全 文 ： 第 vz卷 第 u期u s s t年 v 月
林 业 科 学
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北半球高卢蜜环菌的遗传多样性与分子鉴定
秦国夫 赵 俊 田淑敏
k国家林业局森林病虫害防治总站 沈阳 ttssvwl
¤µ®®² ‹¤±·∏¯¤
kƒ¬±±¬¶«ƒ²µ¨¶·Œ±¶·¬·∏·¨o° q’ q…²¬t{ oƒŒ‘2stvs o∂¤±·¤¤oƒ¬±¯¤±§l
摘 要 } 从北美 !欧洲和中国收集 uv个高卢蜜环菌菌株 o°≤• 扩增其 µ⁄‘„的 ŒŠ≥和 Œ×≥区域 o用 „¯ ∏´ !‹¤¨
¶ !‹¬±©´和 פª´四种限制性内切酶进行酶切 o同时结合随机扩增微卫星k• „≥l多态性 o对北半球的高卢蜜
环菌的遗传多样性进行了分析 ∀结果发现了高卢蜜环菌的 y种 ŒŠ≥2• ƒ°图谱类型 o其中 ª¤¯k…l和 ª¤¯k⁄l是国
内外尚无报道的新的 ŒŠ≥2• ƒ°型 ∀ • ƒ°系统树发现该种有明显的大陆之间遗传分化 o存在中国 !欧洲 !北美
和亚洲 w个亚群体 ∀ • „≥分析表明北半球高卢蜜环菌存在亚洲 !欧洲 !北美2中国和北美2欧洲等 w个高卢蜜
环菌发育系 o而且不同大陆的高卢蜜环菌具有较近的亲缘关系 o而相同大陆的却具有不同的起源 o特别是北美
的高卢蜜环菌两个发育系异源性很高 o北美东部的发育系同欧洲的关系比较近 o而北美西部的同亚洲关系比
较近 ∀同时表明 • „≥技术是分析菌物种内遗传多样性的优越方法 ∀
关键词 } 高卢蜜环菌 o遗传多样性 oŒŠ≥2• ƒ° o• „≥
收稿日期 }usss2sz2vt ∀
基金项目 }国家自然科学基金项目kv|zzsyt{l !国家自然科学青年基金kv|xsssstl和国家基金委对外交流与合作项目kv|{tttvsx{tl
资助课题 ∀
ΓΕΝΕΤΙΧ ∆Ις ΕΡΣΙΤΨ ΑΝ∆ ΜΟΛΕΧΥΛΑΡ Ι∆ΕΝΤΙΦΙΧΑΤΙΟΝ ΟΦ
ΝΟΡΤΗΕΡΝ ΗΕΜΙΣΠΗΕΡΕ ΣΠΕΧΙΕΣ ΟΦ ΑΡ ΜΙΛΛΑΡΙΑ ΓΑΛΛΙΧΑ
±¬± Š∏²©∏ «¤²∏± ׬¤± ≥«∏°¬±
k Γενεραλ Στατιον οφ Φορεστ Πεστ ΧοντρολoΣτατε Αδµινιστρατιον οφ Φορεστρψ Σηενψανγttssvwl
¤µ®®² ‹¤±·∏¯¤
k Φιννιση Φορεστ Ινστιτυτε oΠqΟqΒοξt{ oΦΙΝ2stvs oςανταα oΦινλανδl
Αβστραχτ } ׫¨ ŒŠ≥ ²©uv¬¶²¯¤·¨¶²© Αρµιλλαρια γαλλιχα©µ²°·«µ¨¨¦²±·¬±¨ ±·¤¯¶²©‘²µ·«¨µ± ‹ °¨¬¶³«¨µ¨ º¨ µ¨ ¤°³¯¬2
©¬¨§º¬·«³µ¬°¨ µ¶•tu• ¤±§’2t o¤±§§¬ª¨¶·¨§¥¼ „¯ ∏´ o‹¤¨ ¶ o‹¬±©¯ oפª´ µ¨¶·µ¬¦·¬²± ±¨½¼°¨ oµ¨¶³¨¦·¬√¨ ¼¯ q¶¬¬
• ƒ° ³¤·¨µ±¶º¨ µ¨ ²¥¶¨µ√¨ §o·«¨ ³¤·¨µ±¶²©ª¤¯k„l ¤±§ª¤¯k…l º¨ µ¨ ²±¯¼ ¶¨ ±¨¬± ≤«¬±¨ ¶¨ ¬¶²¯¤·¨¶oª¤¯k≤l º¤¶²¦2
¦∏µµ¨§¤µ²∏±§·«¨ ±²µ·«¨µ± «¨ °¬¶³«¨µ¨ o¬±¦¯∏§¬±ª ˜≥„ o≤¤±¤§¤oŠ¨ µ°¤±¼o°²¯¤±§o∏¬¨ °¥²∏µª¤±§ ≤«¬±¤oª¤¯k⁄l
³¤·¨µ± º¤¶¶¨ ±¨¬± ¤ ∞∏µ²³¨¤±¬¶²¯¤·¨oª¤¯k∞l º¤¶²±¯¼©²∏±§¬± „°¨ µ¬¦¤±¬¶²¯¤·¨¶q…¤¶¨§²±·«¨ ³¤µ¶¬°²±¼·µ¨¨²©
• ƒ° µ¨¶∏¯·¶o©²∏µΑqγαλλιχα¶∏¥2³²³∏¯¤·¬²±¶º µ¨¨ ©²∏±§©µ²°·«¨¶¨ ¬¶²¯¤·¨¶¤±§±¤°¨ §·«¨ ≤«¬±¨ ¶¨k≤‹l o∞∏µ²³¨¤±
k∞˜l o‘²µ·« „°¨ µ¬¦¤±k‘„l o¤±§ „¶¬¤±k„≥l ¶∏¥2³²³∏¯¤·¬²±¶q׫¨ •¤±§²° ¤°³¯¬©¬¨§ °¬¦µ²¶¤·¨¯ ¬¯·¨¶k• „≥l ¬¨2
³¨µ¬°¨ ±·¶º¨ µ¨ ¦¤µµ¬¨§²∏·º¬·«³µ¬°¨ µ×≤Š o≤Š„ otv o¤±§Š„„„ oµ¨¶³¨¦·¬√¨ ¼¯ q…¤¶¨§∏³²±·«¨ ³¤µ¶¬°²±¼·µ¨¨²©
• „≥ µ¨¶∏¯·¶o·«¨¶¨ ¬¶²¯¤·¨¶º¨ µ¨ ¶¨³¤µ¤·¨§¬±·²©²∏µ¦¯¤§¨¶o¬q¨ q·«¨ ∞∏µ²³¨¤± k∞˜l o≤«¬±¨ ¶¨ k≤‹l o‘²µ·« „°¨ µ¬2
¦¤±2≤«¬±¨ ¶¨ k‘„≤‹l o¤±§ ‘²µ·« „°¨ µ¬¦¤±2∞∏µ²³¨¤± k‘„2∞˜l ª¨²ªµ¤³«¬¦¤¯ ¬¯±¨ ¤ª¨ q׺² ªµ²∏³¶ °¨¨ µª¨§¬± ·«¨
‘„ ¬¶²¯¤·¨¶²© Αqγαλλιχαo¤±§·«¨¼ ¤µ¨ °²µ¨ ¦¯²¶¨ ·² ∞˜ ¤±§ ≤‹ µ¨¶³¨¦·¬√¨ ·«¤± ¥¨·º¨ ±¨ q׫¨ µ¨¶¨¤µ¦«¶∏ªª¨¶·¨§
·«¤··«¨ • „≥ ¤µ¨ ∏´¬·¨ ©¨©¨¦·¬√¨ º¤¼©²µ¤±¤¯¼¶¬¶²©ª¨ ±¨ ·¬¦§¬√¨ µ¶¬·¼ ²©©∏±ª¬q
Κεψ ωορδσ} Αρµιλλαρια γαλλιχαoŠ¨ ±¨ ·¬¦§¬√¨ µ¶¬·¼oŒŠ≥2• ƒ° o•¤±§²° ¤°³¯¬©¬¨§ °¬¦µ²¶¤·¨¯ ¬¯·¨ k• „≥l
密环菌属≈ ΑρµιλλαριαkƒµqΒƒµql≥·¤∏§¨ 是一类非常重要的林木病原菌 o它的寄主范围广 o培养特征和
担子果形态变异大 ∀由它引起的红松和落叶松根朽病近年来在中国东北普遍发生 o对人工用材林和母
树林的危害甚大 ∀从 Ž¤µ¬Ž²µ«²±¨ ± kt|z{l首次发现蜜环菌生物种以来 o生物种已成为系统分类的基础 o
根据生物种建立的分类种 o已被菌物分类学和森林病理学界广泛承认 ∀目前生物种的研究不仅是森林
病理学上鉴定病原菌和按病原分类施策的必要前提 o也是蜜环菌药用发酵和天麻猪苓栽培等方面的基
础 ∀迄今欧洲 !北美 !澳洲 !非洲和日本等国学者均按生物种标准鉴定了各自地区的蜜环菌种类k≥«¤º
ετ αλqot||t ~Ž²µ«²±¨ ±ot||xlk≥«¤º ετ αλqot||t ~Ž²µ«²±¨ ±ot||xl ∀我们也初步鉴定了中国东北和西南地区
的 {个蜜环菌生物种 o称为中国生物种k≤«¬±¨ ¶¨ …¬²¯²ª¬¦¤¯ ≥³¨¦¬¨¶o≤…≥l o通过交配鉴定了 ≤…≥„ !≤…≥… !
≤…≥⁄和 ≤…≥Œ分别为芥黄蜜环菌≈ Αqσιναπινα …iµ∏¥i i ⁄¨ ¶¶∏µq  !高卢蜜环菌≈ Αqγαλλιχα ¤µ¬°qi •²2
°¤ª±q  !奥氏蜜环菌≈ Αqοστοψαε k•²°¤ª±l ‹ µ¨¬±®q 和假蜜环菌≈ Αqταβεσχενσ k≥¦²³ql∞°¨  ¯k贺伟等 ot||y ~
秦国夫等 oussslk贺伟等 ot||y ~秦国夫等 ousssl ∀
鉴于蜜环菌的一切遗传 !生理和生态学研究都必须建立在遗传多样性研究基础之上 o因此 o在生物
种基本得到澄清之后 o其种下遗传变异已成为各国菌物学家关注的问题 o其目的是通过 ⁄‘„分子定型
来快速鉴别蜜环菌的生物种 o从而避免繁琐的单孢分离和遗传测交技术 ~二是通过分子系统学研究 o为
探讨全球各生物种之间的起源和演化 o特别是种间界定提供更全面的依据 ∀作为前者 o‹¤µµ¬±ª·²±kt||xl
在 „±§¨µ¶²±kt||ul的蜜环菌分子系统学研究的基础上发展了 ŒŠ≥的 °≤•2• ƒ°鉴定方法k‹¤µµ¬±ª·²± ετ
αλqot||x ~„±§¨µ¶²± ετ αλqot||ul o此后 o…¤±¬®等kt||y ot||{l !∂²¯®kt||yl !× µ¨¤¶«¬°¤kt||{l !• «¬·¨ kt||{l !
≥¬¨µµ¤kt|||l等都用该方法进行了生物种的鉴定k…¤±¬® ετ αλqot||y ~t||{ ~∂²¯®ot||{ ~× µ¨¤¶«¬°¤ ετ αλqo
t||{ ~• «¬·¨ ετ αλqot||{ ~≥¬¨µµ¤ ετ αλqot|||l ∀在生物种内的地理遗传多样性研究方法 o≤²¨·½¨ ¨等kusssl
对全球的蜜环菌≈ Αqµελλεα¶q¶·µq 进行了 ŒŠ≥和 Œ×≥的 ⁄‘„序列分析 o发现了该种存在亚洲 !欧洲 !东北
美和西北美 w个独立的进化群体k≤²¨·½¨ ¨ ετ αλqousssl ∀≥¦«∏¯½¨ kt||zl用µ⁄‘„2• ƒ°和 • „°⁄方法发现
奥氏蜜环菌在欧洲只有较低的遗传变异k≥¦«∏¯½¨ ετ αλqot||zl ∀为揭示另一个北半球性分布的高卢蜜环
菌的地理变异情况 o进而对其进行分子鉴定 o我们进行了欧 !亚 !美 v个大陆高卢蜜环菌菌株 ŒŠ≥和
• ƒ°以及 • „≥分析 o现将结果报告如下 ∀
t 材料与方法
111 菌种与培养
uv个高卢蜜环菌的单孢菌株来自欧洲 !亚洲和北美的 y个国家k表 tl ∀将菌种接种培养在 ¦¨¯¯²2
³«¤±¨ 膜表面上 o膜下为含有 u h麦芽粉 !u h葡萄糖和 s1x h蛋白胨的培养基 ∀待菌丝生长 u ∗ v周后 o
从膜表面刮取蜜环菌菌落 o进行 ⁄‘„提取 ∀
112 ⁄‘„提取
⁄‘„提取结合刘小勇等kt||zl和 ∂¤±¬²等kt||{l的方法进行 ∀菌丝放在研钵中用液氮进行研磨 o转
移到离心管后加含有 u h ≥⁄≥ 的裂解缓冲液ktxs°°²¯Π‘¤≤¯ oxs °°²¯Π∞⁄ׄ ots°°²¯Π×µ¬¶2‹≤¯ o
³‹z qwl oyx ε 保温 vs ∗ ws°¬±o离心去掉菌丝残体 o上清液加入 tΠts的 ts°°²¯Π‘¤≤¯ 溶液和 tΠts的 ts h
≤ׄ…缓冲液kts h ≤ׄ…oxss°°²¯Π×µ¬¶2‹≤¯ otss°°²¯Π∞⁄ׄ o³‹{ qsl o混匀后 yx ε 保温 tx°¬±∀然后冰
浴 x°¬±后 o加等体积的酚Β氯仿Β异戊醇kuxΒuwΒtl o用震荡器充分混匀 us°¬±otwsssµΠ°¬±离心 us°¬±∀用
酚Β氯仿Β异戊醇抽提重复 w次 o最后用等体积的氯仿Β异戊醇kuwΒtl抽提 ∀抽提后的上清液用 s1y倍体
积的聚乙二醇溶液k含 us h kºΠ√l°∞Š ysss和 u1x°²¯Π‘¤≤¯ l沉淀 o⁄‘„在 xs ε 下真空泵抽干后溶于含
t°°²¯Π∞⁄ׄ的 y°°²¯Π×µ¬¶2‹≤¯ 缓冲液k³‹{ qsl中备用 ∀
113 ΠΧΡ 和 ΡΑΜΣ扩增
采用位于µ⁄‘„大亚基 v. 端和 x≥µ⁄‘„x. 端之间的基因间隔区k¬±·¨µª¨±¬¦¶³¤¦¨µµ¨ª¬²±oŒŠ≥l和位于
tz≥µ⁄‘„v.端和 ux≥µ⁄‘„x.端之间的内转录间隔区k¬±·¨µ±¤¯ ·µ¤±¶¦µ¬¥¨§¶³¤¦¨µoŒ×≥l进行 °≤• 扩增 ∀扩增
ŒŠ≥的引物 •tu• 和 s2t按 „±§¨µ¶²±kt||ul的序列 o扩增 Œ×≥的引物 Œ×≥t和 Œ×≥w按k • «¬·¨ot||sl的序列
进行合成 ∀引物浓度 uΛ°²¯Πo使用 ⁄¼±¤½¼°¨ µ⁄‘„ 聚合酶 o反应体积 xsˏ∀样品先在 |x ε 下预变性
ts°¬±o加入酶后执行以下 vx个循环 }|x ε vs¶oxx ε xx¶ozu ε u°¬±o最后一个循环 zu ε 延伸 ts°¬±∀
uy 林 业 科 学 vz卷
表 1 供试的高卢蜜环菌菌株
Ταβ .1 Τηε ηαπλοιδ ισολατεσ οφ Α . γαλλιχα υσεδ ιν τηεστυδψ
照片代码
‘∏°¥¨µ
²©³«²·²
菌株号
‘∏°¥¨µ²©
¬¶²¯¤·¨¶
采集日期
⁄¤·¨
地点
²¦¤¯¬·¼
寄主
‹²¶·
采集人
≤²¯¯¨ ¦·²µ
tyv …wyx {ys|ux ‘‹ Φαγυσ γρανδφολια ‹¤µµ¬±ª·²±
tyu …wyw {ys|ux ‘‹ Φαγυσ γρανδφολια ‹¤µµ¬±ª·²±
tyt …wx{ {ys|uu ‘‹ Αχερσααχχηαρινυµ ‹¤µµ¬±ª·²±
u{ …wxz {ys|uu ‘‹ Αχερσααχχηαρινυµ ‹¤µµ¬±ª·²±
u| ‘„u ˜±®²º± ≤¤±¤§¤ ˜±®±²º± ²µµ¬¶²±
uz |vxyxΠu |vtstv °²¯¤± Χαρπινυσ¶³q „ qq¯¦¬¤®
uy {|tttΠv ˜±®²º± ¨¬¨ °¥q ˜±®±²º± ‹ q¤µ¬°|¯ ¯¨ µ
ux {|ttsΠu {|tssu ∏¬¨ ° q Λαριξ ¶³q ‹ q¤µ¬°|¯ ¯¨ µ
uw {|s|wΠu {|s|vs Š¨ µ°¤±¼ ˜±®±²º± ‹ q¤µ¬°|¯ ¯¨ µ
tz |ysttΠuu |ys{uy ≤«¤±ª¥¤¬²∏±·¤¬± Θυερχυσ µονγολιχα ±¬± Š∏²©∏
tx {|tszΠt {|tssu ∏¬¨ ° q Φαγυσ¶³q ‹ q¤µ¬°|¯ ¯¨ µ
tyw ‘„t ˜ q≥ q„ q ˜±®±²º± ˜±®²º±
tx| |ysvwΠtv |ys|st ≤«¤±ª¥¤¬²∏±·¤¬± Θυερχυσ µονγολιχα ±¬± Š∏²©∏
tx{ |ysvsΠu| |ys{vt ≤«¤±ª¥¤¬²∏±·¤¬± Τιλια αµυρενσισ ±¬± Š∏²©∏
txy |ysstΠts |ys{t| «¤±ª Š∏¤±ª¦¤¬²∏±·¤¬± …µ²¤§2¯ ¤¨©·µ¨¨ ±¬± Š∏²©∏
uv |yswsΠtz |ys|sv ≤«¤±ª¥¤¬²∏±·¤¬± ˜±®±²º± ±¬± Š∏²©∏
uu |ysv|Π| |ys|sv ≤«¤±ª¥¤¬²∏±·¤¬± ˜±®±²º± ±¬± Š∏²©∏
ut |ysvuΠu| |ys|st ≤«¤±ª¥¤¬²∏±·¤¬± Θυερχυσ µονγολιχα ±¬± Š∏²©∏
us |ysvtΠtz |ys{vt ≤«¤±ª¥¤¬²∏±·¤¬± Θυερχυσ µονγολιχα ±¬± Š∏²©∏
t| |ystvΠx |ys{uz ≤«¤±ª¥¤¬²∏±·¤¬± …µ²¤§2¯ ¤¨©·µ¨¨ ±¬± Š∏²©∏
t{ |ystuΠvx |ys{u{ ≤«¤±ª¥¤¬²∏±·¤¬± Πρυνυσσαλιχινα ±¬± Š∏²©∏
ty |ysswΠuz |ys{ut «¤±ª Š∏¤±ª¦¤¬²∏±·¤¬± Πινυσ κοραιενσισ ±¬± Š∏²©∏
txz |ysuzΠu| |ys{vs ≤«¤±ª¥¤¬²∏±·¤¬± Θυερχυσ µονγολιχα ±¬± Š∏²©∏
• „≥k•¤±§²° „°³¬¯¬©¬¨§ ¬¦µ²¶¤·¨¯ ¬¯·¨ o随机扩增微卫星l技术最初由 ¬¨·®¬¨º¬¦½等kt||wl报道 o‹¤±2
·∏¯¤等kt||yl首次应用于菌物研究中 o该方法综合 • „°⁄覆盖整个基因组 !微卫星的多态性丰富以及定
向 °≤• 的重复稳定性强等优点 o同时又摒弃 • „°⁄和定向 °≤• 方法的缺点 o是目前研究遗传变异的较
好方法 ∀微卫星引物设计按照 ‹¤±·∏¯¤kt||y ~t||z ~t||{l o≥·¨±¯¬§kt||vl o本文采用 ×≤Š !≤Š„ !tv !Š„„„w
个微卫星引物的序列见表 u ∀ • „≥扩增基本同上述 °≤• 程序 o采用热启动 °≤• 以防止低温过程中非
特异性扩增 ∀各引物的退火温度见表 u ∀
表 2 • „≥引物及退火温度 ≠
Ταβ .2 Τηε πριµερσ οφ ΡΑΜΣ ανδ ιτσ δενατυρατιον τεµπερατυρε
引物 °µ¬°¨ µ¶ 序列 ≥¨´ ∏¨±¦¨ 退火温度 ⁄¨ ±¤·∏µ¤·¬²± ·¨°³¨µ¤·∏µ¨k ε l
×≤Š x. …‹⁄k×≤Šlx yt
≤Š„ x. ⁄‹…k≤Š„lx yt
Š„„„ x. ………kŠ„„„lv Š„„ wx
tv x. Š„ŠŠŠ×ŠŠ≤ŠŠ××≤× w{
≠任选碱基为 }…kŠ o× o或 ≤l o⁄kŠ o„ o或 ×l‹k„ o×或 ≤l ∀ ׫¨ ©²¯ ²¯º¬±ª§¨¶¬ª«¤·¬²±¶¤µ¨ ∏¶¨§©²µ§¨ª¨ ±¨ µ¤·¨ ¶¬·¨¶}…kŠ o× o²µ≤l o⁄kŠ o
„ ²µ×l o‹k„ o× o²µ≤l q
vy 第 u期 秦国夫等 }北半球高卢蜜环菌的遗传多样性与分子鉴定
114 ΠΧΡ 产物的内切酶消化
将扩增的 °≤• 产物的 ‘¤≤¯ 终浓度调节到 s1v°²¯Πo然后加 u倍体积的无水乙醇 o置冰上 t«otwsssµΠ
°¬±离心 us°¬±取沉淀 o⁄‘„xs ε 真空抽干 o加各内切酶缓冲液溶解后 o约 usΛt°≤• 产物的溶液量加 „¯ ∏
´ !‹¤¨ ¶ !‹¬±©´和 פª´ ts2tx˜ ovz ε 下酶切 ty2uw«kפª´在 yx ε 下进行酶切反应l ∀
115 电泳检测和 ⁄‘„数据处理
• „≥产物和酶切后的 °≤• 产物使用 ≥¼±¨ µª¨ k¯⁄¬√¨ µ¶¬·©¬¨§ …¬²·¨¦«l和琼脂糖k°µ²°¨ ª¤¦²ql各 t h制
胶 o电泳在 ׄ∞缓冲液kws°°²¯Π×µ¬¶2„¦¨·¤·¨o³‹{ qs ~t°°²¯Π∞⁄ׄl进行 o溴乙锭染色 o紫外光下观察照
相 o用 ⁄‘„tss ¥³ ¤¯§§¨µkŠ¬¥¦² …•l判断分子片段大小 o一般误差在 ts¥³左右 ∀比照国外同类研究的
做法 o进行不同研究结果的片段比较时 o误差在 x¥³左右视为谱带相同 ∀µ⁄‘„2• ƒ°图谱和 • „≥图谱
进行 s ot转换后 o用 °‹≠Œ°软件包kv1xz版l的混合简约算法k¬¬¨ §³¤µ¶¬°²±¼ ¤¯ª²µ¬·«°l程序构建 • ¤ª±2
µ¨简约无根系统树 o根据系统发育树探讨其亲缘关系 ∀
u 结果与分析
211 ΡΦΛΠ结果(图版 ´)
°≤• 扩增的ŒŠ≥和Œ×≥两个 ⁄‘„片段的 • ƒ°表明 oŒŠ≥较Œ×≥片段的多态性高 o能够检测到种下更
多的变异 o而且它产生的多态性同菌株的地理起源相关 o而 Œ×≥的仅有较小的多态性 o也无法建立同菌
株的相关性 o所以 Œ×≥仅进行了部分菌株的初步酶切 o整个实验的高卢蜜环菌的分子定型以 ŒŠ≥ 的
• ∞°进行划分 ∀根据四种内切酶的图谱 o将来自 v个大陆的 uv个高卢蜜环菌菌株划分为以下 y个 ŒŠ≥
类型 ∀ Š¤¯k„l仅含 |zsuzΠu|一个菌株 o该类型比较特殊 o它产生的四种 ŒŠ≥酶切图谱同其它各高卢蜜环
菌菌株都不同 o而以 „¯ ∏Œ和 ‹¬±©´为特征图谱 o目前欧洲和北美各国均未发现该类型 o× µ¨¤¶«¬°¤kt||{l
报道日本北海道的高卢蜜环菌产生的 ŒŠ≥2„¯ ∏Œ图谱kvtz ous| otvx¥³l可能与此型比较近似 o该类型是亚
洲特有的类型 ∀ Š¤¯k…l包括中国吉林省 v个地点的 ts个菌株 o它们生的 ŒŠ≥2„¯ ∏Œ和 ŒŠ≥2פªŒ图谱同其
它菌株截然不同 o迄今其它国家均未发现该图谱类型 o是中国产高卢蜜环菌的主要图谱类型 ∀ Š¤¯k≤l包
括美国 !加拿大 !德国 !卢森堡 !波兰和中国等欧亚美 v个大陆 y个国家的菌株 o显然是世界性广泛分布
的图谱类型 o‹¤µµ¬±ª·²±kt||xl最初发现该 ŒŠ≥2„¯ ∏Œkv|| ouws ot{v¥³l型仅存在于两个欧洲菌株 o称为高卢
蜜环菌的欧洲型kΑqγαλλιχα ∞∏µ²³¨¤± • ƒ° ªµ²∏³l ~• «¬·¨kt||{l报道了加拿大存在两个 ŒŠ≥2„¯ ∏Œ型 okwss o
uvx ot|s¥³l和kwss ouwx ot|s¥³l o其中一个为变异类型 ~≥¬¨µµ¤kt|||l报道欧洲也存在该 ŒŠ≥2„¯ ∏Œ型kwss o
uws ot|s¥³l ~这些结果都证明该类型为全世界共有的图谱类型 ∀在 ª¤¯k≤l中 o由于来自加拿大的 ‘„u菌
株在 ŒŠ≥2‹¤¨ ¶图谱同其他菌株不同 o将其另列为 ≤u亚型 o而相应地将其余的菌株划分为 ≤t亚型 ∀ Š¤¯
k⁄l也仅含一个来自卢森堡的 {|ttt菌株 o但它产生的 w种酶切图谱同其它各菌株不同 o该类型迄今也
未曾报道 ~≥¬¨µµ¤kt|||l报道的欧洲高卢蜜环菌的另外两个 ŒŠ≥2„¯ ∏Œ型kwss ouxs otws ot|s¥³和 v|s ouvs o
t|s¥³l也没有包括该类型 ∀ Š¤¯k∞l四个来自美国的菌株 o它们的 ŒŠ≥2„¯ ∏Œ和 ŒŠ≥2‹¤¨ ¶图谱同其它的截
然不同 o是一个具有明显特征的图谱 o迄今尚未在其它国家发现 o‹¤µµ¬±ª·²±kt||xl将其kx{u ouws¥³l称为
高卢蜜环菌的美洲型kΑqγαλλιχα „°¨ µ¤¦¤± • ƒ° ªµ²∏³l o本实验也证明是美国特有的类型 ∀ • ƒ°实验结
果见表 v ∀
212 基于 ΡΦΛΠ的系统分析
基于 • ƒ°数据建立的系统树如图 t所示 o可以清楚地发现 ov个大陆的菌株之间存在明显的地理
性遗传分化 o在图中划分为中国群体k≤‹l !欧洲群体k∞˜l !北美群体k‘„l和亚洲群体k„≥l o同 • ƒ°的
直观图谱一致 ∀ ≤‹包括的菌株同 ª¤¯k…l完全一致 o‘„包括的菌株则全由 ª¤¯k∞l组成 o而 ∞˜不仅包括
u个北美的菌株k‘„t和 ‘„ul o而且还有一个中国菌株 |ysttΠuu o同 ª¤¯k≤l基本相似 o只是多了 ª¤¯k⁄l的
一个菌株 ∀亚洲群体 „≥k|ysuzΠu|l游离于所有的 v个群体之外 o也就是 ª¤¯k„l o之所以称为亚洲群体 o
是因为该 • ƒ°类型尽管本研究只发现一个中国菌株 o但日本可能比较普遍kפµ¤¶«¬°¤ot||{l ∀通过系
统树 o使 v个大陆的地理性变异比 • ƒ°图谱更加直观明确 ∀
wy 林 业 科 学 vz卷
表 3 高卢蜜环菌 ŒŠ≥和 Œ×≥酶切结果
Ταβ .3 Τηε διγεστιον ρεσυλτσ οφ ΙΓΣ ανδ ΙΤΣ ιν Α . γαλλιχα
Œ¶²¯¤·¨¶ ·¼³¨ ŒŠ≥2„¯∏Œ ŒŠ≥2‹¤¨ ¶ ŒŠ≥2‹¬±©Œ ŒŠ≥2פªŒ Œ×≥2פªŒ Œ×≥2‹¬±©Œ
|ysuzΠu| „ vtxot|xotwxotss vusoutsot|sotus xusoussotys v|sot|sotyx ‘²·¨¶· ‘²·¨¶·
|ysswΠuz … wssot|xot{x vusoutsot|s vusoussotys v|sot|sotyxotxx vusouvsotsxo{sozs xssotvsozs
|ystuΠvx wssot|xot{x vusoutsot|s vusoussotys v|sot|sotyxotxx vusouvsotsxo{sozs xssotvsozs
|ysvtΠtz wssot|xot{x vusoutsot|s vusoussotys v|sot|sotyxotxx vusouvsotsxo{sozs xssotvsozs
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|ysv|Π| wssot|xot{x vusoutsot|s vusoussotys v|sot|sotyxotxx vusouvsotsxo{sozs xssotvso|sozs
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图 t 基于 • ƒ°结果构建的高卢蜜环菌系统树
ƒ¬ªqt ׫¨ ˜°Š „ §¨ ±§µ²ªµ¤° ²© Αqγαλλιχα
¥¤¶¨§²± • ƒ° µ¨¶∏¯·¶
213 ΡΑΜΣ实验结果与分析
• „≥实验结果如照片所示 o根据照片建立了各菌
株的 ×≤Š !≤Š„ !Š„„„和 tv的 • „≥分子片段多态
性数据表 ouv个菌株共产生 {t项ks otl型多态性数据 o
构成一个 uv ≅ {t 的矩阵k因数据过大省略l ∀应用
°‹≠Œ°软件包有关程序建立了 • „≥无根系统树k图
ul ∀根据这一结果 o有 w个高卢蜜环菌的遗传发育系
存在 o分别是欧洲k∞˜l和中国k≤‹l的两个纯系 o北美
p欧洲k‘„ p ∞˜l和北美 p中国k‘„ p ≤‹l的两个混合
发育系 ∀发育树表明 o北美的高卢蜜环菌同欧洲和中
国的系统亲缘关系比较近 o而中国同欧洲的亲缘关系
比较远 ∀同时发现北美和中国的高卢蜜环菌群体都存
在较大的遗传分化 o特别是北美菌系 o产自太平洋沿岸
的菌株同中国菌系遗传相似 o而产自大西洋沿岸的菌
株同欧洲菌系相似 ∀在 ‘„2ƒ˜和 ‘„2≤‹ 两个发育系
中 o不同大陆的菌株的遗传亲缘关系要远远大于同一
大陆的菌株 o这种情况 o在蜜环菌分子系统学研究中还
是首次发现 o表明北美的蜜环菌存在的两个发育系具
有不同的起源 o它们分别同亚洲和欧洲大陆的高卢蜜
环菌近缘 ∀
根据 • „≥结果构建的最小生成树的结果k图 vl
同系统树分析结果基本一致 o主要显示出亚洲 !北美 p
xy 第 u期 秦国夫等 }北半球高卢蜜环菌的遗传多样性与分子鉴定
图 u 基于 • „≥结果构建的高卢蜜环菌系统树
ƒ¬ªqu ׫¨ ˜°Š „ §¨ ±§µ²ªµ¤° ²© Αqγαλλιχα
¥¤¶¨§²± • „≥ µ¨¶∏¯·¶
欧洲和欧 p亚 p美 v个发育系 o同系统树的比较发
现 ∞˜和 ‘„ p ≤‹ u个发育系具有比较近的亲缘关
系 o而中国菌株之间的遗传差异要远大于 v个大陆
之间 ∀综合 • „„ 的系统树和最小生成树可以发
现 o∞˜ !≤‹ !‘„2∞˜和 ‘„2≤‹ 的 w个发育系基本成
立 o中国 !欧洲和北美的 v个高卢蜜环菌群体中都存
在这样的现象 }即不同大陆高卢蜜环菌菌系间的亲
缘关系具有共同的发育起源 o而相同大陆的同种菌
系则为多系起源 ∀
v 讨论
尽管全球通过遗传交配鉴定的蜜环菌生物种已
近 vs种kŽ²µ«²±¨ ±ot||x ~≥«¤º ot||t ~贺伟 ot||y ~秦国
夫 ousss ~’·¤ot||{l o但是尚未发现一种蜜环菌为全
球性分布 o北半球分布的也只有高卢蜜环菌和奥氏
蜜环菌两种 ∀因此 o研究它们的地理遗传多样性 o特
别是建立一个准确的系统发育关系就成为研究蜜环
菌起源和进化的很好的途径 o同时也为快速进行分
子鉴定蜜环菌提供一些基础数据 ∀本研究的 y个高
卢蜜环菌的 ŒŠ≥2• ƒ°类型不仅为快速鉴定中国东
北地区的高卢蜜环菌提供了准确的分子依据 o并通
过这些 ŒŠ≥2• ƒ°型发现了高卢蜜环菌的 v个大陆
的遗传群体 o更主要的是通过一项覆盖整个基因组
的 • „≥技术检测到的 {t个多态性基因座位 o建立了高卢蜜环菌的系统树 ∀ • ƒ°和 • „≥技术具有
不同的应用范围 o• ƒ°扩增的 ŒŠ≥不足 tsss¥³o用的只有 w种内切酶 o所检测到的遗传变异信息非常有
限 o因而只能用它来进行菌株的归类 ~而 • „≥揭示的是整个基因组的遗传变异情况 o承载的多态性信
息比 • ƒ°更丰富 o因此在进行亲缘关系分析时比 • ƒ°的证据更充分一些 ∀综合 • ƒ°和 • „≥结果 o
可以发现北美西部和东部两个遗传群体的异源性是显而易见的 o中国的 |ysuz同中国其它群体的异源
性也很强 o而同日本的比较近似 ∀ ≤²¨·½¨ k¨usssl发现了北美东部和西部两个 Αqµελλεα ¶q¶q的异源性群
体 o在 Œ×≥序列上 o西部的同亚洲的更接近 o而东部的同欧洲的更近缘k≤²¨·½¨ ¨ ετ αλqousssl ∀本研究发
现高卢蜜环菌也存在同样的现象 ∀虽然仅仅根据本研究还难以作出全球性高卢蜜环菌起源和进化规律
的推断 o但在这种规律的启发下 o随着其它证据的积累 o高卢蜜环菌的起源和进化途径将会被发现 ∀
利用ŒŠ≥2„¯ ∏Œ的 • ƒ°图谱类型快速鉴定蜜环菌各种被欧洲和北美许多研究证明是可行的 o但是由
于中国的蜜环菌遗传多样性较欧洲和北美都高 o整个蜜环菌属产生的 • ƒ°图谱类型也非常丰富 o因
此 o仅应用一种内切酶还难以区分所有的生物种 o而采用几种内切酶的组合则有助于问题的解决k结果
另文发表l ∀在研究中发现 o• „≥方法是目前最简便有效的分子多态性检测技术 o其优点 }ktl多态性
高 o微卫星普遍存在于生物基因组中 o可选择性非常大 o适当的引物产生的多态性可同 „ƒ°方法相当 ~
kul稳定性极强 o由于所用的引物是基因组中真实存在的序列 o因而可以使用很高的退火温度 o不像
• „°⁄技术那样因引物序列的随机性只能采用很低的退火温度 o造成可重复性差 o实验误差较大 ~kvl实
验过程简单 o同常规 °≤• 一致 o较 „ƒ°和 • „°⁄方法可操作性都强 ~kwl使用的微卫星引物序列往往与
单拷贝基因相连锁 o是非常有效的遗传标记 ∀因此 o目前欧洲的许多菌物分子系统学工作 o特别是研究
种和种下水平的分子遗传多样性的工作 o主要都采用此项技术进行 ∀本研究也进一步证实 • „≥是研
究蜜环菌遗传进化关系的有效方法 ∀
yy 林 业 科 学 vz卷
图 v 根据 • „≥结果构建的高卢蜜环菌最小生成树
ƒ¬ªqv ׫¨ °¬±¬°∏° ¶³¤±±¬±ª·µ¨¨²© Αqγαλλιχα ¥¤¶¨§²± • „≥ µ¨¶∏¯·¶
参 考 文 献
贺 伟 o秦国夫 o沈瑞祥 q大兴安岭和长白山地区蜜环菌生物种的研究 q真菌学报 ot||y otxktl }| ∗ ty
刘小勇 o田素忠 o秦国夫等 q提取植物和微生物 ⁄‘„的 ≥⁄≥ ∗ ≤ׄ…改进法 q北京林业大学学报 ot||z ot|kvl }tss ∗ tsv
秦国夫 o赵 俊 o田淑敏等 q中国蜜环菌的新生物种 q菌物系统 ousss ot|kwl }xs| ∗ xty
„±§¨µ¶²± o≥·¤¶²√¶®¬∞q²¯ ¦¨∏¯¤µ³«¼¯²ª¨ ±¼ ²©±²µ·«¨µ± «¨ °¬¶³«¨µ¨ ¶³¨¦¬¨¶²© Αρµιλλαριαq¼¦²¯²ª¬¤ot||u o{wkwl }xsx ∗ xty
…¤±¬®  × o…∏µ§¶¤¯¯ ‹ ‹ q„¶¶¨¶¶°¨ ±·²©¦²°³¤·¬¥¬¯¬·¼¤°²±ª Αρµιλλαρια χεπιστιπεσoΑqσιναπινα o¤±§‘²µ·«„° µ¨¬¦¤± ¥¬²¯²ª¬¦¤¯ ¶³¨¦¬¨¶÷ ¤±§÷Œo∏¶¬±ª¦∏¯2
·∏µ¨ °²µ³«²¯²ª¼ ¤±§ °²¯ ¦¨∏¯¤µ¥¬²¯²ª¼q¼¦²¯²ª¬¤ot||{ o|skxl }z|{ ∗ {sx
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‹¤±·∏¯¤o¤±§ ∏¯¯¨µ q∂¤µ¬¤·¬²± º¬·«¬± Γρεµ µενιελλα αβιετινᬱ ƒ¬±¯¤±§¤±§²·«¨µ¦²∏±·µ¬¨¶¤¶§¨·¨µ°¬±¨ §¥¼µ¤±§²° ¤°³¯¬©¬¨§°¬¦µ²¶¤·¨¯ ¬¯·¨ k• „≥l q
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‹¤±·∏¯¤o‘¬¨°¬∞  ετ αλqŠ¨ ±¨ ·¬¦√¤µ¬¤·¬²± ²©·«¨ µ¨¶¬²±·²³©∏±ª∏¶¬± ƒ¬±¯¤±§¤¶§¨·¨µ°¬±¨ §¥¼µ¤±§²° ¤°³¯¬©¬¨§°¬¦µ²¶¤·¨¯ ¬¯·¨¶k• „≥l q∞∏µqqƒ²µq
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Ž²µ«²±¨ ± ŽqΑρµιλλαριᶬ±¦¨ ∞¯¬¤¶©µ¬¨¶o„¦·¤ ˜±¬√ q˜³¶q≥¼°¥q…²·q˜³¶q÷÷÷ qot||x ov otxv ∗ tyt
Ž²µ«²±¨ ± ŽqŒ±·¨µ©¨µ·¬¯¬·¼ ¤±§¦¯²±¤¯ ¶¬½¨ ¬±·«¨ Αρµιλλαριελλα µελλεα ¦²°³¯ ¬¨qŽ¤µ¶·¨±¬¤ot|z{ ot{ }vt ∗ wu
’·¤ ≠ ετ αλqq…¬²¯²ª¬¦¤¯ ¶³¨¦¬¨¶²© Αρµιλλαριᬱ ¤³¤±qΠλαντ ∆ισqot||{ o{u }xvz ∗ xwv
zy 第 u期 秦国夫等 }北半球高卢蜜环菌的遗传多样性与分子鉴定
≥¦«∏¯½¨ ≥ o…¤«±º ª¨ Š o²¯¯¨µ∞  ετ αλqŒ§¨±·¬©¬¦¤·¬²± ²©·«¨ ª¨ ±∏¶Αρµιλλαρια ¥¼¶³¨¦¬©¬¦¤°³¯¬©¬¦¤·¬²± ²©¤±µ⁄‘„2Œ×≥ ©µ¤ª° ±¨·¤±§ √¨¤¯∏¤·¬²± ²©ª¨ ±¨ ·¬¦
√¤µ¬¤·¬²± º¬·«¬± Αqοστοψαε ¥¼µ⁄‘„ ∗ • ƒ° ¤±§ • „°⁄¤±¤¯¼¶¬¶q∞∏µqqƒ²µq°¤·«qot||z ouz }uux ∗ uv|
≥«¤º ≤ Š Ž¬¯¨ Š q„ Αρµιλλαριαµ²²·§¬¶¨¤¶¨ o„ªµ¬¦∏¯·∏µ¨ ‹¤±§¥²²®ot||t oy|t }t ∗ uvv
≥¬¨µµ¤ „ o• «¬·¨«¨ ¤§⁄ ≥ o• «¬·¨«¨ ¤§  oετ αλqŒ±√ ¶¨·¬ª¤·¬²± ²© „ °≤• ∗ ¥¤¶¨§ °¨ ·«²§©²µ·«¨ µ²∏·¬±¨ ¬§¨±·¬©¬¦¤·¬²± ²© …µ¬·¬¶« Αρµιλλαρια ¶³¨¦¬¨¶q¼¦²¯ q
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≥·¨±¯¬§oŽ¤µ¯¶¶²± q‹²ª¥¨µª ‘qŒ±·µ¤¶³¨¦¬©¬¦ª¨ ±¨ ·¬¦√¤µ¬¤·¬²± ¬± Ηετεροβασιδιον αννοσυµ µ¨√ ¤¨¯ §¨¥¼ ¤°³¯¬©¬¦¤·¬²± ²© °¬±¬¶¤·¨¯ ¬¯·¨ ⁄‘„ q¼¦²¯ q• ¶¨qo
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פµ¤¶«¬°¤ŽoŽ¤º¤¶«¬°¤ ≠ q≤«¤≠ qŒ§¨ ±·¬©¬¦¤·¬²±²© Αρµιλλαριᶳ¨¦¬¨¶©µ²° ‹²®®¤¬§²¥¼ ¤±¤¯¼¶¬¶²©·«¨ ¬±·¨µª¨ ±¬¦¶³¤¦¨µkŒŠ≥l µ¨ª¬²± ²©µ¬¥²¶²°¤¯ ⁄‘„
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∂¤±¬² ∞oŽ²µ«²±¨ ± Žo¤±§‹¤±·∏¯¤qŠ¨ ±¨ ·¬¦√¤µ¬¤·¬²±¬± Πηλεβιοπσισ γιγαντεᤶ§¨·¨¦·¨§º¬·«µ¤±§²° ¤°³¯¬©¬¨§°¬¦µ²¶¤·¨¯ ¬¯·¨ k• „≥l °¤µ®¨µ¶q¼¦²¯ q
• ¶¨qot||{ otsukul }t{z ∗ t|u
∂²¯® × qΑρµιλλαρια ναβσνονα o¤ ±¨ º ¶³¨¦¬¨¶©µ²° º ¶¨·¨µ± ‘²µ·« „° µ¨¬¦¤q¼¦²¯²ª¬¤ot||{ o{{kvl }w{w ∗ w|t
• «¬·¨ ∞ ∞o⁄∏¥¨·½ ≤ ° o≤µ∏¬¦®¶«¤±®  Š oετ αλq⁄‘„ §¬¤ª±²¶·¬¦©²µΑρµιλλαριᶳ¨¦¬¨¶¬± …µ¬·¬¶«≤²¯²°¥¬¤}º¬·«¬±¤±§¥¨·º¨¨ ±¶³¨¦¬¨¶√¤µ¬¤·¬²±¬±·«¨ ŒŠ≥
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„ ª∏¬§¨ ·² °¨ ·«²§¶¤±§¤³³¯¬¦¤·¬²±¶q≥¤± ⁄¬¨ª²o≤„ o˜≥„ }„¦¤§¨ °¼ °µ¨¶¶qt||s ovtx ∗ vuu
¬¨·®¬¨º¬¦½ ∞o•¤·²±¬„ o¤±§¤¥∏§¤ ⁄q Š¨ ±²°¨ ©¬±ª¨µ³µ¬±·¬±ª¥¼ ¶¬°³¯¨¶¨ ∏´¨ ±¦¨ µ¨³¨ ¤·k≥≥• l ∗ „±¦«²µ¨§°²¯¼° µ¨¤¶¨ ≤«¤¬± • ¤¨¦·¬²± „°³¯¬©¬¦¤·¬²±q
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