全 文 ：BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH
第 16 卷　第 1 期 1996 年　1 月
Vol.16　No.1 Jan., 　1996
九种蹄盖蕨科植物配子体的酯酶同工酶分析①
林孝辉　傅桂荣　常　缨
黄永芬　汪清胤　包文美
ANALYSISOF ESTERASE ISOZYMES
NINE SPECIES OF ATHYRIACEAE
Lin Xiao-hui　Fu Gui-rong　Chang Ying
Huang Yong-fen　Wang Qing-yin　Bao Wen-mei
〔摘　要〕　本文培养了蹄盖蕨科 9个种即中华蹄盖蕨(Athyrium sinense)带
岭蹄盖蕨(A .dalingense)、多齿蹄盖蕨(A .mult identatum)(包括青柄和紫柄 2种
带岭蹄蕨类型)、东北蛾眉蕨(Lunathyrium pycnosorum)、朝鲜介蕨(Dryoathy rium
coreanum)、山冷蕨(Cystopteris sudetica)、假冷蕨(Pseudocystopteris spinulosa)、欧
洲羽节蕨(Gymnocarpium dryopteris)和黑鳞短肠蕨(Allantodia crenata)的配子体
为材料 ,进行酯酶同工酶的分析 ,以表明它们的种间差异 ,其中多齿蹄盖蕨的青柄
和紫柄两种类型的酶谱存在明显差异 ,应考虑紫柄为多齿蹄盖蕨的变型。
关键词　蕨类配子体;蹄盖蕨科;酯酶同工酶分析
蕨类植物的研究常偏重于孢子体世代 ,在配子体方面的工作做得较少 ,用同工酶分析的
方法来说明蕨类植物种间差异 ,国外用配子体为材料的同工酶分析早有过报道 。国内以孢
子体 ,为材料已开展此项研究(刘承泽 ,张百誉 1988)。但从配子体为材料开展此项研究尚
属首次。本文培养 9种蹄盖蕨科植物配子体 ,进行了酯酶同工酶的分析 ,获得明显效果 ,尤
其能以酶谱来区分多齿蹄盖蕨的青柄和紫柄的差异。
材料和方法
本文以我国东北产的蹄盖蕨科 9种为材料 ,来源见表 1 ,赁证标本现存哈尔滨师范大学
水生生物研究室 。
孢子采集　野外采集具有孢子的叶片 ,自植物体上采下后 ,放入信封中 ,待孢子囊自然
干燥开裂 ,孢子散落于信封中后 ,取出接种或置于 4℃冰箱中保存备用。
① 本文作者单位:哈尔滨 , 哈尔滨师范大学生物系(Department of Biology , Harbin Normal University , Harbin ,
150080)。　　黑龙江省自然科学基金资助项目。　　1995年 8月收到本文。
表 1 本文所用材料一览表
编号 种　　　　　　名 采集地 采集日期 采集人 赁证标本
1
中华蹄盖蕨
Athyrim sinex se
帽儿山 92.7.30 林孝辉 920730
2
带岭蹄盖蕨
A.dalingense 带　岭 92.8.8 林孝辉 920088
31
多齿蹄盖蕨(青柄)
A.multidentatum 带　岭 92.8.6 林孝辉 920730
32
多齿蹄盖蕨(紫柄)
A.multidentatum 带　岭 92.8.6 林孝辉 920731
4
东北蛾遐蕨
Lunathyrium pyconsorum
帽儿山 92.7.30 王全喜 920082
5
象鲜介蕨
Neoathy rium crenulatoserrulatum
帽儿山 92.7.30 王全喜 920083
6
山冷蕨
Cystopteris sudetica
带　岭 92.8.6 林孝辉 920086
7
假冷蕨
Pseudocystopteris spinulosa
带　岭 92.8.6 林孝辉 920084
8
欧洲羽节蕨
Cymnocarpium dryopteris
带　岭 92.8.6 林孝辉 923086
9
黑鳞短肠蕨
Allantodia crenata
带　岭 92.8.6 林孝辉 920085
配子体培养　取孢子置于 5ml离心管内 ,加入无菌水离心洗涤 2-3次 ,每次 15—20分
钟 ,最后以使孢子全部沉淀;再用 5%安替福消毒 5-7分钟 ,无菌水离心洗涤 2-3次 ,每次
3-5分钟;最后用无菌水制成悬浊液 ,均匀接种在 1.5%的改良的 Knop s琼脂培养基上 ,重
复培养 10-15次 ,每次 3-9份 ,培养过程中始终保持一定温度 。接种后先置黑暗处保存
24小时 ,以促其同步萌发 ,然后置于装有日光灯的培养架上 ,每天光照 、黑暗各 12小时 ,光
强为 1900-2000Lux ,黑暗温度 12-20℃,光下温度 20-25℃。
同工酶分析　同工酶分析取样 ,用片状体和原叶体两个不同生育期 。每克新鲜材料加
2mlPH7.2磷酸提取缓冲液 ,冰浴研磨 ,4000rpm 离心 10分钟 ,取上清液置冰箱中备用。
采用双垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,分离胶为 7.5%,浓缩胶为 2.6%,电泳缓冲液为
Tris-Gly 系统 。电泳在 4℃冰箱中进行 ,电压 300V ,电流强度 60mA ,电泳时间约 4小时。
酯酶同工酶染色方法:电泳结束后 ,采用特异性的酯酶染色液进行染色 ,染色液配方为:
称取乙酸α-萘酯和乙酸 β -萘酯各 40g ,溶于 5ml乙醇中 ,再加入坚劳兰 RR 60mg ,待溶解
后再加 0.1M 磷酸缓冲液(PH1.7)95ml。37℃温浴 30分显带清晰后水洗 ,置于蒸馏水中保
存后照相 ,记录 ,然后制成永久平板 。
1011 期　　　　　　　林孝辉等:九种蹄盖蕨科植物配子体的酯酶同工酶分析
结果和讨论
1　2　31　32　4　5　6　7　8　9
图 1　片状体时期
1.基本谱型
通过对蹄盖蕨科 7属 9 种
20个样品的酯酶同工酶分析 ,
蹄盖蕨科酯酶同工酶酶谱比较
复杂 ,不同种 、不同生育期都显
示出较多的谱带。见图 1:片状
体时期酯酶同工酶酶谱 ,图 2:
原叶体时期酯酶同工酶酶谱及
这两时期的酶谱模式图 3和模
式图 4 。
根据本次实验 , 蹄盖科 7
属 9 种 20 个样品的酯酶同工
酶共显示 28条谱带 ,按其电泳
相对迁移率的集中程度 , 由负
极可分为 A 区 、B 区 、C 区 , 各
带区酶谱描述如下:
1　2　31　32　4　5　6　7　8　9
图 2　原叶体时期
　　1.中华蹄盖蕨 , 2.带岭蹄盖蕨 , 31.多齿蹄盖蕨(青柄), 32.多齿蹄盖蕨
(紫柄), 4.东北峨眉蕨 , 5.朝鲜介蕨 , 6.山冷蕨 , 7.假冷蕨 , 8.欧洲羽节蕨 ,
9.黑鳞短肠蕨
(1)中华蹄盖蕨　片状体
时期有 16条谱带 ,即 A区有 3
条 、B 区有 8 条 、C 区有 5 条。
原叶体时期有 21条谱带 ,即 A
区 4条 、B 区 10 条 、C 区 7 条。
由片状体发育到原叶体时期新
显示的谱带共有 7 条 ,即 A -
3 , B -4 , B—6 , B—8 , C—1 ,
C—4 , C—11;消失的谱带共有
2条 ,即 B —7 , C-6。
(2)带岭蹄盖蕨　片状体
时期有 17 条谱带 , 即 A 区 3
条 、B区 8条 、C区 6条;原叶体
时期有 17 条谱带 , 即 A 区 4
条 、B 区 6 条 、C 区 7条 。由片
状体发育到原叶体时期新显示
的谱带共有 4 条 ,即 A-3 ,B —
2 ,C —7 ,C —11;消失的谱带共有 4条 ,即 B—6 ,B —8 , B—10 ,C —8。
(31)多齿蹄盖从(青柄)　片状体时期有 2 0条谱带 ,即 A区 5条 、B区 8条 、C区 7条;
原叶体时期有 1 9条谱带 ,即 A区 6条 、B区 6条 、C 区 7条。由片状体发育到原叶体时期
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新显示的谱带共有 5条 ,即A-3 ,B-6 ,C-2 ,C-3 ,C-8;消失的谱带共有 6条 ,即 B-3 ,B
-5 ,B-l0 ,C-1 ,C-5 ,C-9。
(32)多齿蹄盖蕨(紫柄)　片状体时期有 2 1条谱带 ,即 A 区 4条 、B区 9 条 、C 区 8 条;
原叶体时期有 2 0条谱带 ,即 A区 5条 、B区 8条 、C 区7条 。由片状体发育到原叶体时期 ,
新显示的谱带共有 4条 ,即A-3 ,B-6 ,C-9;消失的谱带共有 4条 ,即 B-3 , B-4 ,C-2 , C
-5。
(4)东北蛾眉蕨　从片状体时期有 1 7条谱带 ,即A区 3条 、B区 8条 、C区 6条;原叶
体时期有 17条谱带 ,即 A区 4条 、B区 6条 、C 区 7条 。由片状体发育到原叶体时期 ,新显
示的谱带共有 4条 ,即A-3 ,B-2 ,C-7 , C-11;消失的谱带共有 4 条 ,即 B-6 ,B-8 ,B-
lO ,C-8。
(5)朝鲜介蕨　片状体时期有 2 3条谱带 ,即A 区 4条 、B区 9条 、C区 l 0条;原叶体
时期有20条谱带 ,即A 区5条 、B区9条 、C区 6条。由片状体发育到原叶体时期新显示的
谱带共有 3条 ,即A-l ,B-7 ,C-11;消失的谱带共有 6条 ,即B-l0 ,C-1 ,C-2 ,C-4 ,C-
8 ,C-9。
(6)山冷蕨　片状体时期有 1 7条谱带 ,即A 区4条 、B区7条 、C 区6条;原叶体时期
有1 2条谱带 ,即A区 3条 、B区 5条 、C 区4条。由片状体发育到原叶体时期 ,新显示的谱
带共有 5条 ,即 B-2 ,B-9 ,C-7 ,C -l1;消失的谱带共有 1 0条 ,即 A-2 ,B-l ,B-3 ,B-
5 ,B-7 ,B-8 ,C-2 ,C-3 , C-6 ,C-8 。
(7)假冷蕨　片状体时期有 1 5条谱带 ,即A 区3条 、B区6条 、C 区6条;原叶体时期
有 9条谱带 ,即 A区 4条 、B区 O条 、C 区 5条。由片状体发育到原叶体时期 ,新显示的谱
带共有2条 ,即A-1 ,A-5;消失的谱带共有 8条 ,即 B-10 ,C-1 ,C-2 ,C-4 ,C-8 ,C-9。
(8)欧洲羽节蕨　片状体时期有 2 3条谱带 ,即 A区 4条 、B区 10条 、C 区 9条;原叶
体时期有 5条谱带 ,即A 区 l条 、B区 l条 、C 区 3条。由片状体发育到原叶体时期 ,新显示
的谱带为 0条;消失的谱带共有 18条 ,即 A-2 ,A-4 ,A-6 ,B-l , B-2 , B-4 ,B-5 , B-6 ,
B-7 ,B-8 ,B-9 ,B-l0 ,C-1 ,C-2 ,C-4 ,C-6 ,C-8 ,C-9。
(9)黑鳞短肠蕨　片状体时期有 2 0条谱带 ,即A 区4条 、B区7条 、C 区9条;原叶体
时期有 12条谱带 ,即 A区 4条 、B区 4条 、C区 4条。由片状体发育到原叶体时期 ,新显示
的谱带共有 1条 ,即 B-l ,消失的谱带共有 9条 ,即 B-2 ,B-4 ,B-6 ,B-8 ,C-l ,C-2 ,C-
3 ,C-4 ,C-9。
从以上 9个种的配子体酯酶同工酶酶谱的叙述中 ,可以看出此 9种在同一发育阶段同
工酶有很大的差异 ,表现出谱带的总数 、分布和强度都不一样。而且在由片状体到原叶体的
发育阶段中 ,同工酶含量亦有变化 ,其中 8个种表现出弱带和极弱带的产生和消失(模式图
4.1-7 ,9),只有欧洲羽节蕨随着生长进程 ,大量的弱带和极弱带消失(模式图 4.8),而无
一新带产生。
为了直观地表现出 9个种的酯酶同工酶分布情况 ,我们又 2个时期各种间的特征进行
比较 ,表 2.片状体时期;表 3.原叶体时期(模式图 3 、4)。
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　　表 2 片状体时期酯酶同工酶谱带分布及总带数
编号 种　　　　　名 A 区 B 区 C 区 总带数 特　征　带
1 中华蹄盖蕨 3 8 5 16
2 带岭蹄盖蕨 3 3 6 12
31 多齿蹄盖蕨(青) 5 8 7 20 A6(Rf=0.704)
C11(Rf=0.037)
32 多齿蹄盖蕨(紫) 4 9 8 21 C11(Rf=0.037)
4 东北蛾眉蕨 3 8 6 17
5 朝鲜介蕨 4 9 10 23 A4(Rf=0.765)
B1(Rf=0.691)
6 山冷蕨 4 7 6 17 A6(Rf=0.704)
7 假冷蕨 3 6 6 15
8 欧洲羽节蕨 4 10 9 23 B4(Rf=0.617)
B5(Rf=0.556)
9 黑鳞短肠蕨 4 7 9 20 B2(Rf=0.654)
图 3　片状体时期酶谱模式
　　2.发育阶段酯酶同工酶比较:
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配子体的 2个发育阶段进行取样分析 ,结果表明 ,片状体和原叶体时期其酯酶同工酶表
现不同。我们曾经对丝状体时期也做过酶谱分析 ,发现它们酯酶酶带很少 ,几乎不显现。而
在片状体时期和原叶体初期 ,则酯酶清晰 ,稳定 。尽管从片状体阶段到原叶体阶段 ,消失抑
或增加了一些酶带 ,且酶带的强弱也有变化 ,但一些特征性酶带仍然存在。例:多齿蹄盖蕨
(青柄)的 A6 , C11(模式图 3.31 ,和图 4.31);朝鲜介蕨的 A4 ,B1(模式图3.5和图 4.5);山冷
蕨的 A6(模式图 3.6和图 4.6)。因此利用酯酶同工酶对蕨类配子体进行酶谱分析必须取
材片状体和原叶体的适当时期 ,丝状体为材料是不合适的。
图 4　原叶体时期酶谱模式图
　　3.不同种的酯酶同工酶比较:
在模式图 3中 ,朝鲜介蕨的酶谱中强带 A4(Rf=0.0765)及 B1(Rf=0.691),可作为特
征性酶带与其他的酶带相区别 。另外 ,山冷蕨的酶谱带 A6(Rf=0.704)和黑鳞短肠蕨的酶
带B2(Rf=0.654)、欧洲羽节蕨的酶带 B4(Rf=0.617)及 B5(Rf=0.558),它们的强带也都
具有特异牲。东北蛾眉蕨与朝鲜介蕨在孢子形态上较为相似 ,但在同工酶酶谱上差异很大 ,
两者相比 ,东北蛾眉蕨不具有 A2 ,A3 , B2 ,B4 ,Cl ,C4 ,C7 ,C9这些酶带 , A4 ,Bl两条酶带显现
较弱 ,而又具特有的Al ,B7这两条酶带 。假冷蕨虽无较明显的特征性酶谱带 ,但总的看同工
1051 期　　　　　　　林孝辉等:九种蹄盖蕨科植物配子体的酯酶同工酶分析
酶酶谱仍具有其特异性。蹄盖蕨属的 3个种的酶谱差异也极为显著 ,尤在原叶体时期更为
明显 。
　　在模式图 4中 ,每个种的同工酶酶谱都不相同。蹄盖蕨属的 3 个种共有酶带 12
条 ,A2 ,A3 ,A4 ,A6 , Bl ,B2 ,B6 ,B8 ,B9 ,C8 , C10 ,C11 。因而在同工酶酶谱上表现出一定的相
似性 ,但它们之间又表现出高度的差异:多齿蹄盖蕨的最显著特征是酶带 A6 ,C11 为强带
(青柄)和中强带(紫柄),而中华蹄盖蕨和带岭蹄盖蕨的相应酶带显示为中强带和弱带 ,这样
多齿蹄盖蕨可以从中区分出来。而中华蹄盖蕨与带岭蹄盖蕨相比 ,中华蹄盖蕨的酶带 A4
为强带 ,带岭蹄盖蕨的相应带为较弱带 ,因而可相互区分。
表 3 原叶体时期酯酶同工酶谱带分布及总带数
编号 种　　　　　名 A 区 B 区 C 区 总带数 特　征　带
1 中华蹄盖蕨 4 10 7 21 A4(Rf=0.765)
2 带岭蹄盖蕨 5 10 9 24
31 多齿蹄盖蕨(青) 6 6 7 19 A6(Rf=0.704)
B1(Rf=0.691)
B2(Rf=0.654)
C11(Rf=0.037)
32 多齿蹄盖蕨(紫) 5 8 7 20 A4(Rf=0.765)
A6(Rf=0.704)
4 东北蛾眉蕨 4 6 7 17
5 朝鲜介蕨 5 9 6 20 A4(Rf=0.765)
B1(Rf=0.691)
6 山冷蕨 3 5 4 12 A6(Rf=0.704)
7 假冷蕨 4 5 9
8 欧洲羽节蕨 1 1 1 3
9 黑鳞短肠蕨 4 4 4 12
4.种以下的分类单位酯酶同工酶比较:
多齿蹄盖蕨的青柄与紫柄是同一种的两个不同类型 。在形态上 ,叶柄的颜色有青柄和
紫柄之别 。另外 ,据调查 ,在同一生境中 ,青柄春季出叶较早 ,叶柄的液汁粘性较小;紫柄出
叶较晚 ,液汁粘性较大。两者的食用味道亦有差异 。经分析 ,其营养成份又确有差异 ,因而
有人倾向于把青柄与紫柄作为两个分类单位而重新划分 。二者酯酶同工酶酶谱带差异明
显 ,比较如下:
特征谱带　　　　　青柄　　　　　紫柄
　　A4　　　　　中强带　　　　强　带
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　　Bl　　　　　强　带　　　　较弱带
　　B2　　　　　强　带　　　　较弱带
　 C11　　　　　强　带　　　　中强带
因此 ,我们建议紫柄可作为多齿蹄盖蕨的变型 。本文作者之二发现多齿蹄盖蕨青柄和
紫柄在孢子形态和配子体发育中也都有差异(另文发表)。
ABSTRACT
Gametophytes of nine species in Athy riaceae i.e.Athyrium sinense , A .dalingense , A .
multidentatum (ineluding tw o forms with g reen and purple stipe respectively), Lunathy rium
pycnosorum , Dryoathyrium coreanum , Cystoptreris sudetica , Pseudocystopteris spinulosa ,
Gymnocarpium dryopteris and Allantodia crenata were cultrred and analyzed using easterase
isoenzyme electrophoresis.The enzyme banding pat terns show various differences each other a-
mong them.Within the species Athy rium multidentatum there are also obvious differences be-
tween two forms w ith green and purple stipe , that is to say , this two forms show different en-
zyme banding pat terns.So it is suggested that if the g reen stipe form is reg arded as the type
species of Athyrium multidentatum , the purple stipe form may be regarded as its forma.
Key words　Fern Gametophy te;Athyriaceae;Easterase isoenzyme.
参　　考　　文　　献
〔1〕 包文美 、敖志文等 , 1988:东北蕨类配子体发育的研究 , V 球子蕨科 植物研究 8(3):193-208。
〔2〕 朱英国 , 1982:水稻品种酯酶同工酶的初步研究 ,作物学报 8(2):73-79。
〔3〕 李继耕等 , 1980:栽培玉米起源的同工酶研究 ,遗传学报 7(3):223-230。
〔4〕 张相歧 、王海廷 、黄永芬 、汪清胤 , 1987:番茄属四个种的过氧化物酶同工酶分析 ,植物研究　7(4):133-152。
〔5〕 Gastony G.J.and L.D.Got tlieb , 1982 Evidence for genet ic heterozygosity in a homosporous fern.Amer.J.Bot.69(4):
634-637。
〔6〕 Hauf ler , C.H.and D.E.Soltis 1984 Obligate outcrossing in a homosporous fern:f ield confi rmation of a laboratory predic-
t ion.Amer.J.Bot.71(6):878-881。
〔7〕 Liu Cheng-ze、Zhang Bai-yu et al.Peroxidase isozymograms of sixteen species in fern genus Dryopteri s , Proceedings of
the international symposium on systematic pteridology , 299-308。
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