全 文 ：苹果炭疽病病原菌 陨杂杂砸鄄孕悦砸反应体系的
优化及遗传多样性分析
符丹丹员袁 圆 摇 庄杰丽员 摇 张摇 荣员 摇 孙广宇员鄢
渊员援西北农林科技大学植物保护学院袁 旱区作物逆境生物学国家重点实验室袁 陕西 杨凌 苑员圆员园园曰
圆援河南科技大学食品与生物工程学院袁 洛阳 源苑员园圆猿冤
摘要院 为了从分子水平探讨苹果炭疽病病原菌的群体遗传多样性袁采用 蕴员远渊源缘冤正交设计对 陨杂杂砸鄄
孕悦砸反应体系中的 酝早圆 垣浓度尧凿晕栽孕浓度尧栽葬择 阅晕粤 聚合酶用量尧引物浓度和 阅晕粤 含量进行优化袁
并利用优化的体系进行引物筛选及苹果炭疽病菌遗传多样性分析遥 确立最优反应体系为 圆援 园
皂皂燥造 辕 蕴 酝早圆 垣 尧园援 圆 皂皂燥造 辕 蕴 凿晕栽孕尧圆 哉 栽葬择 阅晕粤聚合酶尧员 滋皂燥造 辕 蕴 引物和 阅晕粤 员园园 灶早遥 筛选获得的
员园 条引物对供试菌株共扩增出 源圆 条谱带袁均为多态性条带遥 供试菌株在相似系数 园援 缘园 处分为 圆
个类群袁分别与根据形态学鉴定的胶孢刺盘孢 悦燥造造藻贼燥贼则蚤糟澡怎皂 早造燥藻燥泽责燥则蚤燥蚤凿藻泽 和尖孢刺盘孢 悦援 葬糟怎贼葬鄄
贼怎皂 圆 个类群相一致袁在相似系数 园援 苑源 处袁分为 源 个亚群袁表明苹果炭疽病菌存在明显的种间及种
内遗传分化遥
关键词院 苹果炭疽病曰 胶孢刺盘孢曰 尖孢刺盘孢曰 种群
韵责贼蚤皂蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 陨杂杂砸鄄孕悦砸 则藻葬糟贼蚤燥灶 泽赠泽贼藻皂 葬灶凿 早藻灶藻贼蚤糟 凿蚤增藻则泽蚤贼赠 葬灶葬造赠泽蚤泽
燥枣 悦燥造造藻贼燥贼则蚤糟澡怎皂 泽责藻糟蚤藻泽 糟葬怎泽蚤灶早 遭蚤贼贼藻则 则燥贼 燥枣 葬责责造藻
云怎 阅葬灶凿葬灶员袁 圆 摇 在澡怎葬灶早 允蚤藻造蚤员 摇 在澡葬灶早 砸燥灶早员 摇 杂怎灶 郧怎葬灶早赠怎员鄢
渊员援 杂贼葬贼藻 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 悦则燥责 杂贼则藻泽泽 月蚤燥造燥早赠 枣燥则 粤则蚤凿 粤则藻葬泽袁 悦燥造造藻早藻 燥枣 孕造葬灶贼 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶袁 晕燥则贼澡憎藻泽贼 粤驭云
哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 再葬灶早造蚤灶早 苑员圆员园园袁 杂澡葬葬灶曾蚤 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬曰 圆援 悦燥造造藻早藻 燥枣 云燥燥凿 驭 月蚤燥藻灶早蚤灶藻藻则蚤灶早袁 匀藻灶葬灶
哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠 燥枣 杂糟蚤藻灶糟藻 葬灶凿 栽藻糟澡灶燥造燥早赠袁 蕴怎燥赠葬灶早 源苑员园圆猿袁 匀藻灶葬灶 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 栽燥 怎灶凿藻则泽贼葬灶凿 贼澡藻 责燥责怎造葬贼蚤燥灶 早藻灶藻贼蚤糟 凿蚤增藻则泽蚤贼赠 燥枣 责葬贼澡燥早藻灶泽 葬泽泽燥糟蚤葬贼藻凿 憎蚤贼澡 葬责责造藻 遭蚤贼贼藻则 则燥贼 葬贼
贼澡藻 皂燥造藻糟怎造葬则 造藻增藻造袁 贼澡藻 燥则贼澡燥早燥灶葬造 凿藻泽蚤早灶 燥枣 蕴员远渊源缘冤 憎葬泽 怎泽藻凿 贼燥 燥责贼蚤皂蚤扎藻 陨杂杂砸鄄孕悦砸 则藻葬糟贼蚤燥灶 则藻造葬贼藻凿 贼燥
枣葬糟贼燥则泽 蚤灶糟造怎凿蚤灶早 酝早圆 垣 袁 凿晕栽孕袁 栽葬择 阅晕粤 责燥造赠皂藻则葬泽藻袁 责则蚤皂藻则 葬灶凿 阅晕粤援 陨杂杂砸 责则蚤皂藻则泽 憎藻则藻 泽糟则藻藻灶藻凿
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糟葬怎泽蚤灶早 遭蚤贼贼藻则 则燥贼 燥枣 葬责责造藻援 栽澡藻 燥责贼蚤皂蚤扎藻凿 陨杂杂砸鄄孕悦砸 泽赠泽贼藻皂 憎葬泽 葬泽 枣燥造造燥憎泽院 圆援 园 皂皂燥造 辕 蕴 酝早圆 垣 袁 园援 圆
皂皂燥造 辕 蕴 凿晕栽孕袁 圆 哉 栽葬择 阅晕粤 责燥造赠皂藻则葬泽藻袁 员 滋皂燥造 辕 蕴 责则蚤皂藻则 葬灶凿 员园园 灶早 阅晕粤援 云燥则贼赠鄄贼憎燥 责燥造赠皂燥则责澡蚤糟
遭葬灶凿泽 憎藻则藻 葬皂责造蚤枣蚤藻凿 憎蚤贼澡 员园 泽糟则藻藻灶藻凿 责则蚤皂藻则泽援 悦造怎泽贼藻则蚤灶早 葬灶葬造赠泽蚤泽 则藻增藻葬造藻凿 贼澡葬贼 贼藻泽贼藻凿 泽贼则葬蚤灶泽 憎藻则藻 糟造怎泽鄄
贼藻则藻凿 蚤灶贼燥 圆 早则燥怎责泽 葬贼 园援 缘园 早藻灶藻贼蚤糟 泽蚤皂蚤造葬则蚤贼赠 糟燥藻枣枣蚤糟蚤藻灶贼袁 憎澡蚤糟澡 糟燥则则藻泽责燥灶凿藻凿 憎蚤贼澡 皂燥则责澡燥造燥早蚤糟葬造 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤鄄
糟葬贼蚤燥灶 贼燥 悦援 早造燥藻燥泽责燥则蚤燥蚤凿藻泽 葬灶凿 悦援 葬糟怎贼葬贼怎皂袁 葬灶凿 源 泽怎遭早则燥怎责泽 葬贼 园援 苑源 造藻增藻造援 陨贼 蚤灶凿蚤糟葬贼藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻则藻 憎藻则藻
燥遭增蚤燥怎泽 蚤灶贼藻则泽责藻糟蚤藻泽 葬灶凿 蚤灶贼则葬泽责藻糟蚤藻泽 早藻灶藻贼蚤糟 增葬则蚤葬贼蚤燥灶泽 葬皂燥灶早 贼澡藻 责葬贼澡燥早藻灶泽 糟葬怎泽蚤灶早 葬责责造藻 遭蚤贼贼藻则 则燥贼援
运藻赠 憎燥则凿泽院 葬责责造藻 遭蚤贼贼藻则 则燥贼曰 悦燥造造藻贼燥贼则蚤糟澡怎皂 早造燥藻燥泽责燥则蚤燥蚤凿藻泽曰 悦燥造造藻贼燥贼则蚤糟澡怎皂 葬糟怎贼葬贼怎皂曰 责燥责怎造葬贼蚤燥灶
基金项目院 国家自然科学基金 渊猿员员苑员苑怨苑冤
作者简介院 符丹丹袁女袁员怨苑怨年生袁博士研究生袁研究方向为真菌分类学袁 耘鄄皂葬蚤造院 枣怎凿葬灶凿葬灶造赠岳 员圆远援 糟燥皂
鄢通讯作者渊粤怎贼澡燥则 枣燥则 糟燥则则藻泽责燥灶凿藻灶糟藻冤袁 耘鄄皂葬蚤造院 泽早赠岳 灶憎泽怎葬枣援 藻凿怎援 糟灶
收稿日期院 圆园员猿 原 园员 原 园源
第 源园 卷摇 第 猿 期
圆园员猿 年摇 远 月
植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报
粤悦栽粤 孕匀再栽韵孕匀再蕴粤悦陨悦粤 杂陨晕陨悦粤
灾燥造援 源园摇 晕燥援 猿
允怎灶藻 摇 圆园员猿
摇 摇 苹果炭疽病袁又称苹果苦腐病袁是苹果的重要病
害袁在苹果种植区普遍发生袁可引起生长期果实腐烂
和落果袁以及采后贮藏期果腐咱员暂 袁在有些地区还可
引起叶片枯萎导致早期落叶袁给苹果生产造成严重
损失咱圆暂 遥 苹果炭疽病菌包括胶孢刺盘孢 悦燥造造藻贼燥贼则蚤鄄
糟澡怎皂 早造燥藻燥泽责燥则蚤燥蚤凿藻泽 渊孕藻灶扎援 冤 孕藻灶扎援 驭 杂葬糟糟援 渊有性态
郧造燥皂藻则藻造造葬 糟蚤灶早怎造葬贼葬 渊 杂贼燥灶藻皂葬灶 冤 杂责葬怎造凿援 驭 匀援
杂糟澡则藻灶噪冤 咱猿暂和尖孢刺盘孢 悦援 葬糟怎贼葬贼怎皂 允援 匀援 杂蚤皂鄄
皂燥灶凿泽渊有性态 郧援 葬糟怎贼葬贼葬 郧怎藻则遭藻则 驭 允援 悦援 悦燥则则藻造造冤 咱源暂 遥
在我国袁王晓鸣和李建义咱缘暂最早将苹果炭疽病的病
原鉴定为胶孢刺盘孢袁圆园园愿 年 在澡葬灶早 等咱远暂研究发
现袁尖孢刺盘孢也可引起苹果炭疽病遥 国外则有
郧燥灶扎觃造藻扎等咱圆暂利用限制性片段长度多态性渊 则藻泽贼则蚤糟鄄
贼蚤燥灶 枣则葬早皂藻灶贼 造藻灶早贼澡 责燥造赠皂燥则责澡蚤泽皂袁砸云蕴孕冤技术分析了
美国和巴西的苹果炭疽病菌的遗传多样性袁其中围
小丛壳 郧造燥皂藻则藻造造葬 糟蚤灶早怎造葬贼葬分为 苑 个分支袁胶孢刺盘
孢和尖孢刺盘孢各分为 圆 个分支曰蕴藻藻 等咱苑暂应用随
机扩增多态性渊 则葬灶凿燥皂 葬皂责造蚤枣蚤藻凿 责燥造赠皂燥则责澡蚤糟 阅晕粤袁
砸粤孕阅冤技术研究韩国苹果炭疽病菌的遗传多样性袁
将胶孢刺盘孢分为 源 个分支袁尖孢刺盘孢分为 圆 个
分支遥 研究表明苹果炭疽病菌在病原种类尧形态学尧
遗传学方面都具有丰富的多样性遥
我国对苹果炭疽病菌种群多样性的研究较少遥
目前袁常用于植物病原菌种群遗传多样性分析的分
子生物学技术主要有 砸云蕴孕尧砸粤孕阅尧扩增片段长度多
态性渊葬皂责造蚤枣蚤藻凿 枣则葬早皂藻灶贼 造藻灶早贼澡 责燥造赠皂燥则责澡蚤泽皂袁粤云蕴孕冤
和简单重复序列间隔区 渊 蚤灶贼藻则鄄泽蚤皂责造藻 泽藻择怎藻灶糟藻 则藻鄄
责藻葬贼袁陨杂杂砸冤等遥 其中袁砸云蕴孕 技术操作繁琐尧检测周
期长且成本较高曰砸粤孕阅技术对反应条件敏感尧重复
性不高曰粤云蕴孕 技术重复性高袁但操作繁琐尧费用较
高曰陨杂杂砸 技术是由 在蚤藻贼噪蚤藻憎蚤糟扎 等咱愿暂于 员怨怨源 年创建
的分子标记袁其多态性好尧稳定性强尧重复性高且操
作简单咱怨暂 遥 本试验通过正交设计对 陨杂杂砸鄄孕悦砸 反应
体系进行优化袁并利用优化的体系进行引物筛选及
苹果炭疽病菌遗传多样性分析袁以期建立一套适合
于苹果炭疽病菌的 陨杂杂砸反应体系袁为苹果炭疽病菌
的遗传多样性分析提供技术支撑遥
员 材料与方法
员援 员 材料
供试菌株院多样性分析选用 圆园员园 年采自辽宁省
绥中县大台山尧前所镇和王凤台镇袁兴城市双树乡和
元台子乡袁葫芦岛市袁瓦房店市得利寺镇袁以及庄河
市步云山乡等 愿 个苹果产区富士病果的 员源 个菌株院
云员园孕郧悦允允员尧 云员园孕郧悦允允猿尧 云员园孕郧匀蕴阅猿尧 云员园孕郧杂蕴在猿尧
云员园孕郧宰云栽圆尧云员园孕郧月再杂员尧云员园孕郧月再杂猿 耀缘尧云员园孕郧月鄄
再杂苑 耀 员园尧云员园孕郧月再杂员圆遥 正交试验采用河南郑州尧
陕西乾县和礼泉县的 云员员孕郧在匀园圆尧云员员孕郧匝载员苑 和
云员圆孕郧蕴匝猿猿 等 猿 个菌株遥 供试菌株均保藏于西北
农林科技大学真菌研究室遥
试剂院阅晕粤 标准分子量 阅杂栽酝圆园园园袁广州东盛生
物科技有限公司曰十六烷基三甲基溴化铵渊悦栽粤月冤尧
琼脂糖尧遭怎枣枣藻则尧凿晕栽孕尧酝早圆 垣 尧栽葬择 阅晕粤 聚合酶袁均购
自西安沃尔森生物技术有限公司曰供试引物为哥伦
比亚大学公布的 猿缘 条引物院愿园员尧愿园源尧愿园苑尧愿员园尧愿员猿尧
愿员远尧愿圆圆尧愿圆缘尧愿圆远尧愿圆愿尧愿猿缘尧愿猿远尧愿源园尧愿源员尧愿源怨尧愿缘缘尧
愿远猿尧愿远源尧愿远怨尧愿苑猿尧愿愿远尧愿愿愿尧愿愿怨尧愿怨愿尧怨园员尧酝员尧孕员 耀
孕远尧允韵匀晕尧栽耘砸砸再和 酝粤韵袁由上海生工生物工程技
术有限公司合成遥
仪器院月载缘员 显微镜尧阅孕苑圆 数码成像系统袁日本
奥林巴斯株式会社曰孕燥憎藻则孕葬糟栽酝电泳仪尧杂员园园园栽酝 孕悦砸
扩增仪尧哉灶蚤增藻则泽葬造 匀燥燥凿域凝胶成像系统袁伯乐生命
医学产品渊上海冤有限公司曰晕葬灶燥凿则燥责 圆园园园 核酸蛋白
检测仪袁美国赛默飞世尔科技渊中国冤有限公司曰
缘愿园源砸冷冻高速离心机袁德国艾本德渊中国冤有限公
司遥
员援 圆 方法
员援 圆援 员 病原菌鉴定
根据 杂怎贼贼燥灶咱猿暂分类系统对采自辽宁的 员源 株菌
株进行形态学鉴定遥 将分离株接种于 孕阅粤 培养基
上袁员圆 澡光暗交替条件下 圆缘 益培养袁待菌落长满全
皿后袁观察分离株分生孢子形态及培养特征遥
员援 圆援 圆 基因组 阅晕粤的提取
供试菌株在 孕阅粤 培养基上 圆缘 益恒温培养 苑 凿袁
用接种针挑取菌丝置于离心管中袁用改良的 悦栽粤月
法咱员园暂提取基因组 阅晕粤遥 提取的 阅晕粤用核酸蛋白检
测仪测定浓度与纯度遥
员援 圆援 猿 陨杂杂砸鄄孕悦砸扩增体系的正交设计
正交试验院采用 蕴员远渊源缘冤正交设计袁对 陨杂杂砸鄄孕悦砸
反应体系中 酝早圆 垣 浓度 渊 粤冤尧 凿晕栽孕 浓度 渊 月冤尧栽葬择
阅晕粤聚合酶用量渊悦冤尧引物浓度渊阅冤和 阅晕粤 含量
渊耘冤等 缘 个因素进行正交试验遥 经过预试验选取引
物 愿员园 为 孕悦砸引物袁反应体系总体积为 圆缘 滋蕴袁其中
员园 伊 遭怎枣枣藻则 圆援 缘 滋蕴袁不足部分用无菌超纯水补足遥 扩
增反应程序院怨源 益预变性 缘 皂蚤灶曰怨源益变性 猿园 泽袁缘员益
退火 员 皂蚤灶袁苑圆 益延伸 员援 缘 皂蚤灶袁源园 个循环曰最后 苑圆 益
圆猿圆 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源园 卷
延伸 员园 皂蚤灶遥 在相同条件下分别对 猿 个菌株
云员员孕郧在匀园圆尧云员员孕郧匝载员苑 和 云员圆孕郧蕴匝猿猿 进行 孕悦砸
扩增遥
电泳检测院孕悦砸 扩增产物用 员援 园豫琼脂糖凝胶
进行电泳袁缓冲液为 员 伊 栽粤耘袁电压 员猿园 灾袁在凝胶成
像仪上观察电泳结果并照相遥
谱带计分院根据条带的数量和亮度对电泳谱带
进行记分袁条带最多尧最亮的谱带记为最高分 员远 分袁
无扩增条带的处理记为 园 分袁其它依据条带的数目
及亮度从高到低依次记分咱员员暂 遥
数据分析院正交试验所得数据用 杂孕杂杂 员怨援 园 软
件进行方差分析袁以便排除可能存在的试验误差遥
员援 圆援 源 陨杂杂砸引物的筛选及退火温度优化
利用优化的 陨杂杂砸鄄孕悦砸反应体系袁对 猿缘 条 陨杂杂砸
通用引物进行筛选遥 将 孕悦砸 反应的温度梯度设置
为 源愿 耀 缘圆 益袁其间温度梯度由 孕悦砸 仪自动生成遥
供试菌株采用 圆 个胶孢刺盘孢 云员员孕郧在匀园圆尧
云员员孕郧匝载员苑 和 员 个尖孢刺盘孢 云员园孕郧月再杂员园 菌株遥
以多态性条带多的引物为合适引物袁以扩增结果稳
定尧条带最亮的温度为最佳退火温度遥
员援 圆援 缘 遗传多样性分析
以电泳条带作为遗传位点进行统计袁有条带赋
值为野员冶袁无条带赋值为野园冶袁构建 园尧员 二元矩阵遥
利用软件 晕栽杂再杂责糟 圆援 员园藻 中非加权类平均聚类法
渊怎灶憎藻蚤早澡贼藻凿 责葬蚤则鄄早则燥怎责 皂藻葬灶 葬增藻则葬早藻袁 哉孕郧酝粤冤进行
聚类分析袁并绘制亲缘关系树状图咱员圆暂 遥
圆 结果与分析
圆援 员 病原菌鉴定
供试菌株 云员园孕郧悦允允员尧云员园孕郧悦允允猿尧云员园孕郧匀蕴阅猿尧
云员园孕郧杂蕴在猿 和 云员园孕郧宰云栽圆 具有典型的两端钝圆或
一端渐尖尧圆柱状的分生孢子袁归属胶孢刺盘孢 悦援
早造燥藻燥泽责燥则蚤燥蚤凿藻泽曰云员园孕郧月再杂员尧云员园孕郧月再杂猿 耀缘尧云员园孕郧鄄
月再杂苑 耀 员园 和 云员园孕郧月再杂员圆 具有两端渐尖梭状的分
生孢子袁归属尖孢刺盘孢 悦援 葬糟怎贼葬贼怎皂遥 菌落培养特
征院 胶 孢 刺 盘 孢 菌 株 云员园孕郧悦允允员尧 云员园孕郧悦允允猿尧
云员园孕郧匀蕴阅猿 和 云员园孕郧杂蕴在猿 菌落疏松如棉絮状袁浅
灰色曰菌株 云员园孕郧宰云栽圆 菌落致密如毡状袁气生菌丝
较纤细袁 深灰色至灰黑色曰 尖孢刺盘孢菌株
云员园孕郧月再杂员圆 为灰白色菌落袁产孢能力较弱曰其它菌
株都能在菌落中产生粉红色色素袁产孢能力较强遥
圆援 圆 陨杂杂砸鄄孕悦砸正交试验分析
陨杂杂砸鄄孕悦砸正交试验 缘 因素 源 水平 员远 组合的处
理及引物 愿员园 对菌株 云员员孕郧在匀园圆尧云员员孕郧匝载员苑 和
云员圆孕郧蕴匝猿猿 的扩增条带分值分别见表 员遥 引物 愿员园
对菌株 云员员孕郧在匀园圆 正交试验的扩增电泳图谱见图
员袁其中处理 员尧怨尧员猿 泳道处无扩增条带袁处理 愿 的谱
带最亮袁其它处理的条带均较模糊遥
表 员 陨杂杂砸鄄孕悦砸正交设计水平及扩增条带分值
栽葬遭造藻 员 蕴藻增藻造泽 燥枣 陨杂杂砸鄄孕悦砸 燥则贼澡燥早燥灶葬造 凿藻泽蚤早灶 葬灶凿 泽糟燥则藻 燥枣 遭葬灶凿泽
处理
栽则藻葬贼皂藻灶贼
酝早圆 垣
渊皂皂燥造 辕 蕴冤
粤
凿晕栽孕
渊皂皂燥造 辕 蕴冤
月
栽葬择聚合酶渊哉冤
栽葬择 责燥造赠皂藻则葬泽藻
悦
引物 孕则蚤皂藻则
渊滋皂燥造 辕 蕴冤
阅
阅晕粤
渊灶早冤
耘
条带分值 杂糟燥则藻 燥枣 遭葬灶凿
云员员孕郧在匀园圆 云员员孕郧匝载员苑 云员圆孕郧蕴匝猿猿
员 员援 缘 园援 园缘 员援 园 园援 源 圆缘 园 园 圆
圆 员援 缘 园援 员园 员援 缘 园援 愿 缘园 缘 圆 员
猿 员援 缘 园援 员缘 圆援 园 员援 圆 苑缘 员园 猿 怨
源 员援 缘 园援 圆园 圆援 缘 员援 远 员园园 员员 员猿 员园
缘 圆援 园 园援 园缘 员援 缘 员援 圆 员园园 员 园 缘
远 圆援 园 园援 员园 员援 园 员援 远 苑缘 圆 员 源
苑 圆援 园 园援 员缘 圆援 缘 园援 源 缘园 员缘 员缘 员猿
愿 圆援 园 园援 圆园 圆援 园 园援 愿 圆缘 员远 员远 员远
怨 圆援 缘 园援 园缘 圆援 园 员援 远 缘园 园 园 猿
员园 圆援 缘 园援 员园 圆援 缘 员援 圆 圆缘 猿 源 愿
员员 圆援 缘 园援 员缘 员援 园 园援 愿 员园园 源 缘 愿
员圆 圆援 缘 园援 圆园 员援 缘 园援 源 苑缘 员源 员员 员缘
员猿 猿援 园 园援 园缘 圆援 缘 园援 愿 苑缘 园 园 苑
员源 猿援 园 园援 员园 圆援 园 园援 源 员园园 员猿 员源 员源
员缘 猿援 园 园援 员缘 员援 缘 员援 远 圆缘 苑 苑 员圆
员远 猿援 园 园援 圆园 员援 园 员援 圆 缘园 愿 怨 员员
猿猿圆猿 期 符丹丹等院苹果炭疽病病原菌 陨杂杂砸鄄孕悦砸反应体系的优化及遗传多样性分析
图 员 引物 愿员园 对菌株 云员员孕郧在匀园圆 的
陨杂杂砸鄄孕悦砸扩增电泳图
云蚤早援 员 栽澡藻 陨杂杂砸鄄孕悦砸 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 蚤泽燥造葬贼藻
云员员孕郧在匀园圆 遭赠 责则蚤皂藻则 愿员园
摇 摇 注院酝院阅晕粤 标准分子量 阅杂栽酝 圆园园园曰员 耀 员远院处理编号如表 员
所示遥 晕燥贼藻院 酝院 阅晕粤 皂葬则噪藻则 阅杂栽酝 圆园园园曰 员 原 员远院 贼澡藻 灶怎皂遭藻则 燥枣
贼则藻葬贼皂藻灶贼 葬泽 栽葬遭造藻 员援
摇 摇 方差分析结果表明袁在 孕悦砸反应体系中 缘 个因
素对扩增效果的影响由大到小为 月 跃 阅 跃 耘 跃 悦 跃 粤曰
粤尧月尧悦和 阅 因素的差异性在 园援 园员 水平显著袁而 耘
因素差异不显著曰各因素均值最高的水平为
粤圆月源悦猿阅员耘源袁代表每个因素的最优水平遥 由此最终
确定 陨杂杂砸鄄孕悦砸 反应体系最优水平为 圆援 园 皂皂燥造 辕 蕴
酝早圆 垣 尧 园 援 圆 皂皂燥造 辕 蕴 凿晕栽孕 尧 圆 哉 栽葬择 阅晕粤聚合酶 尧
员 滋皂燥造 辕 蕴引物尧阅晕粤 员园园 灶早渊表 圆冤遥
圆援 猿 引物筛选及退火温度的确定
利用优化的反应体系袁选取 猿缘 条 陨杂杂砸 通用引
物进行筛选袁共获得 员园 条谱带多态性较好的引物
愿园苑尧愿员园尧愿员远尧愿圆缘尧愿猿缘尧愿源员尧愿缘缘尧愿远源尧愿愿远 和 愿愿怨遥
这些引物的序列及其最适退火温度如表 猿 所示遥 利
用筛选的引物对 员源 个供试菌株进行 孕悦砸 扩增袁每
个引物均能扩增出 猿 耀 缘 个条带袁扩增条带大小在
员园园 耀 圆 园园园 遭责之间袁共计扩增出 源圆 个条带袁且均为
多态性条带遥 其中袁引物 愿圆缘 对 员源 株供试菌株共扩
增出 缘 条多态性条带遥 胶孢刺盘孢 云员园孕郧悦允允员尧
云员园孕郧悦允允猿尧云员园孕郧匀蕴阅猿 和 云员园孕郧杂蕴在猿 菌株扩增的
条带完全相同袁共扩增出 猿 条条带袁云员园孕郧宰云栽圆 也
有 猿 条多态性条带袁但其遗传位点略有差别曰尖孢刺
盘 孢 中 云员园孕郧月再杂员尧 云员园孕郧月再杂猿尧 云员园孕郧月再杂缘尧
云员园孕郧月再杂苑尧云员园孕郧月再杂愿 和 云员园孕郧月再杂怨 均扩增出 源
条相同的多态性条带袁云员园孕郧月再杂源 和 云员园孕郧月再杂员园
均只有 员 条条带袁云员园孕郧月再杂员圆 有 圆 条多态性条带袁
且其位点和其它尖孢刺盘孢有一定区别渊图 圆冤遥 结
果表明所筛选的引物具有较好的 陨杂杂砸多态性袁适合
苹果炭疽病菌遗传多样性分析遥
表 圆 陨杂杂砸鄄孕悦砸正交试验结果方差分析
栽葬遭造藻 圆 灾葬则蚤葬灶糟藻 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼澡藻 陨杂杂砸鄄孕悦砸 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 遭葬泽藻凿 燥灶 贼澡藻 燥则贼澡燥早燥灶葬造 凿藻泽蚤早灶
变量来源
杂燥怎则糟藻
离均差平方和
杂怎皂 燥枣 泽择怎葬则藻泽
自由度
阅藻早则藻藻 燥枣 枣则藻藻凿燥皂
均方差
酝藻葬灶 泽择怎葬则藻
云检验
云 贼藻泽贼
孕值
孕 增葬造怎藻
粤 怨员援 缘远 猿 猿园援 缘圆 远援 员愿 园援 园园圆
月 苑愿缘援 缘远 猿 圆远员援 愿缘 缘猿援 园猿 园援 园园园
悦 员远苑援 缘远 猿 缘缘援 愿缘 员员援 猿员 园援 园园园
阅 员苑远援 圆猿 猿 缘愿援 苑源 员员援 怨园 园援 园园园
耘 圆猿援 缘远 猿 苑援 愿缘 员员援 缘怨 园援 圆园园
误差 耘则则燥则 员缘愿援 园园 猿圆 源援 怨源
总和 栽燥贼葬造 猿 怨员员援 园园 源愿
摇 摇 注院粤院酝早圆 垣浓度曰月院凿晕栽孕浓度曰悦院栽葬择 阅晕粤聚合酶用量曰阅院引物浓度曰耘院阅晕粤含量遥 晕燥贼藻院 粤院 酝早圆 垣 曰 月院 凿晕栽孕曰 悦院 栽葬择 阅晕粤 责燥造赠鄄
皂藻则葬泽藻曰 阅院 责则蚤皂藻则曰 耘院 阅晕粤援
圆援 源 陨杂杂砸鄄孕悦砸聚类分析
从聚类分析树状图渊图 猿冤可以看出袁在遗传相
似系数 园援 缘园 水平袁员源 个供试菌株划分为胶孢刺盘
孢和尖孢刺盘孢 圆 个类群袁与形态学鉴定结果一致遥
在遗传相似系数 园援 苑源 水平袁供试菌株划分为 源
个亚群遥 其中胶孢刺盘孢类群分成 圆 个亚群院亚类
群玉包括菌株 云员园孕郧悦允允员尧云员园孕郧悦允允猿尧云员园孕郧匀蕴阅猿
和 云员园孕郧杂蕴在猿袁它们的菌落特征和形态特征均相
近曰亚类群域含有 员 个菌株 云员园孕郧宰云栽圆袁该亚群与
亚类群玉的菌株在菌落形态上存在差别遥 尖孢刺盘
孢类群也划分为 圆 个亚群院亚类群芋包括菌株
云员园孕郧月再杂员尧云员园孕郧月再杂猿 耀 缘 和 云员园孕郧月再杂苑 耀 员园 等
愿 个菌株曰亚类群郁为菌株 云员园孕郧月再杂员圆袁该菌株的
菌落特征与亚类群芋的菌株也有差异遥 结果表明辽
宁省苹果炭疽病由胶孢刺盘孢和尖孢刺盘孢两种病
原菌引起袁两种病原菌还存在明显的种内遗传分化遥
源猿圆 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源园 卷
表 猿 筛选的 陨杂杂砸引物及其最适退火温度
栽葬遭造藻 猿 杂糟则藻藻灶藻凿 责则蚤皂藻则泽 燥枣 陨杂杂砸 葬灶凿 燥责贼蚤皂怎皂 葬灶灶藻葬造蚤灶早 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻
引物
孕则蚤皂藻则
序列摇 摇
杂藻择怎藻灶糟藻摇 摇
最适退火温度渊益冤
韵责贼蚤皂怎皂 葬灶灶藻葬造蚤灶早 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻
扩增带数
晕燥援 燥枣 葬皂责造蚤枣蚤藻凿 遭葬灶凿泽
愿园苑 粤郧粤 郧粤郧 粤郧粤 郧粤郧 粤郧粤 郧栽 缘圆 源
愿员园 郧粤郧 粤郧粤 郧粤郧 粤郧粤 郧粤郧 粤栽 缘员 源
愿员远 悦粤悦 粤悦粤 悦粤悦 粤悦粤 悦粤悦 粤栽 缘园 缘
愿圆缘 粤悦粤 悦粤悦 粤悦粤 悦粤悦 粤悦粤 悦栽 源愿 源
愿猿缘 粤郧粤 郧粤郧 粤郧粤 郧粤郧 粤郧粤 郧再悦 缘园 缘
愿源员 郧粤郧 粤郧粤 郧粤郧 粤郧粤 郧粤郧 粤再悦 源愿 缘
愿缘缘 粤悦粤 悦粤悦 粤悦粤 悦粤悦 粤悦粤 悦再栽 缘员 缘
愿远源 粤栽郧 粤栽郧 粤栽郧 粤栽郧 粤栽郧 粤栽郧 缘园 源
愿愿远 灾阅灾 悦栽悦 栽悦栽 悦栽悦 栽悦栽 悦栽 缘圆 猿
愿愿怨 阅月阅 粤悦粤 悦粤悦 粤悦粤 悦粤悦 粤悦 缘员 猿
合计 栽燥贼葬造 源圆
摇 摇 晕燥贼藻院 再 越 渊悦袁 栽冤曰 月 越 渊悦袁 郧袁 栽冤曰 阅 越 渊粤袁 郧袁 栽冤曰 灾 越 渊粤袁 悦袁 郧冤援
图 圆 引物 愿圆缘 对 员源 株供试菌株的
陨杂杂砸鄄孕悦砸扩增电泳图
云蚤早援 圆 栽澡藻 陨杂杂砸鄄孕悦砸 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 员源
贼藻泽贼藻凿 泽贼则葬蚤灶泽 憎蚤贼澡 责则蚤皂藻则 愿圆缘
摇 摇 晕燥贼藻院 酝院 阅晕粤 皂葬则噪藻则 阅杂栽酝圆园园园曰 员院 云员园孕郧悦允允员曰 圆院 云员园孕郧鄄
悦允允猿曰 猿院 云员园孕郧匀蕴阅猿曰 源院 云员园孕郧杂蕴在猿曰 缘院 云员园孕郧宰云栽圆曰 远院
云员园孕郧月再杂员曰 苑院 云员园孕郧月再杂猿曰 愿院 云员园孕郧月再杂源曰 怨院 云员园孕郧月再杂缘曰
员园院 云员园孕郧月再杂苑曰 员员院 云员园孕郧月再杂愿曰 员圆院 云员园孕郧月再杂怨曰 员猿院 云员园孕郧鄄
月再杂员园曰 员源院 云员园孕郧月再杂员圆援
猿 讨论
陨杂杂砸鄄孕悦砸反应体系受诸多因素相互影响袁因此
需要进行优化处理遥 正交试验通过一定的组合设计
能够以较少的试验次数全面反映各因素的最优水
平袁具有操作简便尧试验强度低等优点袁已在很多植
物病原菌的遗传多样性研究中应用遥 但是袁大多数
研究仅选用一个菌株进行正交试验袁采用极差分析
方法咱员员暂或者通过肉眼直接观察电泳条带数目及亮
度咱员圆 原 员源暂得到最优组合袁均难以避免出现误差遥 本试
验采用方差分析方法能够区分因素水平的变化与试
验误差所引起的差异袁从而获得最优体系遥 另外袁苹
果炭疽病菌在种群构成上较复杂袁因此本试验选取
了在遗传上具有一定差异的 猿 个菌株进行试验袁使
得筛选的引物能够充分反映苹果炭疽病菌的种群多
样性遥
陨杂杂砸 分析已在很多植物咱员缘暂和植物病原菌的
阅晕粤指纹图谱构建尧遗传多样性咱员猿 原 员源暂及与地理来
源关系咱员员 原 员圆暂等研究中广泛应用遥 本试验通过优化
的 陨杂杂砸鄄孕悦砸体系将供试菌株明显区分为胶孢刺盘
孢和尖孢刺盘孢 圆 个种袁并可以区分种下的亚群袁表
明该方法对苹果炭疽病病原菌种及种群水平都具有
很好的区分能力遥
刺盘孢分布广泛尧宿主繁多袁是一类重要的植物
病原真菌袁由于其形态简单尧能够用于形态鉴定的特
征较少袁造成其种间界限不明确尧分类鉴定困难咱员远暂 遥
近年来袁一些研究显示 杂怎贼贼燥灶咱猿暂定义的胶孢刺盘孢尧
尖孢刺盘孢和黑线刺盘孢 悦援 凿藻皂葬贼蚤怎皂 等野种冶都属
于广义种或复合种袁其中可能包含多个不同的种
类咱员远 原 员苑暂 遥 本试验的聚类分析表明袁在遗传相似性系
数 园援 苑源 水平袁胶孢刺盘孢和尖孢刺盘孢 圆 个类群各
分为 圆 个亚群袁这些亚群在菌落特征及形态学上表
现出一些差异袁即存在明显的遗传分化袁这与
郧燥灶扎觃造藻扎等咱圆暂和 蕴藻藻等咱苑暂的聚类分析结果一致遥 在
狭义的胶孢刺盘孢尧尖孢刺盘孢种的定义下袁这些类
群是否是独立的种类袁还需作进一步研究遥
参 考 文 献渊砸藻枣藻则藻灶糟藻泽冤
咱员暂 张荣袁 王素芳袁 崔静秋袁 等援 陕尧豫两省苹果炭疽病病原鉴
定援 中国农业科学袁 圆园园怨袁 源圆渊怨冤院 猿圆圆源 原 猿圆圆怨
缘猿圆猿 期 符丹丹等院苹果炭疽病病原菌 陨杂杂砸鄄孕悦砸反应体系的优化及遗传多样性分析
图 猿 苹果炭疽病菌的聚类分析图
云蚤早援 猿 悦造怎泽贼藻则蚤灶早 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 悦燥造造藻贼燥贼则蚤糟澡怎皂 蚤泽燥造葬贼藻泽 糟葬怎泽蚤灶早 遭蚤贼贼藻则 则燥贼 燥枣 葬责责造藻
咱圆暂 郧燥灶扎觃造藻扎 耘袁 杂怎贼贼燥灶 栽 月袁 悦燥则则藻造造 允 悦援 悦造葬则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 藻贼蚤燥造燥鄄
早赠 燥枣 郧造燥皂藻则藻造造葬 造藻葬枣 泽责燥贼 葬灶凿 遭蚤贼贼藻则 则燥贼 燥枣 葬责责造藻 糟葬怎泽藻凿 遭赠 悦燥造鄄
造藻贼燥贼则蚤糟澡怎皂 泽责责援 遭葬泽藻凿 燥灶 皂燥则责澡燥造燥早赠 葬灶凿 早藻灶藻贼蚤糟袁 皂燥造藻糟怎鄄
造葬则袁 葬灶凿 责葬贼澡燥早藻灶蚤糟蚤贼赠 贼藻泽贼泽援 孕澡赠贼燥责葬贼澡燥造燥早赠袁 圆园园远袁 怨远渊怨冤院
怨愿圆 原 怨怨圆
咱猿暂 杂怎贼贼燥灶 月 悦援 栽澡藻 悦燥藻造燥皂赠糟藻贼藻泽援 悦燥皂皂燥灶憎藻葬造贼澡 酝赠糟燥造燥早蚤糟葬造 陨灶鄄
泽贼蚤贼怎贼藻袁 运藻憎袁 杂怎则则藻赠袁 耘灶早造葬灶凿袁 员怨愿园
咱源暂 郧怎藻则遭藻则 允 悦袁 蕴蚤怎 月袁 悦燥则则藻造造 允 悦袁 藻贼 葬造援 悦澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 凿蚤鄄
增藻则泽蚤贼赠 蚤灶 悦燥造造藻贼燥贼则蚤糟澡怎皂 葬糟怎贼葬贼怎皂 泽藻灶泽怎 造葬贼燥 遭赠 泽藻择怎藻灶糟藻 葬灶葬造赠鄄
泽蚤泽 燥枣 贼憎燥 早藻灶藻 蚤灶贼则燥灶泽袁 皂贼阅晕粤 葬灶凿 蚤灶贼则燥灶 砸云蕴孕泽袁 葬灶凿 皂葬贼蚤灶早
糟燥皂责葬贼蚤遭蚤造蚤贼赠援 酝赠糟燥造燥早蚤葬袁 圆园园猿袁 怨缘渊缘冤院 愿苑圆 原 愿怨缘
咱缘暂 王晓鸣袁李建义援 陕西省炭疽菌的研究援 真菌学报袁 员怨愿苑袁 远
渊源冤院 圆员员 原 圆员愿
咱远暂 在澡葬灶早 砸袁 宰葬灶早 杂 云袁 悦怎蚤 允 匝袁 藻贼 葬造援 云蚤则泽贼 则藻责燥则贼 燥枣 遭蚤贼贼藻则 则燥贼
糟葬怎泽藻凿 遭赠 悦燥造造藻贼燥贼则蚤糟澡怎皂 葬糟怎贼葬贼怎皂 燥灶 葬责责造藻 蚤灶 悦澡蚤灶葬援 孕造葬灶贼
阅蚤泽藻葬泽藻袁 圆园园愿袁 怨圆渊员园冤院 员源苑源
咱苑暂 蕴藻藻 阅 匀袁 运蚤皂 阅 匀袁 允藻燥灶 再 粤袁 藻贼 葬造援 酝燥造藻糟怎造葬则 葬灶凿 糟怎造贼怎则葬造
糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 悦燥造造藻贼燥贼则蚤糟澡怎皂 泽责责援 糟葬怎泽蚤灶早 遭蚤贼贼藻则 则燥贼 燥枣
葬责责造藻泽 蚤灶 运燥则藻葬援 栽澡藻 孕造葬灶贼 孕葬贼澡燥造燥早赠 允燥怎则灶葬造袁 圆园园苑袁 圆猿渊圆冤院
猿苑 原 源源
咱愿暂 在蚤藻贼噪蚤藻憎蚤糟扎 耘袁 砸葬枣葬造泽噪蚤 粤袁 蕴葬遭怎凿葬 阅援 郧藻灶燥皂藻 枣蚤灶早藻则责则蚤灶贼蚤灶早
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早赠袁 圆园园员袁 圆渊远冤院 猿员怨 原 猿圆缘
咱员员暂 贾少峰袁 段霞瑜袁 周益林袁 等援 小麦白粉菌 陨杂杂砸分子标记
体系构建及其分离菌株的多样性分析援 植物保护学报袁
圆园园苑袁 猿源渊缘冤院 源怨猿 原 源怨怨
咱员圆 暂 臧睿袁黄丽丽袁李正力袁等 援 陕西省苹果树腐烂病菌基
因多态性的 陨杂杂砸分析 援 植物保护学报袁圆园员圆 袁猿怨 渊 员 冤 院
缘员 原 缘苑
咱员猿暂 谷守芹袁 范永山袁 李坡袁 等援 玉米大斑病菌 陨杂杂砸反应体系
的优化和遗传多样性分析援 植物保护学报袁 圆园园愿袁 猿缘渊缘冤院
源圆苑 原 源猿圆
咱员源暂 刘燕霞袁 侯丽娟袁 李卫袁 等援 棉花黄萎病菌 陨杂杂砸反应体系
优化及其遗传多样性分析援 植物保护学报袁 圆园员园袁 猿苑渊缘冤院
源圆缘 原 源猿园
咱员缘暂 段丽君袁 曹有龙袁 周军援 枸杞 陨杂杂砸 反应体系的优化与应
用援 西北农林科技大学学报渊自然科学版冤袁圆园园怨袁 猿苑渊员圆冤院
员猿猿 原 员源缘
咱员远暂 悦葬蚤 蕴袁 匀赠凿藻 运 阅袁 栽葬赠造燥则 孕 宰 允袁 藻贼 葬造援 粤 责燥造赠责澡葬泽蚤糟 葬责鄄
责则燥葬糟澡 枣燥则 泽贼怎凿赠蚤灶早 悦燥造造藻贼燥贼则蚤糟澡怎皂援 云怎灶早葬造 阅蚤增藻则泽蚤贼赠袁 圆园园怨袁
猿怨院 员愿猿 原 圆园源
咱员苑暂 匀赠凿藻 运 阅袁 悦葬蚤 蕴袁 悦葬灶灶燥灶 孕 云袁 藻贼 葬造援 悦燥造造藻贼燥贼则蚤糟澡怎皂 鄄 灶葬皂藻泽
蚤灶 糟怎则则藻灶贼 怎泽藻援 云怎灶早葬造 阅蚤增藻则泽蚤贼赠袁 圆园园怨袁 猿怨院 员源苑 原 员愿圆
渊责任编辑院吴竟一冤
远猿圆 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源园 卷