全 文 ：第 24卷　第 1 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2004 年　1月
Vol.24　No.1　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Jan., 　2004
逆境诱导型启动子 rd29A的克隆及植物表达载体的构建
李　晶　李　杰　关英芝　朱延明
(东北农业大学 , 哈尔滨　150030)
摘　要　根据文献上发表的逆境诱导型启动子 rd29A序列设计并合成了一对引物 , 通过 PCR的
方法从拟南芥基因组中扩增到 rd29A的启动子序列 。根据GenBank中已发表的转录因子 DREB1A
基因的 cDNA序列设计并合成了一对引物 , 通过 RT-PCR的方法从低温处理的拟南芥总 RNA 中
扩增出 DREB1A基因的全长 cDNA片段。以植物表达载体 pBch 为基础 , 构建了由 rd29A调控的
DREB1A基因的植物表达载体 pBDR29A , 为利用 DREB1A基因改良植物抗逆性奠定了物质基础。
关键词　诱导型启动子;rd29A;转录因子;DREB1A基因;载体构建
Cloning of inducible promoter rd29A and
the construction of plant express vector
LI Jing　LI Jie　GUAN Ying-Zhi　ZHU Yan-Ming＊
(Northeast Agriculture University , Harbin 150030)
Abstract　According to the reported sequence of inducible expression promoter rd29A a pair of primer was
designed and synthesized.Using the genomic DNA of Arabdopsis thaliana as templet , fragment of rd29A pro-
moter was amplified through method of PCR.According to the cDNA sequence of transcription factor
DREB1A gene in GenBank a pair of primer was designed and synthesized.Using the total RNA of low tem-
perature treated Arabdopsis thaliana seedling as templet , the full length of cDNA of DREB1A gene was am-
plified through method of RT-PCR.The plant express vector pBch was digested and ligated with the DREB1A
cDNA fragment and rd29A promoter fragment and got the DREB1A gene plant express vector pBDR29A regu-
lated by inducible promoter.
Key words　inducible promoter;rd29A;transcription factor;DREB1A;construction of express vector
　　利用基因工程方法改良植物抗逆性的研究近
年来飞速发展 , 尽管人们已经将大量的抗旱 、抗
寒及抗盐碱的相关基因应用于植物抗逆性的改
良[ 1 ～ 3] , 但多数结果不尽人意 。植物逆境抗性性
状往往是由多基因控制的复杂生命过程 , 通过单
基因改良的方式很难奏效 , 采用调节基因策略 ,
适合的转录因子不失为一个好的选择。转录因子
DREB1A是在拟南芥中克隆并鉴定的[ 4] , 它能在
干旱 、低温及高盐胁迫条件下调控报告基因表达 ,
并在上述逆境胁迫信号传递中起重要作用[ 5 , 6] 。
拟南芥 rd29A 基因的表达受到干旱 、 低温和高盐
的诱导 , 其启动子是植物抗逆性基因工程中理想
的逆境诱导型启动子。本研究从拟南芥中分别克
隆了 DREB1A基因的 cDNA和 rd29A基因的启动子
通讯作者
　第一作者简介:李晶 (1970-), 女 , 博士 , 副教授 , 主要从事植物学教学及植物基因工程的科研。
　收稿日期:2003-06-17
序列 , 并构建了由 rd29A 启动子调控转录因子
DREB1A 基因的植物表达载体 , 为进一步利用
DREB1A基因综合改良植物抗逆性提供物质基础 。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1 植物材料
拟南芥 (Arabidopsis thaliana )为 Columbia 生
态型 。
1.1.2 菌株和质粒
载体 pMD18 T-vector 购自大连宝生物工程有
限公司。大肠杆菌 (Escherichia coli)菌株 DH5α
和质粒 pBch均由东北农业大学生命科学院植物生
物工程研究室保存。
1.1.3　主要生化试剂
Taq酶 、 各种限制性内切酶 、 氨卞青霉素 、
IPTG 、 X-gal等试剂均购自大连宝生物工程有限公
司;T4 DNA 连接酶购自 Promega 公司;TRIzol
Reagent和 AMV逆转录酶购自 Gibco -BRL 公司;
DNA回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公
司;其他各种试剂均为国产分析纯 。
1.1.4　PCR引物
参照所发表的拟南芥 rd29A基因的启动子序
列 , 设计克隆 rd29A 启动子的引物 , 根据后续构
建植物表达载体的需要 , 上游一端加入一个 Hind
Ⅲ位点 , 在下游一端加入了 BamH Ⅰ位点。上游
引物:5′aagctt g ccatagatgc aattcaatc -3′, 下游引
物:5′ggatcc ttccaaagatttttttctttccaa -3′;参照 Gen-
Bank上发表的 DREB1A基因的 mRNA 序列 , 设计
了一对引物 , 并根据后续构建植物表达载体的需
要 , 在上游引物一端加入一个 BamH Ⅰ位点 , 在
下游引物一端加入了 KpnI 位点。上游引物:5′
ggatcc tttcagcaaaccatac -3′, 下游引物:5′ggtac ↑c
ttacactcgtttctcag-3′。引物由大连宝生物有限公司
合成 。
1.2　方法
1.2.1 拟南芥基因组DNA及 cDNA的制备
CTAB法[ 7]提取拟南芥总 DNA。用TRIzol试剂
一步法提取植物总 RNA。将拟南芥幼苗置于 4℃
低温处理 1 h , 取叶片 , 提取总 RNA , 以总 RNA
为模板 , 经反转录得到 cDNA (具体操作按照
AMV逆转录酶使用说明书进行)。
1.2.2　 rd29A启动子的分离 、 克隆和测序
图 1　rd29A基因启动子序列的 PCR扩增
Fig.1　PCR amplification of rd29A gene promoter sequence
M.DL2000 DNA marker;1.阴性对照;2 , 3.PCR产物
以拟南芥总 DNA为模板进行 PCR扩增 。94℃
预变性 10 min;94℃变性 30 s;53℃退火 30 s;
72℃延伸60 s;30个循环;72℃延伸 10 min。RCR
产物经琼脂糖凝胶电泳检查采用上海华舜小量胶
回收试剂盒回收纯化并克隆至 pMD18 T 载体中 ,
命名为 pT29A 。测序由大连宝生物工程有限公司
完成 。
图 2　DREB1A基因 cDNA片段的 PCR扩增
Fig.2　PCR amplification of cDNA fragment of DREB1A gene
M.DL2000 DNA marker;1.阴性对照;2.PCR产物
1.2.3　DREB1A基因的分离 、 克隆和测序
以 cDNA为模板进行 PCR扩增 。94℃预变性
10 min;94℃变性 30 s;56℃退火 30 s;72℃延伸
60 s , 30个循环;72℃延伸 10 min 。同上的方法
将 PCR产物克隆至 pMD18 T 载体中 , 命名为 pT-
DR。测序由大连宝生物工程有限公司完成 。
1.2.4 植物表达载体的构建
pBch为带有CaMV35S 启动子的非特异性植物
表达载体 , 在 35S 启动子下游有 Hind ⅢBamHI 和
KpnI等多克隆位点 , 可供外源基因插入并使其在
植物细胞中表达。用 BamHI、 Kpn I 双酶切质粒
pTDR , 回收 0.8 kb 左右的 DREB1A 基因片断 。
用 HindIII 、 BamHI双酶切质粒 pT29A , 回收 1 kb
左右的 rd29A启动子片段。用 HindIII、 KpnI 双酶
112 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　24 卷
切质粒pBch回收1.16 kb的大片段。将这三个片
段连接 , 将重组质粒命名为 pBDR29A (图 3)。转
化大肠杆菌 DH5α。在含有 Km 的 LB培养基平板
上筛选转化菌落提取质粒进行酶切鉴定 。
2　结果
2.1　rd29A启动子的 PCR扩增
以拟南芥基因组 DNA为模板进行 PCR扩增得
到一个约 1kb 的 DNA 片段 (图 1), 测序结果表
明 , 该片段长度为 960 bp , 与发表的序列[ 8]比较
只有 4个碱基的变化 , 但这 4个碱基并不在启动
子的功能区域内 , 其中 DRE顺式作用元件 、 ABA
反应元件 ABREs 、 TATA box 及 CAAT 框[ 9]均没有
发生任何改变 , 因而不会影响启动子的活性 。将
rd29A片段与 pMD18 T-Vector连接 , 获得的重组质
粒命为 pT29A 。
2.2　DREB1A基因 cDNA的 RT-PCR 扩增
根据报道[ 4] DREB1A基因在拟南芥中 4℃低温
1 h后表达水平达到最高 , 将拟南芥植株于 4℃低
温处理1 h后取其叶片 , TRIzol试剂一步法提取植
物总 RNA , 逆转录酶进行反转录。以反转录得到
的 cDNA第一条链为模板 , 以水代替模板为阴性
对照 , 进行 PCR扩增得到一个约 800 bp 左右的
DNA片段 (图 2), 测序结果表明该片段长度为
862 bp , 与 GenBank上报道的 DREB1A基因的 cD-
NA序列比较 , 长度一致 , 在编码区内只有 2个碱
基的变化 , 但所编码的氨基酸并未发生改变。将
DREB1A的 cDNA 片段与 pMD18 T-vector连接 , 获
得的重组质粒命名为 pTDR。
2.3 植物表达载体的构建
分别将pT29A和pTDR质粒上的 rd29A启动子
片段和 DREB1A基因片段切下 , 将 pBch质粒上的
35 s启动子和几丁质酶基因片段切除 , 回收大片
段 , 将三个片段连接 , 构建一个含有 NPT Ⅱ基因
植物选择标记和 rd29A 启动子调控的 DREB1A 基
因的植物表达载体 , 命名为 pBDR29A (构建过程
见图 3)。重组质粒的酶切鉴定见图 4。用 HindIII
和 BamH Ⅰ双酶切质粒 , 得到 12400 bp 和 1000 bp
两条带。用 BamH Ⅰ和 Kpn Ⅰ双酶切质粒 , 可得
到 12600 bp 和 800 bp 两条带 。证明连接的正确
性。所构建的植物表达载体 pBDR29A可用于农杆
菌介导的双子叶植物遗传转化 , 培育诱导型表达
DREB1A基因的转基因植株 。
图 3 植物表达载体 pBDR29A的构建
Fig.3　Construction of plant expression vector pBDR29A
3　讨论
尽管基因工程方法改良植物抗逆性的研究已
取得了可喜的进展 , 但同时也出现了许多令人困
扰的问题 。较为突出的问题是采用单基因转化策
略提高植物抗逆性对有的基因和植物有效 ,而对另
一些基因和植物则无效 , 另外在提高抗性的同时
也通常会造成植物的畸形发育[ 10] 。针对这些问
1131期　　　　　　　　　　　　李　晶等:逆境诱导型启动子 rd29A的克隆及植物表达载体的构建
图 4 植物表达载体pBDR29A的酶切鉴定
Fig.4　Identification of plant expression vector pBDR29A
M:Marke DL 15000;1:pBch/HindⅢ+KpnⅠ;2.pTDR/ BamHⅠ+
KpnⅠ;3.pT29A/HindⅢ+BamHⅠ;4.pBDR29A/HindⅢ+BamHⅠ;
5.pBDR29A/ BamHⅠ+KpnⅠ
题 , 本研究克隆了转录因子 DREB1A 基因和逆境
诱导型启动子 rd29A。虽然 DREB1A基因是在拟南
芥中发现的 , 但其中与 DNA 结合的 EREBP/AP2
结构域的保守性很强[ 11] , 研究表明含 EREBP/AP2
结构域的转录因子广泛存在于拟南芥[ 12] 、 西红
柿[ 13] 、烟草[ 14] 、水稻[ 15] 、 玉米[ 16]等植物中 , 分
别与细胞发育 、 激素 、 抗病 、 低温以及干旱 、高
盐等信号传递有关 , 在各种基因表达中起重要的
调节作用。这说明 DREB1A 基因及其在植物抗逆
反应中的调控机理可能广泛地存在于双子叶及单
子叶植物中 , 它在改良植物抗逆性的基因工程中
有着可喜的应用前景[ 17] 。 rd29A 启动子目前已有
广泛的研究[ 8 , 9] , 它没有器官专一性 , 受到干旱 、
低温 、盐碱等胁迫的诱导 , 有望避免转基因植株
的畸形发育 。所构建的植物表达载体 pBDR29可
用于农杆菌介导的 DREB1A基因在植物中的诱导
型表达 , 为利用 DREB1A 基因改良植物抗逆性及
进一步探讨DREB1A基因的分子机理奠定了基础。
参　考　文　献
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