全 文 ：第 23 卷　第 3 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2003年　7 月
Vol.23　No.3　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH July , 　2003
用 ISSR标记研究高卢蜜环菌系统发生学的尝试
孙立夫1 杨国亭1 , 2 秦国夫3 宋玉双3 宋瑞清1
(1.东北林业大学 ,哈尔滨　150040)
(2.黑龙江省林业厅 ,哈尔滨　150000)
(3.国家林业局森林病虫害防治总站 ,沈阳　110034)
摘　要　用 ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)标记对黑龙江省牡丹江地区高卢蜜环菌的系统发
生学进行了研究 ,用 6个引物对 35个菌株的 DNA 模板进行扩增。结果表明该地区的 35个菌株
分属 3个不同的发育系 ,并且 3个发育系在地理分布上是交错在一起的。同时表明 ISSR标记是
研究蜜环菌系统发育关系的理想的分子标记手段 。
关键词　高卢蜜环菌;系统发生学;ISS R
AN ATTEMPET ABOUT STUDIES ON THE PHYLOGENETICS OF
ARMILLARIA GALLICA WITH ISSR MARKER
SUN Li-Fu1 YANG Guo-Ting1 , 2　QIN Guo-Fu3 SONG Yu-Shuang3　SONG Rui-Qing1
(1.Northeast Forestr y University ,Harbin 150040)
(2.Forestry Bureau of Heilongjiang Province , Harbin　150000)
(3.Forest Plant Diseases and Insect Pests Control General Station , National Forestry General Bureau of China, Shenyang 　110034)
Abstract　The phylogenetics of Arm il laria gallica in Mudanjiang area of Heilong jiang Province w as
studied w ith ISSR marker.35 isolates were amplified wi th 6 primers.The results show ed that these
35 isolates belonged to 3 different clades in the area , and these clades interlaced each other in some
aeras.It also showed that ISSR marker w as an ideal molecular marker in study ing the phylogenetics
of Arm il laria .
Key words　Armillaria gal lica;phylogenetics;ISSR
　　蜜环菌属(Armil laria)是担子菌亚门中一个
经济价值很高的属。它既是优良的药用和食用真
菌 ,也是寄主范围广 ,致病能力强 ,世界性分布的重
要病原菌 ,所以多年来一直受到真菌分类学家和植
物病理学家的高度重视 。高卢蜜环菌(Armillaria
gal lica Marxm.& Romagn.)是蜜环菌属中一个在
北半球广泛分布的生物种 ,在土壤中能产生发达的
网状菌索 ,主要营腐生或弱寄生生活 ,在我国东北
为常见种 ,子实体出现在 7月下旬至 8月下旬[ 1] 。
蜜环菌的研究一直是真菌研究中的一个热点 ,在世
界范围内开展的较为广泛 ,而近几年来用不同的分
子标记技术来研究不同地域的相同或相近种的系
基金项目:黑龙江省自然科学基金项目的资助(220-413504)和国家自然科学基金项目的资助(30070015)。第一作者简介:孙立夫(1969—),男 ,在读博士 ,主要从事蜜环菌生物种方面的研究工作 。收稿日期:2003-01-03
统亲源关系已成为常规的研究方法[ 2 , 3] 。本文尝
试用 ISS R标记来研究黑龙江省牡丹江地区高卢
蜜环菌的系统发生学关系 。
ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)标记是
Zietkiewicz 等在 1994年首次使用的一种分子标记
技术 ,它是利用加锚的微卫星寡核苷酸作引物 ,对
基因组节段进行扩增的 ,为了防止简单重复的寡核
苷酸引物在基因组上的滑动 , 在微卫星引动的
PCR(microsatellite primed PCR ,简称 MP-PCR)基
础上发展出了锚定的 SSR-PCR ,即在 SSR的 5 端
或 3 端加上 2 ～ 4个随机选择的核苷酸 ,这可引起
特定位点退火。这样就能导致位于反向排列的间
隔不太大的重复序列间的基因组节段被 PCR扩
增[ 4 ,6] 。ISSR 通常为显性标记 , 呈 Mendel 式遗
传 ,有很好的稳定性和多态性 ,经济高效 ,是近年来
出现的非常理想的分子标记之一[ 5] 。目前在蜜环
菌的研究中 ISS R标记的使用还不多见 ,通过研究
以探索 ISSR标记在蜜环菌分子系统学研究中推
广使用的可行性也是本研究的目的之一。
1 材料与方法
1.1 标本采集与鉴定
标本采集于 2002年 8月初至 8月下旬在黑龙
江省牡丹江地区 9 个林业局内进行。所采集的蜜
环菌生物种的鉴定是用互交不育性实验的方法完
成的 ,于 2002年 10 ～ 12月在国家林业局森林病虫
害防治总站进行 。在所采集的蜜环菌标本中高卢
蜜环菌菌株共有 35株。高卢蜜环菌的采集和鉴定
结果 ,以及系统发育树研究中所用外群等一并汇总
于表 1中 。
表 1 高卢蜜环菌标本采集 、鉴定结果及其外群汇总表
Table 1　identify and sample collection of Armillaria gallica and Outg roups
序号
No.
生物种
B.S.
菌株号
Isolates number
日期
Date
地点
Localit y
寄主
Host
采集人
Collector
m1 A.gall ica 02101 020809 黑龙江东京城 Acer 孙立夫 杨国亭
m2 A.gall ica 02102 020810 黑龙江穆棱 unknow n 孙立夫 杨国亭
m3 A.gall ica 02103 020810 黑龙江穆棱 Quercus mongolica 孙立夫　杨国亭
m4 A.gall ica 02105 020810 黑龙江穆棱 Larix 孙立夫 杨国亭
m5 A.gall ica 02107 020810 黑龙江穆棱 Larix 孙立夫 杨国亭
m6 A.gall ica 02108 020810 黑龙江穆棱 红松林下地上 孙立夫 杨国亭
m7 A.gall ica 02109 020810 黑龙江穆棱 红松林下地上 孙立夫 杨国亭
m8 A.gall ica 02111 020811 黑龙江绥阳 Unknow n 孙立夫 杨国亭
m9 A.gall ica 02112 020811 黑龙江绥阳 Unknow n 孙立夫 杨国亭
m10 A.gall ica 02115 020812 黑龙江八面通 枯枝落叶上 孙立夫 杨国亭
m11 A.gall ica 02116 020812 黑龙江八面通 Betula 孙立夫 杨国亭
m12 A.gall ica 02117 020812 黑龙江八面通 Unknow n 孙立夫 杨国亭
m13 A.gall ica 02118 020812 黑龙江八面通 Unknow n 孙立夫 杨国亭
m14 A.gall ica 02119 020813 黑龙江林口 Unknow n 孙立夫 杨国亭
m15 A.gall ica 02120 020813 黑龙江林口 Unknow n 孙立夫 杨国亭
m16 A.gall ica 02121 020813 黑龙江林口 Larix 孙立夫 杨国亭
m17 A.gall ica 02122 020813 黑龙江林口 Unknow n 孙立夫 杨国亭
m18 A.gall ica 02125 020814 黑龙江柴河 Larix 孙立夫 杨国亭
m19 A.gall ica 02126 020814 黑龙江柴河 Larix 孙立夫 杨国亭
m20 A.gall ica 02128 020814 黑龙江海林 Larix 孙立夫 杨国亭
318 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　23 卷
序号
No.
生物种
B.S.
菌株号
Isolates number
日期
Date
地点
Localit y
寄主
Host
采集人
Collector
m21 A.gall ica 02130 020814 黑龙江海林 Larix 孙立夫 杨国亭
m22 A.gall ica 02135 020814 黑龙江海林 Larix 孙立夫 杨国亭
m23 A.gall ica 02137 020814 黑龙江海林 Larix 孙立夫 杨国亭
m24 A.gall ica 02142 020815 黑龙江大海林 Larix 孙立夫 杨国亭
m25 A.gall ica 02143 020815 黑龙江大海林 Larix 孙立夫　杨国亭
m26 A.gall ica 02144 020815 黑龙江大海林 Quercus mongolica 孙立夫 杨国亭
m27 A.gall ica 02145 020815 黑龙江大海林 Cuckoo 孙立夫 杨国亭
m28 A.gall ica 02146 020815 黑龙江大海林 Unknow n 孙立夫 杨国亭
m29 A.gall ica 02147 020815 黑龙江大海林 Unknow n 孙立夫 杨国亭
m30 A.gall ica 02148 020815 黑龙江大海林 Unknow n 孙立夫 杨国亭
m31 A.gall ica 02149 020815 黑龙江大海林 Unknow n 孙立夫 杨国亭
m32 A.gall ica 02150 020815 黑龙江大海林 Unknow n 孙立夫 杨国亭
m33 A.gall ica 02151 020815 黑龙江大海林 Unknow n 孙立夫 杨国亭
m34 A.gall ica 02152 020815 黑龙江大海林 Unknow n 孙立夫 杨国亭
m35 A.gall ica 02153 020817 黑龙江迎春 Unknow n 孙立夫 杨国亭
E1 A.gall ica Outgroup Unknow n 欧洲 Unknow n Unknow n
E2 A.gall ica Outgroup Unknow n 欧洲 Unknow n Unknow n
E3 A.gall ica Outgroup Unknow n 欧洲 Unknow n Unknow n
E4 A.gall ica Outgroup Unknow n 欧洲 Unknow n Unknow n
E5 A.gall ica Outgroup Unknow n 欧洲 Unknow n Unknow n
E6 A.gall ica Outgroup unknow n 欧洲 Unknow n Unknow n
CBS F 中国生物种 F Outgroup 020820 黑龙江东方红 Unknow n 孙立夫 杨国亭
CBS D A.ostoyae Outgroup 020826 黑龙江黑河 Unknow n 孙立夫 杨国亭
1.2　菌种培养
将待试的单倍体菌种接种在 cellophane 膜表
面培养 , 膜下为含有 2%麦芽粉 、0.5%葡萄糖 、
0.1 %蛋白胨和 1.4%琼脂的培养基 ,待菌丝生长
2 ～ 3周后 ,从膜表面刮取菌丝 ,放入 1.5 mL 的离
心管中 ,将盛有菌丝的离心管放入-70℃的低温冰
箱中冷冻 8 ～ 12 h ,再放入真空低温干燥机中冷冻
干燥 12 ～ 24 h ,然后将离心管用蜡膜密封备用。
1.3　DNA 提取
本文采用中科院植物所分子生态学实验室所
提供的经过改进的 CTAB法提取 DNA。在装有少
量(约 0.01 g)干燥菌丝的 1.5 mL 离心管中 ,加入
2×CTAB提取介质混合液(100 mmol/L Tris-HCl
pH 8.0 , 1.4 mol/L NaCl , 20 mmol/L EDTA , 2%
CTAB , 0.1%～ 2% β-巯基乙醇), 其终量为 500
μL ,用“博士”小型手电钻安上灭过菌的塑料枪头
进行研磨 ,然后将磨好的菌丝混合液放入 65℃水
浴保温 30 ～ 60 min。加入等体积的氯仿/Tris-饱
和酚(1:1)混合液 , 13 000 r/min离心 10 min ,取上
清液放入另一 1.5 mL 离心管中并加入等体积的
氯仿/异戊醇(24:1)混合液 , 13 000 r/min离心 10
min ,取上清液放入一个新的 1.5 mL 离心管中并
加入 3M Kac 80 ～ 100 μL ,再加入等体积的冰冷的
异丙醇 ,混匀后 ,置于-20℃或 4℃冰箱中沉淀 1 h
或过夜 ,然后 13 000 r/min离心 10 min ,弃上清液 ,
收集沉淀 ,再加入 300 μL 70%乙醇清洗沉淀 , 13
000 r/min离心 10 min ,弃上清液(防止倒流),收集
沉淀 ,置 37.5℃的恒温箱中干燥 30 min。在干燥
3193 期　　　　　　　　　　　　孙立夫等:用 ISSR标记研究高卢蜜环菌系统发生学的尝试
表 2　ISS R引物及退火温度
Table 2　The primers o f ISSR and its denaturation temperature
引物编号(序号)
Primer number
序列
Sequence
退火温度(℃)
Denaturat ion temperature
9#(MAO) (CTC)4RC 48℃
11#(GUO) BDB(ACA)5 48℃
13#(857) (CA)8YG 54℃
14#(MANNY) (CAC)4RC 60℃
15#(TCG) XDH(TCG)5 61℃
16#(CGA) DHB(CGA)5 61℃
　　注:D:G/A/ T;B:G/ T/ C;R:C/G;Y:A/ T;H:A/ T/ C;X:A/C/G 。
后的离心管中加入 50 μL 去离子水 ddH2O ,放入
4℃冰箱中待用 。1.4　PCR扩增
经过反复实验摸索反应条件 ,最终确定模板的
浓度为 1%,即将 DNA原液稀释 100倍;引物经过
筛选 ,从 17个引物(大部分借鉴于研究植物的 IS-
SR引物)中选择 6个引物(表 2)进行扩增;经过比
较将 PCR反应的程序确定为:95℃ 10 min(预变
性);然后进行 35 个循环(94℃30 s ,退火 1 min ,
72℃2 min);72℃10 min;降至 4℃结束 。反应体
系为 25 μL。整个扩增重复两次。
1.5 电泳检测与数据处理
用 TBE缓冲液(Tris饱和酚 ,硼酸 , 0.5 mol/ L
EDTA ,PH 8.0)和琼脂糖制浓度为 2%的胶 ,在倒
胶前加入 EB(溴乙锭)溶液 ,加样时每个加样孔中
注入 10 μL 经溴酚蓝染色的 PCR产物 ,用 200 bp
ladder Marker作为标准分子量 ,电压 100 V 电泳 3
h ,然后在紫外光下照相 ,用 Labw orks 4.0软件进
行计算机读带 ,迁移率相同(正负误差不超过 1%)
的带可认为是相对分子量相近的共有带 ,若迁移率
不同的则认为是特征带 。最后将相对分子量数据
转换成 0 ,1数据 ,用 Phylip 3.6a3版本分析软件进
行分析并构建系统发育树 。电泳检测重复两次以
检验稳定性。
2　结果与分析
2.1　电泳检测结果与分析
用6个 ISSR引物对高卢蜜环菌的 35模板和 8
个外群(Outgroup)进行了 PCR扩增 ,电泳检测结果见
图1。从电泳图谱中可以看到6个引物扩增出来的带
的多态性是比较高的 ,既有共有带又有特征带。
2.2 数据整理与分析
将计算机所读取的带的数据转换成 0 ,1性状 ,
用 phylip 3.6a3分析软件的 ddlop进行简约性分析
并构建系统发育树 ,见图 2。从图 2的系统发育树
可以看出 ,在该地区的高卢蜜环菌存在着 3个主要
的发育系 ,其中一个发育系在大海林 、海林和柴河
一带 ,共包括 9个菌株 ,这个发育系又出现两个分
支 ,一支单独在大海林有 4个菌株;另一支在大海
林 、海林和柴河三地有 5个菌株。另外两个发育系
的遗传相似性较大 ,其中一个较大的发育系有 15
个菌株 ,它又有两个主要分支 ,一支在大海林 、林口
和八面通 ,有 6 个菌株;另一支分布较广 ,在林口 、
柴河 、绥阳 、八面通 、穆棱 、海林 、东京城等地 ,共有
9个菌株;两个遗传相似性较大的发育系中另一相
对较小的发育系有 11个菌株 ,分布在大海林 、八面
通 、穆棱 、迎春 、绥阳等地 。
3　讨论与结论
3.1 本文所用经改进的 CTAB法提取 DNA ,避
开了使用液氮和研钵研磨 ,使蜜环菌 DNA 的提取
变得简单 、高效 ,而且 DNA 提取的质量好 。
3.2 利用 6 个引物进行覆盖整个基因组的多态
性分析表明 ,各个引物的多态性均较高 ,而且既有
共有带又有特征带;6 个引物的 PCR扩增和电泳
检测重复 2 遍 ,结果表明 ISSR 标记的重复性较
好。说明这几个引物对于用 ISSR标记研究蜜环
菌而言是比较理想的选择 , ISSR标记是研究蜜环
菌较为理想的分子标记 。
3.3　由于 9#、11#、13#、14#等几个引物是从
研究植物的 ISS R引物中引借过来的 ,从而又一次
320 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　23 卷
图 1 6 种引物的 ISSR-PCR电泳图谱
F ig.1 Electropherogram of six ISSR-PCR primers
图 1中自上而下依次分别为 9#、11#、13#、14#、15#和 16#引物的电泳图谱 , 6个电泳图谱中泳道所对应的模板次序是一样的 ,自左
而右依次为Marker-m1～ m16-Marker-Marker-m17～ m32-Marker-Marker-m33～ m35-E1～ E4
-Marker-Marker-CBS F-CBS D-Marker。
From above to below , 6 elect ropherograms respectively belong to 9#, 11#, 13#, 14#, 15# and 16# primer.Sequences of corresponding
templates of the lanes in 6 elect ropherograms , w hich are M arker-m1～ m16-Marker-Marker-m17～ m32-Marker-Marker-m33～ m35
-E1～ E4-Marker-Marker-CBS F-CBS D-Marker , are the same
证明了微卫星在真核生物中存在的普遍性以及一
些引物的通用性 , 并可推定这几个引物也可在用
ISSR标记研究其他蜜环菌生物种分子系统学中应
用。 ISSR标记所用引物具有很好的通用性。
3.4 在本文中 ,牡丹江地区的高卢蜜环菌共有 3
个主要的发育系 ,同一地域内的菌株可能属于不同
的发育系或同一发育系的不同发育分支 ,如大海林
的 11个菌株分属 3 个不同的发育系;而不同地域
的菌株却可能属于同一个发育系 ,虽然迎春局和大
海林局相距较远 ,但迎春的 m33 和大海林的 m35
两个菌株的遗传距离却很近 ,属同一发育系的同一
分支 。蜜环菌生物种分子系统学的研究有助于重
建生物种正确的家系联系。
3.5 该地区 3 个发育系在地理上的分布不是相
互独立的 ,而是交错在一起的 ,这说明 3个发育系
在所研究的地域内生存演化的时间已相当长。
3.6 本文中 ,共有 8个蜜环菌菌株作为外群用以
比照分析 ,其中有 2个菌株为非高卢蜜环菌 ,有 6
3213 期　　　　　　　　　　　　孙立夫等:用 ISSR标记研究高卢蜜环菌系统发生学的尝试
图 2 根据 ISSR多态性建立的牡丹江地区高卢蜜环菌的系统发育树
Fig.2 Phylogenetic dendrogram of A .gallica in Mudanjiang area constructed with ISSR polymorphism data
　　外群为:CBS F ,CBS D(奥氏蜜环菌),高卢蜜环菌欧洲种为 E1～ E6。m1～ m35为牡丹江地区高卢蜜环菌。
　　Outgroup:CBS F , CBS D(A.ostoya), A.ga llica in Europe-E1～ E6.A.gall ica in MuDanJiang area-m 1～ m 35
个高卢蜜环菌的欧洲种 。从图 2 中可以看到这 6
个欧洲高卢蜜环菌中有 4 个菌株同中国种的遗传
相似性要大于同另 2个欧洲种菌株的遗传相似性 。
这有必要对北半球的欧洲 、北美和中国这 3块大陆
的高卢蜜环菌的系统发生学关系进行进一步的研
究。
3.7 用本文所用的 ISS R标记技术来研究蜜环菌
生物种的系统发育是可行的 ,其方法简单 、稳定 、经
济 、高效 ,而且多态性高 ,重复性好 ,这种方法可以
在以后的研究中更为广泛的使用。
致谢　本研究得到了中科院植物所分子生态学实验室裴克
全博士 、国家林业局森林病虫害防治总站赵俊高工以及牡
丹江林管局李续尧 、傅恒良 、赵晓军等同仁的大力支持和帮
助在此一并表示感谢。
参　考　文　献
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