全 文 ：农业生物技术学报，2011年，第 19卷，第 4期，第 669~676页
Journal of Agricultural Biotechnology, 2011, Vol.19, No.4, 669~676
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2011.04.011
基金项目：本研究由国家高技术研究发展计划（863)项目（No. 2009AA10Z103)和高等学校博士学科点专项科研基金项目(No.
20106202110007)共同资助
收稿日期：2010-11-16 接受日期：2011-01-19
研究报告
A Letter
利用拟南芥 rd29A启动子驱动 AtNHX1基因提高烟草耐盐性
张俊莲 1，2 王丽 1，3 秦舒浩 1，2 司怀军 1，3 刘玉汇 1 王蒂 1，2*
1甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，兰州 730070；2甘肃农业大学农学院，兰州 730070；3甘肃农业大学生命科学院，兰州 730070
*通讯作者，wangd@gsau.edu.cn
摘 要 拟南芥液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白基因 (AtNHX1) 在植物耐盐机制中有重要作用。为了鉴定
AtNHX1基因功能和创制耐盐烟草新种质，本研究用农杆菌介导法将 rd29A启动子驱动的 AtNHX1基因导
入烟草(Nicotiana tabacum L.)，获得 72株卡那霉素抗性再生植株，17株在MS+85.5 mmol/L NaCl培养基上生
长良好。对其进行 PCR、Southern杂交和 Northern杂交检测，证实 AtNHX1基因已整合到烟草基因组中，并
进行正常转录，且其转录受盐逆境的诱导。在含盐(85.5、171、256和 342 mmol/L NaCl)培养基上进行对照植
株和转基因植株生长及叶片丙二醛含量的分析，结果显示, 转基因株系的生长势和根发生能力明显优于对
照，且叶片丙二醛含量显著低于对照，表明 rd29A启动子驱动 AtNHX1基因的导入和表达可显著提高转基
因烟草植株的耐盐性。结果提示 rd29A启动子驱动的 AtNHX1基因表达单元可在异源植物中正常转录和表
达，可用于植物耐盐基因工程育种。
关键词 烟草，拟南芥液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白基因(AtNHX1)，rd29A启动子，分子检测，耐盐性
The AtNHX1 Gene Drive n by Stress-inducible rd29A Promoter from
Arabidopsis thaliana Can Increase Tobacco Saline Tolerance
Zhang Junlian1, 2 Wang Li1, 3 Qin Shuhao1, 2 Si Huaijun1, 3 Liu Yuhui1 Wang Di1, 2*
1 Gansu Key Laboratory of Crop Genetic & Germplasm Enhancement, Lanzhou 730070, China; 2 College of Agronomy, Gansu Agricultural
University, Lanzhou 730070, China; 3 College of Life Sciences and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China
* Corresponding author, wangd@gsau.edu.cn
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2011.04.011
Abstract The tonoplast Na+/H+ antiporter gene(AtNHX1) of Arabidopsis thaliana playes important roles in saline
tolerance of the plant. In order to identify of AtNHX1 gene function and create new germplasm of tobacco, the
AtNHX1 gene under the control of stress-induced rd29A promoter was transferred into tobacco (Nicotiana tabacum
L.) tissues by Agrobacterium-mediated transformation. A total of 72 regenerated plants resisted to Kanamycin were
obtained, of which 17 grew well in MS medium supplemented with 85.5 mmol/L NaCl. Subsequent PCR, Southern
and Northern hybridizations validated the genomic insertion and normal expression of the AtNHX1 gene in the
transgenic tobacco plants. The up-regulated expression of AtNHX1 gene was induced by salt challenge. The
growth and root development of the transgenic plants were significantly better than that of the controls in the
medium supplemented with 171, 256 and 342 mmol/L of NaCl, while the concentration of malonyldialdehyde in
the leaves of transgenic plants was significantly lower than that in the controls. The results indicated that the
insertion and expression of AtNHX1 gene controlled by rd29A promoter could significantly enhance the salt
tolerance of transgenic tobacco plants. These results revealed that the AtNHX1 gene regulated by rd29A promoter
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
盐渍化土壤可引起植株体内离子不平衡、水分
亏缺及离子毒害(王宝山等, 1997)，导致其生长受抑、
光合作用下降、能耗增加、衰老加速、产量和品质下
降，植株受伤害的主要原因是盐渍化土壤中高浓度
的 Na+毒害所致。植物对 Na+的解毒机制是在根中
将 Na+排除，在茎叶中将 Na+区隔化进液泡，这一功
能的实现是由 Na+/H+逆向转运蛋白(NHX)来完成的
(Schashtman and Liu, 1999; Zhu, 2003; Niu et al.,
1993)。该蛋白普遍存在于盐生植物和耐盐甜土植物
的质膜和液泡膜上，其利用质膜上或液泡膜上质子
泵(H+-ATPase和 H+-Ppase)建立的跨膜质子梯度作为
驱动力，将 Na+运出细胞或转移进液泡(Rausch et al.,
1996; Yamaguchi et al., 2005)。此外，Na+区隔化至液
泡，可作为渗透调节剂，促使细胞从外界胁迫环境中
吸收水份维持渗透平衡，调节细胞质内 pH值和 Na+
浓度(刘岩等, 1997)。
Apse 等 (1999) 证明过量表达拟南芥液泡膜
Na+/H+逆向转运蛋白基因(AtNHX1)的转基因拟南芥
植株，其抗盐能力明显提高，表现为转基因拟南芥植
株能在 200 mmol/L NaCl条件下生长发育，其液泡膜
Na+/H+交换率较非转基因植株显著增高，且其提纯
液泡的 Na+/H+逆向转运蛋白量也显著高于非转基因
植株；Apse等 (2003) 进一步发现该基因的突变体
nhx1 较野生型对盐逆境更为敏感。 Zhang 和
Blumwald(2001)又证实转入外源 AtNHX1基因的番
茄和油菜的抗盐能力明显提高，表现为转基因油菜
能在 200 mmol/L NaCl条件下生长发育，尽管体内积
累了高达其干重 6%的 Na+，但其产量和油的品质却
未受影响；转基因番茄在 200 mmol/L NaCl条件下也
能够正常生长、开花和结实，只是其叶片中 Na+浓度
很高，果实中很低。这些研究结果表明，利用拟南芥
液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白基因进行盐逆境下 Na+
的渗透调控是提高植物耐盐性的重要手段。目前人
们已分离到了多种植物的液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋
白基因，且部分基因已被转入到各类植物中(Chen et
al., 2007; Zhou et al., 2008)，其中来自于拟南芥的
AtNHX1 基因已转入到荞麦(陈利红等, 2007)、黄芪
(赵宇玮等, 2008)、菊苣(赵宇玮等, 2009)、白三叶(赵
桂琴等, 2008)和小麦(Xue et al., 2004)等中，通过盐
逆境下细胞水平、组织水平和植株水平的抗性评价，
均能提高转基因植株的抗盐能力。
启动子是调控基因表达的关键元件，尽管组成
型启动子 CaMV35S是基因工程中使用最多的启动
子，但其非特异性的表达不仅造成植物能量上的过
度消耗，还可能诱发外源基因的沉默 (Matzke and
Matzke, 1995)。拟南芥 rd29A启动子是逆境诱导型
启动子，含有干旱、高盐、低温 ABA诱导表达等相关
的 顺 式 作 用 元 件 (Yamaguchi-Shinozaki and
Shinozaki, 1994)，可用于抗逆基因工程。本研究利用
RT-PCR 技术分离到拟南芥 AtNHX1 基因，构建
rd29A启动子驱动 AtNHX1基因的植物表达载体，通
过农杆菌介导法将其转入烟草，创制抗盐种质，为烟
草抗盐育种提供基础资料。
1结果与分析
1.1转基因烟草植株再生
烟草叶盘与携带 pBINH质粒的农杆菌经过共
培养后，pBINH质粒的 T-DNA片段可转入烟草染色
体中，导致转基因细胞在含 200 mg/L Kan的分化培
养基上形成抗性不定芽 (图 1A)。待其长至 1.0~1.5
cm长时，切下转入附加 200 mg/L Kan和 300 mg/L
Cef的 MS 培养基上诱导生根 (图 1B)，此时携带
AtNHX1基因的转化植株生长正常，可形成舒展根
系，对照植株生长缓慢且无根发生。经过芽分化和根
发生筛选，获得 Kan抗性再生植株 72株。
将这些再生植株转入 MS+85.5 mmol/L NaCl培
养基上，部分再生植株生长缓慢，仅有 17株转化植
株生长较好。表明在烟草叶片转化过程中，利用 Kan
进行烟草转化植株的初步筛选时，存在着高比例的
假阳性。当然，也不排除淘汰植株有可能是转化植株，
但其目的基因表达效率低，耐盐性得不到明显提高。
1.2转基因烟草植株的 PCR鉴定
利用 JCP1和 JCP2特异引物对含盐培养基上表
现较好的转化植株进行 PCR检测。结果发现，17株
都扩增到了 1 617 bp的特异片段，但其中 14株特异
条带清晰，3株很微弱。图 2显示了部分转基因植株
的 PCR扩增结果。
could be normally expressed in heterologous plant and its expression could improve the saline tolerance of the
receipt plant. Therefore, genetic transformation of the AtNHX1 gene can be one of gene-engineering strategies for
breeding saline tolerant crop.
Keywords Tobacco, (AtNHX1) gene, rd29A promoter, Molecular detection, Salt-tolerance
670
图 4 转基因烟草植株 Northern杂交鉴定
A. MS+85.5 mmol/L NaCl培养基上的转基因和对照植株的总
RNA; B. MS+0 mmol/L NaCl和MS+85.5 mmol/L NaCl培养基
上的转基因和对照植株的总 RNA。1：非转基因烟草盐胁迫(A)
和非盐胁迫(B)；3、5、7号转基因烟草盐胁迫(A、B5-1和 7-1)和非盐
胁迫(B5-0和 7-0)
Figure 4 Northern blot of transgenic tobacco
A.Total RNA of transgenic tobacco and non-tobacco on MS+
85.5 mmol/L NaCl; B.Total RNA of transgenic tobacco and
non-tobacco on MS+ 0 mmol/L and MS+ 85.5 mmol/L NaCl.
1: Non-transgenic tobacco treated(A)and untreated (B) by NaCl;
3, 5, 7: Transgenic tobacco treated (A, B5-1 and 7-1) and untreated
(B5-0 and 7-0) by NaCl
图 2转化烟草植株的 PCR检测
M：DNA marker；1：pGEM-AtNHX1 质粒；2：非转基因植株；
3~10：转基因植株
Figure 2 Detection of transgenic tobacco by PCR
M: DNA marker; 1: Plasmid pGEM-AtNHX1; 2: Non-transgenic
tobacco; 3~10: Transgenic tobaccos
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
2000
1500
700
200
bp
M 1 2 3 5 7 8 9bp
21226
4268
5148/4973
3530
2027/1904
1375
1584
图 3转基因烟草植株 Southern杂交检测
M：DNA marker，地高辛标记；1：NotⅠ酶切 pGEM-AtNHX1质
粒；2：非转基因植株基因组 DNA HindⅢ酶切；3、5、7~9：转基
因植株基因组 DNA HindⅢ酶切
Figure 3 Identification of transgenic tobacco by Southern blot
M: DNA marker, digoxigenin labeled; 1: Plasmid pGEM-AtNHX1
digested by Not Ⅰ ; 2: Genome DNA of non-transgenic tobacco
digested by HindⅢ ; 3, 5, 7~9: Genome DNA of transgenic
tobacco digested by HindⅢ
1.3转基因烟草植株 Southern杂交鉴定
为进一步确证外源 AtNHX1基因在烟草基因组
中的整合及插入拷贝数，选择 PCR鉴定为阳性的部
分植株 (3、5、7、8和 9号) 的基因组 DNA进行 Hind
Ⅲ酶切，以标记的探针与其进行 Southern杂交。结果
发现，PCR扩增谱带清晰的 3株转基因植株 (3、5和
7号)均获得了明显的杂交信号，扩增谱带不清晰的
植株(8和 9号)无杂交信号(图 3)，表明 PCR的鉴定
仍会产生假阳性。进一步分析 Southern杂交结果发
现，3号转基因株系为双拷贝，5和 7号转基因株系
为单拷贝。
1.4转基因烟草植株 Northern杂交鉴定
为了鉴定转基因烟草中 AtNHX1基因能否进行
正常转录，利用 RNA探针标记试剂盒对 T载体上目
的基因的反义 mRNA进行了标记，获得 RNA探针。
将其与 Southern 杂交阳性、并在含 85.5 mmol/L
NaCl培养基上生长的转基因植株和对照植株的总
RNA(图 4A)进行 Northern杂交。结果发现：转基因
植株显示出较强的杂交信号(图 4B)，对照植株无杂
交信号，表明整合在烟草基因组中的拟南芥 AtNHX1
基因可以进行正常转录。进一步对转基因植株的
rd29A启动子特性进行鉴定。结果发现，非盐逆境下
转基因植株 AtNHX1 基因的 mRNA 转录量非常微
弱，而一旦处于盐逆境下，该启动子即可驱动
AtNHX1 基因大量转录(图 4B)，表明本研究使用的
rd29A启动子具有盐逆境诱导特性。
1.5转基因烟草植株耐盐性
阳性转基因植株和对照植株扩繁后，将带芽茎
段分别转入添加 0、171、256和 342 mmol/L NaCl 的
MS培养基上，生长 25 d后发现，转基因植株在含
171 mmol/L NaCl培养基上可保持一定量的生长，此
时植株叶色浓绿(图 5a)，叶片大小和发育正常、根发
生并生长 (图 5b)，未见形态学特征异常；在含 256
mmol/L NaCl的培养基上，植株生长受阻，但仍有一
定生长量，表现为叶片伸展和叶色较浅，有极少量根
发生(图 5c; d)；当 NaCl浓度提高为 342 mmol/L时，
植株生长完全受阻，表现为带芽茎段无生长，不能产
生新的叶片和根(图 5e; f)。
对照植株的抗盐能力则明显较低，在 171
利用拟南芥 rd29A启动子驱动 AtNHX1基因提高烟草耐盐性
The AtNHX1 Gene Driven by Stress-inducible rd29A Promoter from Arabidopsis thaliana Can Increase Tobacco Saline Tolerance 671
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
图 1转化的烟草叶片分化出芽(A)及再生根(B)
1：非转基因植株在MS培养基上；2：非转基因植株在MS+200mg/L Kan；3~4：转基因植株在MS+200 mg/L Kan+300 mg/L Cef上
Figure 1 Shoot differentiation from leaves (A) and rooting (B) of transgenic tobacco
1: Non-transgenic tobacco on MS; 2: Non-transgenic tobacco on MS+200 mg/L Kan; 3~4: Transgenic tobacco on MS+200 mg/L
Kan+300 mg/L Cef
mmol/L NaCl胁迫下，植株生长就明显受阻，表现为
叶片伸展度明显下降，有些叶片边缘甚至有枯死组
织，根的发生完全受阻 (图 5g; h)；在 256 mmol/L
NaCl胁迫下，茎段新叶生长明显受阻，叶片萎蔫、皱
缩严重，无法充分展开，叶缘周围产生枯死组织，部
分叶片枯死，无根发生(图 5i; j)；升高盐浓度为 342
mmol/L时，茎段皱缩失水、死亡。说明外源 AtNHX1
基因的导入可明显提高转化烟草的抗盐性。
在不同 NaCl含量的培养基上胁迫处理第 15天
时，发现对照植株丙二醛(MDA)的含量随 NaCl胁迫
浓度的提高而显著增加，256 mmol/L浓度下的丙二
醛含量是未受胁迫时的 1.9倍，而此条件下转基因植
株的丙二醛含量仅是未胁迫时的 1.23倍，且低盐浓
度(85.5和 171 mmol/L)下转基因植株的丙二醛含量
与未胁迫时差异不显著(P>0.05)(图 6A)。延长胁迫时
间至 30 d，未转基因对照植株丙二醛含量随盐浓度
的升高大幅增加，显著高于转基因植株。在 171
mmol/L NaCl胁迫下，对照植株的丙二醛含量是未胁
迫时的 2.13倍，而转基因植株仅是未胁迫时的 1.66
倍(图 6B)。表明外源 AtNHX1基因的导入，有效降低
了细胞中 Na+的浓度，减弱了其对膜脂的过氧化作
用，减轻了盐对膜的伤害。
2 讨论
利用基因工程改良植物抗旱耐盐性的研究已开
展了许多年，涉及到的外源基因类型有渗透调节物
2027/1904
图 5转基因和非转基因烟草植株 NaCl胁迫下的形态特征
a~f：转基因植株；g~j：非转基因植株
Figure 5 Morphological characteristics of transgenic and non-transgenic tobacco that were stressed by NaCl
a~f: Transgenic tobacco; g~j: Non-transgenic tobacco; a, b, g, h: MS+171 mmol/L NaCl; c, d, i, j: MS+256 mmol/L NaCl; e, f:
MS+342 mmol/L NaCl
672
质、抗氧化酶、转录因子等，结果发现转基因植株的
抗旱耐盐性都得到了不同程度的提高。近年来，人们
揭示了液泡膜 Na+/H+逆向运转蛋白在植物耐盐机制
中的重要作用，发现其不仅可解除 Na+的毒性，而且
还执行细胞体积和渗透调节功能，是保持细胞离子
均衡的关键因素 (Zhu, 2003; Niu et al., 1993; Rausch
et al., 1996;刘岩等, 1997)。自 Apse等(1999)、Zhang
等(2001)、Zhang和 Blumwald(2001)利用 AtNHX1 提
高植物耐盐性的研究以来，人们已将该基因转入多
种重要植物中，Xue等(2004)发现，转 AtNHX1 基因
的小麦株系在 100~150 mmol/L的 NaCl 条件下，其
生长水平、萌发率和粒重明显强于非转基因植株；陈
利红等(2007)发现，转 AtNHX1基因的荞麦植株，在
50~200 mmol/L NaCl条件下，转基因株系无论是叶
片还是根中的脯氨酸含量均高于对照，且在 200
mmol/L NaCl的胁迫下，转基因植株中 Na+含量明显
高于未转基因植株，尤其是在根中，转基因植株 Na+
含量是未转基因植株的 2.22 倍；赵宇玮等 (2008;
2009)发现，转 AtNHX1基因的草木犀状黄芪和菊苣
的愈伤组织相对生长率、叶片中 Na+含量均显著高
于对照，而叶片细胞膜透性值则显著低于对照。另
外，Zhou 等 (2008) 利用含有 BADH、SeNHX1 和
BADH+SeNHX1 基因的三类载体分别转化烟草植
株，获得了单价和双价转基因植株。分析三类转基因
植株在盐逆境下的表现后发现，在 200 mmol/L NaCl
条件下，转 SeNHX1和 BADH+SeNHX1基因植株仅
细胞液渗透压指标间表现出显著性差异，而在叶片
Na+含量、光合速率、PSⅡ活性及植株生物量间均未
表现出显著性差异。本研究进一步建立了 rd29A逆
境诱导型启动子驱动 AtNHX1 基因的表达体系，发
现该启动子可有效调控目的基因在盐逆境下的高效
表达，更有利于转基因植株在盐逆境下的生长发育。
由于转基因植株携带了外源 nptⅡ基因，其表达
产物氨基糖苷 -3-磷酸转移酶可使氨基糖苷类抗生
素(卡那霉素、庆大霉素、新霉素等)磷酸化而失活，从
而使转基因烟草植株在含卡那霉素的培养基上正常
生根和生长。未转化植株由于受到抗生素影响，蛋白
质合成受阻，植株不能正常生根。烟草由于遗传转化
效率高等原因已成为转基因研究的模式植物，在含
卡那霉素的培养基上叶片外植体可形成大量抗性
芽，快速准确地筛选高效表达 AtNHX1基因的抗盐
转基因植株就显得十分必要。本研究在含 85.5
mmol/L NaCl的 MS培养基上进行抗性转基因植株
的初步筛选，可淘汰大量抗性植株，说明该筛选方法
十分有效。对初步筛选的转基因植株进行分子检测
时发现，有 3株却检测不到外源 AtNHX1基因，可能
在诱导分化和抗性筛选时，外植体个别细胞发生了
遗传变异，导致其抗性增强。提示在进行植物基因工
程育种中，要有足够量的遗传转化群体，才能从中筛
选到符合育种目标的转基因植株。
盐逆境下植株生长特性直观描述和生理生化指
图 6 NaCl胁迫 15 d（A）和 30 d（B）时烟草试管苗丙二醛(MDA)含量
Figure 6 Malonyldialdeyde(MDA) contents of tobacco plantlets after 15 d（A）and 30 d（B）treatment under NaCl stress
图 7 pBINH植物表达质粒结构示意图
Figure 7 Sketch map of construction of pBINH expression
plasmid
利用拟南芥 rd29A启动子驱动 AtNHX1基因提高烟草耐盐性
The AtNHX1 Gene Driven by Stress-inducible rd29A Promoter from Arabidopsis thaliana Can Increase Tobacco Saline Tolerance 673
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
标测定是评价转基因植株抗盐能力的重要手段。丙
二醛(MDA)是逆境胁迫下膜脂过氧化的最终产物，
对细胞有毒害作用，它的含量可以反映植物遭受逆
境伤害的程度，是评价植株抗盐能力的指标(龚明等,
1989;肖雯等, 2000)。本研究对含盐培养基上转基因
植株和对照植株的生长和 MDA含量分析后发现，
rd29A启动子驱动的 AtNHX1基因的导入，使转基因
植株在含盐培养基上的生长势明显强于对照植株，
表现在含 256 mmol/L NaCl的培养基上，对照植株叶
片萎蔫、皱缩严重，叶缘周围产生枯死组织，无根发
生；虽然转基因植株的生长也受到明显影响，但仍有
一定生长量，表现为叶片伸展，有极少量根发生。此
浓度下植株生长至第 15天时，转基因植株的 MDA
含量小幅升高，是未受胁迫时的 1.23倍，而对照植株
升高明显，是未受胁迫时的 1.9倍。表明利用 rd29A
启动子驱动 AtNHX1基因可以创制耐盐的转基因烟
草种质。
3材料和方法
3.1材料及试剂
3.1.1植物材料及培养
烟草普通栽培种(Nicotiana tabacum L.)T12无菌
试管苗(抗盐能力见刘玉汇等(2008)报道)由甘肃省作
物遗传改良重点实验室提供。该试管苗带芽茎段在
MS培养基(pH 5.8)上每月继代繁殖 1次。培养条件
为：光照强度 3 000 lx、光周期 14 h/d、温度(25±1)℃。
3.1.2菌株和质粒
AtNHX1基因和 rd29A启动子来源见张俊莲等
(2005a; 2005b) 报道。实验所用菌株为根癌农杆菌
(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404，抗性标记为利
福平(Rif)和链霉素(Str)，含有植物表达载体 pBINH
(图 7)，抗性标记为卡那霉素(Kan)。
3.1.3酶和试剂
限制性内切酶购自 TaKaRa 公司 (大连 )；
TaqDNA聚合酶购自鼎国公司；DNA凝胶用北京天
为时代公司试剂盒回收；抗生素购自 Sigma公司，其
他生化试剂均为国产分析纯试剂。DIG high prime
DNA labeling and detection starter kit Ⅰ和 DIG RNA
labeling kit 分别为 Southern 杂交试剂盒和 RNA 探
针标记试剂盒，购自德国 Roche公司。
3.1.4培养基
培养农杆菌的培养基为 YEP，其组成为：10 g胰
蛋白胨、10 g酵母提取物、5 g NaCl，溶于 1 000 mL
蒸馏水中，pH 7.0；烟草分化培养基为 MS+NAA 0.5
mg/L+6-BA 2.0 mg/L+琼脂 4.5 g/L，根再生培养基为
MS基本培养基。
3.2烟草遗传转化和植株再生
3.2.1农杆菌活化
挑取培养皿平板上含质粒 pBINH的农杆菌单
菌落接种于含 50 mg/L Kan和 50 mg/L Rif的 25 mL
YEP培养基中，28℃、220 r/min摇床上振荡过夜，第
2 天 9:00 取 1 mL 上述培养液加入新鲜的 50 mL
YEP培养基 (含相同抗生素)，继续在相同条件下培
养，当 OD600为 0.5左右时，离心 5 min(5 000 r/min)，
弃上清，用 50 mL MS基本培养基悬浮沉淀备用。
3.2.2侵染和暗培养
取培养 15 d左右的无菌烟草试管苗叶片，剪成
约 0.5 cm2大小，置无菌培养皿中，将上述农杆菌液
倒入其中浸泡 10 min(期间振荡数次)，取出用无菌滤
纸吸干叶片表面菌液，转入烟草分化培养基上，28℃
黑暗下共培养 2 d。
3.2.3转化植株抗性筛选
将暗培养 2 d的烟草叶片转入含有 300 mg/L头
孢霉素 (Cef) 和 200 mg/L Kan的分化培养基上，置
25℃、2 000 lx连续光照下培养，促进烟草叶片分化。
培养期间每 2周更换新鲜培养基。当叶片分化的抗
性芽长至 1.0~1.5 cm时，将芽切下，在附加 200 mg/L
Kan 和 300 mg/L Cef 的 MS 培养基上进行生根筛
选，获得完整植株。Cef 和 Kan 使用量见王丽等
(2006)报道。将 Kan抗性植株转入MS+85.5 mmol/L
NaCl培养基上，进行转基因植株抗盐性初步筛选。
3.3 PCR检测
3.3.1总 DNA提取
利用 CTAB法提取植株总 DNA(王关林和方宏
筠, 2002)。
3.3.2 PCR检测
根据 AtNHX1基因序列，设计 1对特异引物：
JCP1(位置1~27)：5-CGATGTTGGATTCTCTAGTGTCGAAACTG-3；
JCP2(位置1590~1617)：5-CGTCAAGCCTTACTAAGATCAGGAGGG-3。
进行转基因植株 PCR检测，预期扩增片段大小
为 1 617 bp，以非转基因植株和 pBINH质粒为阴性
和阳性对照。PCR扩增体系 25 μL，由 0.5 μL DNA
模板、0.5 μL TaqDNA 聚合酶、2.5 μL 10×buffer、1
674
μL dNTP(10 mmol/L)、1 μL引物 JCP1(10 mmol/L)、1
μL引物 JCP2 (10 mmol/L) 和 18.5 μL ddH2O组成；
PCR反应条件为：94℃预变性 3 min，然后进行 94℃
变性 1 min、50℃复性 1 min、72℃延伸 1 min 30 s下
的 35次循环，最后 72℃下延伸 10 min。
3.4 Southern杂交检测
取 30~40 μg纯化的烟草总 DNA，用 HindⅢ限
制性内切酶 37℃下酶切 12 h，用 0.8%琼脂糖凝胶分
离酶切产物 (1×TAE缓冲液)，然后用毛细管法将
DNA转移到尼龙膜上，再与探针杂交。按照 Southern
杂交试剂盒的使用说明进行探针标记、膜杂交和显
色处理。
3.5 Northern杂交检测
含盐(85.5 mmol/L)培养基上生长的转基因植株
和对照植株叶片用异硫氰酸胍法抽提总 RNA，RNA
完整性用 1%琼脂糖凝胶检测。在 40 μg 总 RNA
中，加入新鲜配制的 Loading Buffer，其用量是 RNA
体积的 2 倍。然后将 65℃条件下变性 10 min 的
RNA在 2%甲醛 -MOPS琼脂糖凝胶上电泳分离。利
用毛细管法将 RNA转至尼龙膜上。用 NcoⅠ酶对
pGEM-AtNHX1切割，酚抽提后乙醇沉淀回收。用
RNA探针标记试剂盒对 1 μg回收产物进行标记，
获得 RNA探针。然后将其与尼龙膜上的 RNA杂交。
探针标记按 RNA探针标记试剂盒使用说明进行，膜
杂交和显色处理与 Southern杂交检测方法一样。
进一步提取正常和含盐(85.5 mmol/L)培养基上
生长的转基因植株以及正常培养基上生长的对照植
株的总 RNA(检测用量约 20 μg)，利用上述方法检测
rd29A启动子诱导 AtNHX1基因的表达情况。
3.6转基因植株耐盐性表现
3.6.1含盐培养基上转基因植株生长
将经过分子检测为阳性的转基因植株和对照植
株经过繁殖后转入添加不同浓度(0、171、256和 342
mmol/L)NaCl的 MS培养基上培养，每瓶接种 1株，
每个处理 25株，重复 3次。生长至 25 d时，观察其在
含盐培养基上的生长和生根情况。
3.6.2含盐培养基上转基因植株丙二醛含量测定
转基因植株和对照植株在不同浓度含盐培养基
上生长至 15和 30 d时，每个处理随机选择 10株、重
复 3 次，测定其丙二醛含量(赵世杰等, 1994)，利用
SPSS13.0数据分析软件进行方差分析。
参考文献
Apse M.P., Aharon G.S., Snedden W.A., and Blumwald E., 1999,
Salt tolerance conferred by overexpression of a vacuolar
Na+/H+ antiport in Arabidopsis, Science, 285(5431): 1256~1258
Apse M.P., Sottosanto J.B., and Blumwald E., 2003, Vacuolar
cation/H+ exchange, ion homeostasis, and leaf development
are altered in a T-DNA insertional mutant of AtNHX1, the
Arabidopsis vacuolar Na+/H+ antiporter, Plant Journal, 36
(2): 229~239
Chen H., An R., Tang J. H., Cui X. H., Hao F. S., Jia C., and
Wang X.C., 2007, Over-expression of a vacuolar Na+/H+
antiporter gene improves salt tolerance in an upland rice,
Molecular Breeding, 19(3): 215~225
Chen L.H., Zhang B., and Xu Z.Q., 2007, Genetic transformation
of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) with
AtNHX1 gene and regeneration of salt-tolerant transgenic
plants, Chinese Journal of Biotechnolog, 23(1): 51~60(陈利
红,张波,徐子勤, 2007, AtNHX1基因对荞麦的遗传转化
及抗盐再生植株的获得,生物工程学报, 23(1): 51~60)
Gong M., Ding N.C., He Z.Y., and LiuY.L, 1989, Correlation be-
tween lipid preoxidation damage and ultrastructural changes
of mesophyll cells in barley and wheat seedlings during salt
stress, Acta Botanica Sinica, 31(11): 841~846(龚明,丁念诚,
贺子义,刘友良, 1989,盐胁迫下大麦和小麦叶片脂质过
氧化伤害与超微结构变化的关系 , 植物学报 , 31(11):
841~846)
Liu Y., Peng X.X., Xie Y.J., and Dai J. R., 1997, Advance in ge-
netic engineering of osmotic stress tolerance, Biological En-
gineer Progress, 17(2): 30~37(刘岩,彭学贤,谢友菊,戴景
瑞, 1997,植物抗渗透胁迫基因工程研究进展,生物工程
进展, 17(2): 30~37)
Liu Y.H., Zhang J.L., Wang D., Yang H.Y., and Wang L., 2008,
The study on differences of kanamycin resistance and salt
tolerance of different tobacco varieties, Chinese Agricultural
Science Bulletin, 24(3): 180~185(刘玉汇,张俊莲,王蒂,杨
宏羽,王丽, 2008, 不同烟草品种对卡那霉素抗性及耐盐
性的差异,中国农学通报, 24(3): 180~185)
Matzke M.A., and Matzke A.J.M., 1995, How and why do plant
inactivate homologuous transgenes? Plant Physiology, 107
(3): 679~685
Niu X., Narasimhan M.L., Salzman R.A., Bressan R.A., and
Hasegawa P.M., 1993, NaCl regulation of plasma menbrane
H+-ATPase gene expression in a glycophyte and halophyte,
Plant Physiology, 103(3): 713~718
Rausch T., Kirsch M., Low R., Lehr A., Viereck R., and Zhigang
A.,1996, Salt stress responses of higher plant: the role of
proton pumps and Na+/H+ antiporters, Journal of Plant Physi-
ology, 148: 425~433
利用拟南芥 rd29A启动子驱动 AtNHX1基因提高烟草耐盐性
The AtNHX1 Gene Driven by Stress-inducible rd29A Promoter from Arabidopsis thaliana Can Increase Tobacco Saline Tolerance 675
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
Schashtman D., and Liu W., 1999, Molecular pieces to the puzzle
of the interaction between potassium and sodium uptake in
plants, Trends in Plant Science, 4(7): 281~287
Wang B.S., Zhao K.F., and Zou Q., 1997, Advances in mecha-
nism of crop aslt tolerance and strategies for raising crop salt
tolerance, Chinese Bulletin of Botany,14 (Supplement):
25~30(王宝山,赵可夫,邹琦, 1997,作物耐盐机理研究进
展及提高作物耐盐性的对策 , 植物学通报 , 14 (增刊):
25~30)
Wang G.L., and Fang H.J., ed., 2002, Plant Genetic Engineering
(2nd), Science Press, Beijing, China, pp.742~744; 750~752
(王关林,方宏筠主编,植物基因工程(第二版),北京:科学
出版社, 2002, 742~744; 750~752)
Wang L., Zhang J.L., Wang D., Zang J.W., and Wang P.Y., 2006,
Effects of antibiotics on inhibition of Agrobacterium tumefa－
ciens and differentiation of tobacco leaf, Acta Tabacaria
Sinica,12(1): 32~37(王丽,张俊莲,王蒂,张金文,王沛雅,
2006, 抗生素对根癌农杆菌的抑菌效果及对烟草叶片分
化的影响,中国烟草学报, 12(1): 32~37)
Xiao W., Jia H.X., and Pu L.M., 2000, Studies on physiological
index of some halophytes, Acta Botanica Boreali-Occiden-
talia Sinica), 20(5): 818~825(肖雯,贾恢先,蒲陆梅, 2000,
几种盐生植物抗盐生理指标的研究, 西北植物学报, 20
(5): 818~825)
Xue Z.Y., Zhi D.Y., Xue G.P., Zhang H., Zhao Y.X., and Xia G.
M., 2004, Enhanced salt tolerance of transgenic wheat (Tri－
tivum aestivum L.) expressing a vacuolar Na+/H+ antiporter
gene with improved grain yields in saline soils in the field
and a reduced level of leaf Na, Plant Science, 167 (4):
849~859
Yamaguchi T., Aharon G.S., Sottosanto J.B., and Blumwald E.,
2005, Vacuolar Na+/H- antiporter cation selectivity is regu-
lated by calmodulin from within the vacuole in a Ca2+- and
pH-dependent manner, Proceedings of the National Acade-
my of Sciences of the USA,102(44): 16107~16112
Yamaguchi-Shinozaki K., and Shinozaki K., 1994, A novel
cis-acting element in an Arabidopsis gene is involved in re-
sponsiveness to drought, low-temperature, or high-salt
stress, Plant Cell, 6(2): 251~264
Zhang H.X., Hodson J.N., Williams J.P., and Blumwald E., 2001,
Engineering salt-tolerant Brassica plant: Characterization of
yield and seed oil quality in transgenic plants with increase
vacuolar sodium accumulation, Proceedings of the National
Academy of Sciences of the USA, 98(22): 12832~12836
Zhang H.X.and Blumwald E., 2001,Transgenic salt-tolerant
tomato plants accumulate salt in foliage but not in fruit, Na-
ture Biotechnology,19(8): 765~768
Zhang J.L., Zhang J.W., Chen Z.H., and Wang D., 2005a,
Cloning and sequence analysis of a cDNA encoding Na+/H+
antiporter (AtNHX1) from Arabidopsis thalian under NaCl
stress, Acta Prataculturae Sinica, 14(6): 87~93(张俊莲 , 张
金文,陈正华,王蒂, 2005a, NaCl 胁迫下拟南芥 Na+/H+
逆向转运蛋白基因(AtNHX1)的克隆及其序列分析,草业
学报, 14(6): 87~93)
Zhang J.L., Wang D., Zhang J.W., and Chen Z.H., 2005b, Deter-
mination of promoter activity of rd29A gene of Arabidopsis
thalian using green fluorescent protein and onion epidermal
cell, Plant Physiology Communicatiobs, 41(6): 815~819(张
俊莲,王蒂,张金文,陈正华, 2005b,用绿色荧光蛋白和洋
葱表皮细胞检测拟南芥 rd29A基因启动子活性的方法,
植物生理学通讯, 41(6): 815~819)
Zhao G.Q., Mu P., Wang S.M., and Ren J.Z., 2008, Salt tolerance
of white clover transferred with vacuolar AtNHX1 antiporter
gene, Journal of Agricultural Biotechnology,16(5): 847~852
(赵桂琴,慕平,王锁民,任继周, 2008, 转液胞膜 AtNHX1
基因的白三叶耐盐性研究 , 农业生物技术学报 ,16(5):
847~852)
Zhao S.J., Xu C.C., Zou Q., and Meng Q.W., 1994, Improve-
ments of method for measurement of malondialdehvde in
plant tissues, Plant Physiology Communications, 30 (3):
207~210(赵世杰,许长成,邹琦,孟庆伟, 1994,植物组织中
丙二醛测定方法的改进 , 植物生理学通讯 , 30 (3):
207~210)
Zhao Y.W., Bu H.Y., Hao J.G., Wang Y.J., and Jia J.F., 2008,
Transformation of Astragalus melilotoides Pall with AtNHX1
gene and the expression of salinity tolerance of transfor-
mants, Journal of Molecular Cell Biology, 41 (3): 213~221
(赵宇玮,步怀宇,郝建国,王英娟,贾敬芬, 2008, AtNHX1
基因对草木樨状黄芪的转化和耐盐性表达研究,分子细
胞生物学报, 41(3): 213~221)
Zhao Y.W., Wang Y.J., Bu H.Y., Hao J.G., and Jia J.F., 2009,
Transformation of Cichorium intybus with the AtNHX1 gene
and salinity tolerance of the transformants, Acta Pratacultur-
ae Sinica,18(3): 103~109(赵宇玮,王英娟,步怀宇,郝建国,
贾敬芬, 2009, AtNHX1基因对菊苣的转化和耐盐性研究,
草业学报, 18(3): 103~109)
Zhou S.F., Chen X.Y., Zhang X.G., and Li Y.X., 2008, Improved
salt tolerance in tobacco plants by co-transformation of a-
betaine synthesis gene BADH and a vacuolar Na+/H+ an-
tiporter gene SeNHX1, Biotechnology Leterst, 30(2): 369~376
Zhu J.K., 2003, Regulation of ion homeostasis under salt stress,
Current Opinion in Plant Biology, 6(5): 441~445
676