadex G-75 0.041 0.62 15.12 17.38 63.92
CM Sepharose CL-6B 0.019 0.51 26.84 30.85 52.58
佳的方法。此外，番茄离区试材样品量较少，
且色素含量较多，这为酶的纯化也带来很大影
响。
2 PG的特性
2.1 PG的热稳定性 将酶液分别在 30、40、50和
60 ℃条件下保温1 h之后加入多聚半乳糖醛酸钠底
物，再放于 40 ℃条件下反应，以纯化的酶加底
物不进行保温处理，直接于 40 ℃下反应为对照，
测定酶水解底物的剩余活性分别为对照的 96%、
86%、71%和 64% (图 4)。说明 PG在 40 ℃以
上条件下保存 1 h后其活性就会下降，但 30 ℃条
件下的活性下降幅度较小，酶的热稳定性较好。
测定酶活性的结果(图 5)表明，40 ℃下的 PG活性
最高，说明 40 ℃为 PG的最适反应温度。由此可
以看出PG的最适温度较高，在设施番茄栽培中夏
季高温引起番茄大量落花、落果，这与高温下酶
活性的升高有直接关系。
图 4 PG的热稳定性
Fig.4 The heat stability of PG
2.2 PG的最适反应温度 纯化的酶中加入反应底物
后，分别置于 30、40、50和 60 ℃下反应 3 h，
图 5 不同温度对纯化酶活性的影响
Fig.5 Effect of different temperature on PG activity
2.3 PG的最适反应 pH值 PG反应液用磷酸氢二
钠 -柠檬酸缓冲液分别制成 pH 3~10、间隔为 0.5
pH的反应液，并在 40 ℃下反应 3 h后测定不同
pH值下 PG活性的结果(图 6)表明，PG的最适反
应 pH为 5.0，此外，在 pH 9.0处也有一个小的
活性峰。目前从冬枣(于艳军 2000)、番茄(Penna
等 1987；Shen 1991)、苹果(Atkinson等 2002)及
在菜豆、豌豆和棉花几种作物(Pressey和Avants
1977)的果实中纯化得到的与果实成熟相关的PG，
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其最佳 pH 值为 4.5~5.5之间，分子量为 45~46
kDa。而本文从番茄花柄离区中提取纯化的 PG，
其活性的最佳 pH为 5.0，分子量约为 30.2 kDa，
表明高等植物中的PG具有多种同工酶，在不同作
物或者同一作物不同器官中可能存在不同的同工
酶。
2.4 PG的 Km值 以多聚半乳糖醛酸钠为底物，在
10~110 mg·mL-1的底物浓度中反应后测定 PG活
性，按 Lineweaver-Burk法(双倒数作图法)作图的
结果(图 7)表明，以多聚半乳糖醛酸钠为底物的
PG的 Km值为 26.14 mg·mL-1。
图 6 pH对 PG活性的影响
Fig.6 Effect of pH on PG activity
3 金属离子对PG活性的影响
从图 8和图 9可见，(1) 1 mmol·L-1的Mg2+、
K+、Fe 2+、Zn2+、Fe 3+可促进纯化的 PG 活性，
而 1 mmol·L-1的 Ca2+、Gu2+、Ba2+、Co2+、Mn2+
则抑制 PG活性。(2) 1 mmol·L-1的Mg2+促进 PG活
性，但随着Mg2+浓度升高时，反而有抑制作用；
10 mmol·L-1的K+比 1 mmol·L-1的K+对 PG活性的
促进作用更大，而高浓度条件下则有抑制作用；
不仅 1 mmol·L-1 Fe2+、Zn2+、Fe3+对 PG活性有促
进作用，且浓度高的促进作用更大，这 3种离子
均以 20 mmol·L-1的浓度时促进作用最大，尤其加
F e 2 + 的 P G 活性可提高一倍以上。低浓度 ( 1
mmol·L-1)的 Ca2+、Gu2+、Ba2+、Co2+、Mn2+抑
制 PG的活性，其中 Ca2+的结果与我们曾报道的
Ca2+可防止番茄离体花柄脱落的结果一致(齐明芳
等 2007a，b；许涛等 2007)，说明钙抑制脱落
的过程与其直接抑制 PG活性有关，这为生产中
采用钙抑制番茄花柄脱落提供了依据。
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图 7 PG催化多聚半乳糖醛酸钠水解的 Lineweaver-Burk图
Fig.7 Lineweaver-Burk plot of PG in catalysing hydrolysis
of sodium polygalacturonate
图 9 不同浓度离子对 PG 活性的影响
Fig.9 Effect of different concentrations of ion on PG activity
图 8 不同离子对 PG活性的影响
Fig.8 Effects of different ions on PG activity
植物生理学通讯 第 44卷 第 3期，2008年 6月408
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