全 文 ：第 21 卷　第 2 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2001年　4 月
Vol.21　No.2　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Apr., 　2001
羊草种群遗传分化的 RAPD分析 I:扩增片段频率的变化
崔继哲1 , 2　祖元刚1　关晓铎3
(1.东北林业大学森林植物生态学开放实验室 ,哈尔滨 150040)
(2.哈尔滨师范大学生物系 ,哈尔滨 , 150080)
(3.辽宁省经济林研究所 116031)
摘　要　松嫩草原上分布着灰绿型和黄绿型两种叶色类型的羊草 。为进一步明确这两种叶色类
型种群分化的分子基础 ,对其 9个种群 105个个体进行了 RAPD分析 。15个随机引物(10nt)共
扩增出 149个多态性片段 ,总的多态位点为 96.1%;黄绿型与灰绿型种群间在 10.1%的多态性片
段上明显不同;相似生境或同一地域的种群在一些位点上表现出相似或相同的变化;9个种群都
检测到了特异性扩增 。
关键词　羊草;遗传分化;RAPD
GENETIC DIFFERENTIATION IN LEYMUS CHINENSIS
POPULATIONS REVEALED BY RAPD MARKERS
I:VARIATIONON THE FREQUENCIES OF AMPLIFIED FRAGMENTS
CUI Ji-zhe1 ,2　ZU yuan-gang1　GUAN Xiao-duo3
(1.Open Research Laboratory of Forest P lant Ecolo gy , Nor theast Forestry University , Harbin 150040 , China)
(2.Depar tment of Biology , Harbin Normal University , Harbin 150080 , China)
(3.The Research Institute of Ecounomic Forest of Liao ning province 116031)
Abstract　Leymus chinensis is a rhizome grass species , which has 2 leaf-colored types , a g rayish
green and a yellowish green , in the Songnen Plain of China.To reveal the molecular bases of genetic
differentiation between the 2 types , RAPD was conducted on 105 individuals f rom 9 populations by
using 15 primers.RAPD produced 155 amplified f ragments , and to tal percentage of polymorphic loci
is 96.1.10.1%polymo rphic loci were different betw een the 2 types.There w ere similari ties of cer-
tain polymorphic loci among the populations sampled in the similar habitat.There w ere characterized
polymo rphic loci for 9 populations respectively .
Key words　Leymus chinensis;genetic differentiation;RAPD
　　RAPD(Random amplified polymorphic DNA)是
第二代分子标记技术 , RAPD分析非常适合于涉及
大样本 、以种群为单位的种群遗传多样性等方面的
研究[ 1] ,已广泛用于植物分子生态学领域[ 2～ 6] 。羊
草是根茎型禾本科植物 ,在我国广泛分布于内蒙古
和东北地区天然草地 。在不同的土壤 、水分 、温度等
第一作者简介:崔继哲(1962-),女 ,博士 ,副教授 ,现从事植物分子生物学研究。
国家教委跨世纪优秀人才计划基金项目资助
收稿日期:2000-12-10
生态因子作用下 ,在长期的适应和进化过程中 ,羊草
种群产生了不同程度的分化。有报道 ,不同地理种
群的羊草遗传分化具有复杂性 ,在不同的层次上表
现出不同的适应性反应[ 7 ,8] 。在“羊草种群生态型
分化的分子生态学”系统研究中 ,我们通过移栽试
验 、等位酶分析和 RAPD技术 ,分析了黄绿型和灰
绿型两种叶色类型羊草种群的遗传变异性及其分
化 ,发现这两类羊草的分化在这三个层次上是一致
的。本文报道有关 RAPD分析的部分结果 。
1　材料和方法
1.1　样本采集:从栽植于试验园地内的 9个羊草种
群WLMGG 、WLMYG 、CHLG1 、CHLG5 、CHLG6 、
CHLG7 、CHLG8 、CHLY8 和 CHLY9 中 ,各随机选
取15个样株 ,剪取新萌生的嫩叶 ,置 4℃备用 。其
中WLMYG和WLMGG采自黑龙江省肇东五里木
草场草甸中 ,叶色为灰绿型[ 9] ;其它7个种群都来自
吉林省长岭腰井子草场 , CHLY8 和 CHLY9是黄绿
型种群;CHLG1 、CHLG5 、CHLG6 和 CHLG7 的生
境为草甸盐碱土 , CHLG8 、CHLY8 和 CHLY9 生长
于路边的风沙土上 , CHLG8 与 CHLY8 相邻分布 ,
二者叶色不同 。野外采样方式及生境条件详见文
献[ 9 ,10] 。
1.2　DNA 提取:采用 CTAB 法 ,按文献[ 11]进行 。
加入 RNaseA纯化之;0.6%琼脂糖凝胶电泳检测各
模板有无降解;紫外分光光度计测纯度和浓度 ,个别
A260/280值小于 0.6的样品弃之 ,合格样品用 0.1×
TE稀释至 20ng/μl。
1.3　引物筛选及扩增:采用 Operon系列引物共 70
个 ,经 3个模板 3次重复筛选 ,选出能够扩增出稳
定 、清晰 、可重复产物的 15个引物(表 1)用于各种
群样本的扩增 。扩增反应在 PE9600 型 PCR 仪上
进行 。 反 应 体 积 20μl , 其 中 引 物 5pmol/ L ,
dNTP2mmol/ L ,模板 20ng/μl , TaqDNA聚合酶 1U;
扩增程序为:先 94℃ 5min;而后 94℃ 40s , 37℃
1min , 72℃2min , 45个循环;最后 72℃8min。
　　表 1 用于羊草 PCR反应的随机引物及其序列
Table 1　The random primers and their sequences screened for the PCR reaction
引物 Primer 序列 Sequence 引物 P rimer 序列 Sequence
OPA01
OPG06
OPI11
OPI19
OPN01
OPN12
OPN16
OPN19
CAGGCCCTTC
GTGCCTAACC
ACATGCCGTG
AATGTGCGGG
CTCACGTTGG
CACAGACACC
AAGCGACCTG
GTCCGTACTG
OPQ03
OPQ05
OPQ06
OPQ09
OPQ14
OPQ15
OPQ17
GGTCACCTCA
CCGCGTCTTG
GAGCGCCTTG
GGCTAACCGA
GGACGCT TCA
GGGTAACGTG
GAAGCCCTTG
1.4　扩增产物的检测 、记录与分析:扩增产物经 1.
2%的琼脂糖凝胶电泳(含 1μg/ml EB)分离 ,电泳缓
冲液为 1×TBE ,以λDNA/EcoRI+HindIII 为分子
量标准。电泳结果在紫外透射仪上观察拍照 。记录
时只记录那些谱带清晰 、并在重复试验中稳定出现
的带子 ,不分强弱;与空白对照反应产物具有相同迁
移率的带作为污染带 ,不予记录 。分别计算各种群
不同位点上的扩增频率 ,当某一位点上扩增的 DNA
片段出现频率小于 0.99时 ,该位点为多态位点[ 11] 。
多态位点比率 P =具有多态的位点数/检测到的位
点数 。
2　结果分析
2.1 15个寡核苷酸引物共扩增出 155个 RAPD
位点 ,其中单态位点 6个 ,多态位点共计 149个(表
2),总的多态位点的百分率为 96.1%。各引物检测
到的 RAPD位点数在 7 ～ 15之间 ,平均每个引物可
检测出 10个位点;除 OPQ06 扩增的多态位点比率
较低(0.571)外 ,其它 14个引物扩增的多态位点比
率都在 0.8以上 ,其中 11个引物的扩增位点全部为
多态 。
2.2　各种群 RAPD扩增片段频率的变化
随机扩增后 , RAPD谱上一些位点的扩增片段
频率在种群之间表现出一些规律性变化 。羊草 9个
种群在 RAPD谱的 6个位点上有共同的扩增片段 ,
这 6 个位点是 OPA01 -4 、OPG06-12 、OPN12 -
10 、OPQ06-1 、OPQ06-3和 OPQ06-4 。各种群
在这 6 个位点上的扩增频率都为 1.000。统计了
149 个多态位点在羊草不同种群中的扩增片段频
率 ,其中一些代表性的差异扩增片段结果列于表 3
～ 5。
在一些位点上 ,黄绿型种群与灰绿型种群间表
现出明显的差异(表 3)。
2732 期　　　　　　　　　　　　　　崔继哲等:羊草种群遗传分化的 RAPD 分析 I:扩增片段频率的变化
在 OPI11 -04 、OPN01 -10 、OPN16 -3 、
OPQ05-6 、OPQ15-5 、OPQ15-6 、OPQ09-05 位
点 ,黄绿型 2个种群扩增频率为 1.000 ,而灰绿型的
7个种群扩增频率较低或没有扩增。在OPN16-2 、
OPN19-2 、OPQ03-8 和 OPQ15-4位点 ,黄绿型
的2个种群没有扩增 ,扩增片段仅存在于灰绿型的
7个种群中。在 OPQ09-11和 OPQ-12位点 ,虽
然 9个种群都有扩增 ,但黄绿型 2个种群扩增频率
明显高于灰绿型种群 ,而在 OPQ06-6和 OPQ17-
4位点 ,黄绿型种群的扩增频率明显低于灰绿种群 ,
有的甚至没有扩增。这种明显不同的扩增位点占了
整个多态位点的 10.1%。
　　表 2 不同引物在 9个种群中的 RAPD位点数及多态位点比率
Table 2 Loci and proportion of polymorphic loci to total RAPD loci detected
with 15 primers in 9 populations of Leymus chinensis
引物 P rimer 总位点数
To tal loci
多态位点数
Polymo rphic loci
多态位点比率
P
OPA01
OPG06
OPI11
OPI19
OPN01
OPN12
OPN16
OPN19
OPQ03
OPQ05
OPQ06
OPQ09
OPQ14
OPQ15
OPQ17
总 计 total
8
15
10
7
14
11
9
8
9
16
7
12
9
9
11
155
7
14
10
7
14
10
9
8
9
16
4
12
9
9
11
149
0.875
0.933
1.000
1.000
1.000
0.909
1.000
1.000
1.000
1.000
0.571
1.000
1.000
1.000
1.000
0.961
　　表 3 羊草 2类种群间代表性的差异扩增片段
Table 3 　Difference of special fragments detected by RAPDbetween 2 types of L.chinensis populations
位点
Loci
种群 Populations
CHLY8 CH LY9 CHLG8 CHLG1 CHLG5 CHLG6 CHLG7 WLMGG WLMYG
OPI11-4
OPN01-10
OPN16-3
OPQ05-6
OPQ15-5
OPQ15-6
OPN16-2
OPN19-2
OPQ03-8
OPQ15-4
OPQ09-5
OPQ09-11
OPQ09-12
OPQ06-6
OPQ17-4
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
0.000
0.000
0.000
0.000
1.000
0.592
0.592
0.068
0.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
0.000
0.000
0.000
0.000
1.000
0.546
1.000
0.039
0.039
0.229
0.107
0.373
0.000
0.166
0.052
0.052
0.373
0.229
0.166
0.694
0.229
0.297
0.166
0.297
0.452
0.046
0.632
0.000
0.197
0.534
0.313
0.379
0.046
0.452
0.757
0.046
0.313
0.144
0.452
0.117
0.117
0.159
0.203
0.037
0.203
0.117
0.251
0.076
0.167
0.478
0.117
0.478
0.413
0.551
0.257
0.257
0.767
0.000
0.345
0.046
0.458
0.199
0.095
0.095
0.767
0.000
0.095
0.146
0.199
0.111
0.236
0.716
0.111
0.236
0.474
0.054
0.171
0.054
0.236
0.474
0.236
0.474
0.171
0.307
0.231
0.231
0.042
0.086
0.476
0.086
0.649
0.231
0.132
0.18
0.555
0.000
0.180
0.406
0.406
0.584
0.369
0.064
0.131
0.131
0.283
0.064
0.204
0.283
0.283
0.733
0.131
0.283
0.369
0.204
274 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　21 卷
　　在一些位点上 ,检测到相似生境下的种群有相
同或相似的扩增(表 4)。
OPQ09-6和 OPQ14-8位点上的扩增片段不
存在于风沙土上的 3 个种群 CHLG8 、CHLY8 和
CHLY9中 ,而存在于土壤条件为草甸土的其它种群
中;OPN12-3 、OPQ05-5和 OPQ15-3位点 ,在两
个相似立地的种群 CHLG8和 CHLY8中没有扩增;
在OPQ03-7位点 ,CHLG8 和 CHLY8种群扩增片
段频率几近相等 ,明显不同于其它种群。五里木草
原上的 2 个种群 ,WLMGG 和 WLMYG 在 OPQ19
-5位点扩增频率为 1.000 ,明显高于长岭腰井子草
原上的 7个种群;在 OPI19-7 和 OPI19-4位点 ,
扩增片段仅存在于五里木的 2个种群中 ,且频率相
近 ,而长岭腰井子草原上的羊草种群没有扩增。
　　表 4 相似生境种群的特异性扩增
Table 4 Special fragments detected by RAPD in populations of L .chinensis sharing similar habit
位点
Loci
种群 Populations
CHLY8 CH LY9 CHLG8 CHLG1 CHLG5 CHLG6 CHLG7 WLMGG WLMYG
OPQ09-6
OPQ14-8
OPQ03-7
OPN12-3
OPQ05-5
OPQ15-3
OPI19-4
OPN19-5
OPI19-7
0.000
0.000
0.592
0.000
0.000
0.000
0.000
0.592
0.000
0.000
0.000
0.000
0.546
0.655
1.000
0.000
0.271
0.000
0.000
0.000
0.561
0.000
0.000
0.000
0.000
0.373
0.000
0.093
0.534
1.000
0.253
0.046
0.093
0.000
0.534
0.000
0.076
0.037
1.000
0.037
0.354
0.301
0.000
0.751
0.000
0.046
0.199
1.000
0.095
0.146
0.095
0.000
0.257
0.000
0.054
0.385
1.000
0.054
0.307
0.054
0.000
0.171
0.000
0.132
0.769
1.000
0.042
0.649
0.086
0.132
1.000
0.231
0.204
0.369
1.000
0.131
1.000
0.369
1.000
1.000
0.283
　　在不同的位点上 , 9个种群都检测到了特异性
的扩增(表 5)。
CHLY8种群在 OPN01-3 、OPN16-7 、OPQ05
-12 、OPQ09-2 、OPQ09-7和 OPQ17-8位点 ,扩
增片段频率为 1.000 ,其它种群则没有扩增或扩增
频率较低;在OPQ15-1位点上 ,其它种群扩增片段
频率皆为 1.000 , 惟 CHLY8 种群频率较低为 0.
592。
在OPN9-8 、OPQ03-1 、OPQ03-2 、OPQ05-
11 、OPQ09-12 、OPQ17-5和 OPN01-7共 7个位
点上 , CHLY9种群是惟一扩增频率为 1.000的种
群;在 OPG06-9 、OPG06-15和 OPN19-3 位点 ,
仅CHLY9种群没有扩增;在 OPN01-8和 OPA01
-5位点 ,CHLY9种群分别是扩增频率最高和最低
的种群。
CHLG8种群在 OPQ14-9位点没有扩增 ,而在
OPQ17-6位点扩增频率达 1.000。
CHLG1种群在 OPN01-14位点没有扩增 ,在
OPN12-6位点扩增频率为 1.000。
CHLG5种群在 OPQ05-7和 OPQ14-6 位点
扩增片段频率都是 0.751 ,而其它 8个种群在这 2
个位点上的扩增频率都是 1.000;在 OPQ17-5 位
点 ,惟 CHLG5 种群没有扩增 ,而在 OPQ17-9 位
点 ,仅 CHLG5种群存在扩增片段 。
CHLG6种群在 OPQ15-1 位点扩增片段频率
达 1.000 ,其它种群则没有扩增或扩增频率较低;在
OPA01-8位点只有 CHLG6种群有一定的扩增 。
CHLG7是在 OPQ03-6 和 OPQ17-8位点上
惟一没有扩增片段的种群;在 OPI19-2位点 ,其它
种群扩增片段频率都是 1.000 ,而 CHLG7种群为
0.579。
WLMGG种群在 OPQ14-7 位点是惟一没有
扩增的 ,而在 OPQ05-10 位点 ,又是惟一有一定扩
增的种群 ,WLMYG 在 OPI19-3位点是惟一不存
在扩增片段的种群。
3　讨论与结论
羊草是一种长寿命的多年生牧草 ,广泛分布于
欧亚草原区 ,是一种兼性生殖植物 ,以根茎进行无性
繁殖为主 ,同时异交授粉 ,有一定的有性繁殖力。这
种生活史特性使种 、种群产生并维持很高的遗传变
异性。等位酶分析的结果证实了这一点 ,并且不同
叶色类型种群间存在明显的遗传分化[ 10] 。在 DNA
水平上 ,本研究发现 ,RAPD和等位酶揭示出的羊草
遗传多样性格局是一致的 ,由于 RAPD能够检测出
更高的突变比率 ,并且受选择约束较弱[ 13] ,因而由
RAPD检测出的遗传多样性水平更高 。本文 RAPD
扩增的总多态位点百分率为 96.1%, 高于对部分相
同种群的等位酶分析[ 13] ;也高于钱吉等[ 8]对不同种
群羊草的 RAPD分析(71.9%),这与研究[ 8]分析的
2752 期　　　　　　　　　　　　　　崔继哲等:羊草种群遗传分化的 RAPD 分析 I:扩增片段频率的变化
只是种群间遗传变异 ,而未考虑种群内变异有关 。
本研究揭示 ,羊草 RAPD扩增片段的有无及频率的
变化 ,在黄绿型种群和灰绿型种群之间是十分不同
的;相似生境或相同地域种群在一些位点上显现出
了相同或相似的变化;根据一些位点上羊草 RAPD
扩增片段的有无及频率变异能区分鉴别所检测的羊
草 9个种群 。本结果表明 ,与等位酶相比 , RAPD确
实能提供更多的区分种群 、宗(race)的诊断性标
记[ 14 , 15] 。
　　表 5 9 个种群的特异性扩增
Table 5 Special fragments detected by RAPD in 9 populations of Leymus chinensis
位点
Loci
种群 Populations
CHLY8 CH LY9 CHLG8 CHLG1 CHLG5 CHLG6 CHLG7 WLMGG WLMYG
OPN01-3
OPN16-7
OPQ05-12
OPQ09-2
OPQ09-7
OPQ17-8
OPQ15-1
OPN19-8
OPQ03-1
OPQ03-2
OPQ05-11
OPQ09-12
OPQ17-5
OPN01-7
OPN01-8
OPA01-5
OPG06-9
OPG06-15
OPN19-3
OPQ14-9
OPQ17-6
OPN01-14
OPN12-6
OPQ05-7
OPQ14-6
OPQ17-5
OPQ17-9
OPA01-8
OPQ15-1
OPI19-2
OPQ03-6
OPQ17-8
OPQ14-7
OPQ05-10
OPI19-3
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
0.592
0.033
0.269
0.269
0.000
0.592
0.592
0.068
0.000
1.000
0.224
1.000
0.433
0.503
0.592
1.000
0.000
1.000
1.000
0.592
0.000
0.000
0.000
1.000
1.000
1.000
0.503
0.000
0.068
0.000
0.000
0.000
0.000
0.124
0.391
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
0.546
0.462
0.000
0.000
0.000
1.000
0.462
1.000
0.081
1.000
1.000
1.000
0.000
0.000
0.000
1.000
1.000
0.391
0.271
0.000
1.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.229
0.166
1.000
0.107
0.229
0.297
0.229
0.297
0.107
0.000
0.000
1.000
0.107
1.000
1.000
0.000
1.000
0.459
0.373
1.000
1.000
0.107
0.000
0.000
0.000
1.000
1.000
0.166
0.373
0.000
1.000
0.000
0.144
0.144
0.000
0.046
0.313
1.000
0.093
0.093
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276 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　21 卷
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2772 期　　　　　　　　　　　　　　崔继哲等:羊草种群遗传分化的 RAPD 分析 I:扩增片段频率的变化