全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 012020205
苹果炭疽菌低毒性菌株的筛选及控病效果
李　娜1 　檀根甲1 　杨维来2 　李增智1 　刘淑芳1 　侯晓丹1
(11 安徽农业大学植保学院 ,安徽省微生物防治重点实验室 ,安徽 合肥　230036 ; 21 安徽科技学院继续教育学院 ,安徽 凤阳　233100)
摘 　要 :苹果炭疽菌 ( Colletotrichum gloeosporioides)感染能对苹果采后造成严重经济损失 ,利用弱致病菌株
先侵入寄主组织后诱发植物产生抗病性 ,可以减轻植物病害的发生和危害。本研究利用离子注入和交
变磁场处理的方法诱导产生苹果炭疽菌的低毒株 ,并进行筛选。通过调查菌株生长情况及在苹果上发
生的病斑的大小 ,获得低毒株 ,对其在苹果上的保护作用进行测定 ,发现离子注入 C1002225 低毒株和磁
场处理 C01252122 低毒株对苹果有较好的保护作用。
关键词 :炭疽菌低毒株 ;离子注入 ;交变磁场处理 ;苹果炭疽病
SCREENING OF HYPO VIRULENCE OF Colletotrichum gloeosporioides
AND ITS CONTROL EFFECT ON APPLE ANTHRACNOSE
LI Na1 　TAN Gen2jia1 　YANG Wei2lai2 　LI Zen2zhi1 　LIU Shu2fang1 　HOU Xiao2dan1
(11Anhui Agricultural University , Hefei ,Anhui 　230036 ; 21Anhui Science and Technology University , Continuing Education College , Fengyang ,Anhui 　233100)
Abstract :The Colletotrichum gloeosporioides is a nosogenesis important fungus that causes the serious economic loss on apple ,
however , inducing resistance of the host may reduce the loss. Colletotrichum gloeosporioides was treated by ion implantation
and by alternating magnetic field to induce aberrance. It was screened through eyeballing first , and then screened through
growth on apple. Two aberrance strains C1002225 and C01252122 were selected. Both the strains have good protective function
and good effect to control the apple disease.
Key words :hypo virulence ; Colletotrichum gloeosporioides ; alternating magnetic field ; ion implantation
收稿日期 :2006204229
基金项目 :安徽省教育厅重点科研项目和安徽省自然科学基金资助 (项目编号 03040141)
作者简介 :李　娜 (19812) ,女 ,河北赵县人 ,硕士 ,从事植物病理生防方面的研究 ,E2mail : lina198134 @1631com
通讯作者 :檀根甲 (19632) ,男 ,安徽望江人 ,教授 ,从事植物病害流行学及病生理研究 ,E2mail : tgj63 @1631com　　苹果炭疽病是由 Colletotrichum gloeosporioides 和 C.acutaccon 引起的。我国引起苹果炭疽病的病原物主要是 Colletotrichum gloesporioides ,它广泛分布于亚热带和温带地区。化学防治是果蔬采后病害防治的主要途径 , 但很多常用的化学杀菌剂或杀虫剂残留有毒副作用。病原真菌低毒菌株在欧美各国已进行了较为深入的研究。研究表明 ,植物 (包括采后果蔬) 经过预先接种低毒性菌株或采用一些物理的、化学的因子处理后 ,可诱导产生抗病性 ,从而减少病害发生[1 ] 。利用栗疫病病菌 ( Endlothia parasitica) 的低毒株已成功地用于欧洲等地栗疫病的防治 ,这预示着在植物病原真菌群体中寻找有利因子控制植物病害具有巨大的应用前景。 我国近年来也开始有关这方面的研究。目前关于传染性低毒株的研究大多集中于对低毒现象的报道以及真菌病毒或 dsRNA 因子的基因组对病原真菌的作用模式[2 ] , 而很少涉及到病原真菌对真菌病毒或dsRNA 因子的抵御作用 ,而这些作用关系到使用低毒株防治植物病害的安全性问题。本研究用等离子和交变磁场处理诱导筛选苹果炭疽菌的低毒性菌株并探索其控病作用 ,以期为生物防治病害提供参考。1 　材料与方法111 　供试材料
02　 核 农 学 报　2007 ,21 (1) :20～24Journal of Nuclear Agricultural Sciences
供试苹果炭疽菌 ( Colletotrichum gloeosporioides) 菌
株由安徽农业大学植物保护学院植物病理教研室提
供。供试苹果为红富士品种 ,由市场购买。
112 　试验方法
11211 　炭疽菌培养 　参照方中达等[3 ] 的方法在含有
PDA 培养基的试管斜面上接种炭疽菌 ,7d 后用 10mL
无菌水冲洗孢子再倒入 250mL 内有玻璃珠、灭菌的三
角烧瓶中 (约 1 ×106 个孢子ΠmL) ,置摇床上 20min ,使
孢子团充分分散 ,涂平板 12 个待用。
11212 　离子注入诱变 　在余增亮[4 ] 方法的基础上 ,选
择 20keV 的能量 ,分别以 20 ×216 ×1013 、40 ×216 ×
1013 、60 ×216 ×1013 、80 ×216 ×1013 、100 ×216 ×1013 N + Π
cm
2 的剂量注入该菌株 ,设两个空白对照。
11213 　磁场处理的诱变 　磁场为交变磁场 ,场强分别
为 0105T(特斯拉) 、0110T、0115T、0120T、0125T 进行照
射诱变 ,另设两个空白对照。
11214 　诱变菌株初筛 　经离子注入和磁场处理诱变
菌株的平板分别放在超净工作台上 ,每个平板注入
1mL 无菌水 ,用三角玻棒刮平板 ,收集孢子 ,然后用移
液枪每次吸取 100μl 移入含有培养基的灭菌培养皿
中 ,再涂于平板 ,每个剂量涂 10 个 (包括对照) ,共涂
120 个培养基平板。放入 25 ℃恒温箱中培养。3d 后目
测挑选。
11215 　扩大培养 　根据目测结果 ,挑选较大菌落的孢
子接种到 PDA 培养基上进行培养并作标记 ,如在 100
×216 ×1013N + Πcm2 剂量下 ,第一次进行诱变第 2 个平
板上第 1 个培养皿挑选出来的菌株 ,标记为“C100222
1”,以此类推。磁场标记方法类同。
11216 　平板测定 　将诱变后的菌株用无菌水洗脱 ,洗
脱的孢子悬浮液稀释后涂在准备好的单层平板上。培
养 24h 选单菌落转接斜面培养 ,培养 5d 后转接在平板
上 ,和未经离子注入的苹果炭疽病菌在相同条件进行
培养 ,每处理重复 4 次 ,观察、比较菌落的生长速率。
11217 　菌株筛选 　将诱变菌株配成浓度为 1 ×106 个Π
ml 孢子悬浮液 ,接种到苹果上 ,同样以未经离子注入
和磁场处理的苹果炭疽病菌 (即强毒菌株) 作为对照 ,
配成相同浓度的孢子悬浮液接种到苹果上 ,另设清水
对照 ,即以无菌水接种到苹果上 ,判别机械伤是否有相
似病斑出现以消除误差 ,每处理 10 个果实。逐日定时
观察其病斑的大小 ,并筛选出低毒性的菌株。
113 　低毒性菌株对苹果炭疽病的控病效果测定
筛选出低毒性菌株活化后在 PDA 平板上 25 ℃培
养 7d ,用灭菌蒸馏水洗下菌落 ,灭菌纱布过滤 ,滤液即
为孢子悬浮液 ,用血球计数板测定并调整其浓度为 1
×106 个Πml ,供接种用。选择外观整齐 ,大小一致 ,无
病虫危害的红富士苹果果实 ,先用自来水洗净晾干 ,然
后经 75 %的酒精表面消毒 ,紫外灯照射 20min 后 ,再用
灭菌的牙签接种于健康的苹果 : (1)用相同浓度低毒性
的不同的菌株先接种苹果 (诱发接种) ,24h 后再接种
同一种病菌的强毒性菌株 C. gloeosporioides (挑战接
种) ,孢子悬浮液浓度均为 1 ×106 个Πml。(2)用相同浓
度的低毒性菌株和强毒性菌株分别以 1∶1 ,1∶2 ,1∶3 ,
2∶1 ,3∶1 的比例混合接种 ; (3) 用强毒性菌株接种 24h
后再用同一浓度的不同低毒性菌株接种 ,分别调查发
病情况。每处理 10 个果实 ,重复 3 次 ,每天观察记录
病斑直径。计算防治效果。
防治效果 ( %) = (对照病斑直径2处理病斑直径)
×100Π对照病斑直径
2 　结果与分析
211 　低毒性菌株的诱变与筛选
21111 　离子注入菌株后 ,在培养基上筛选出诱变菌株
20 株 (表 1) 。
表 1 　离子注入诱变的低毒性菌株
Table 1 　hypo virulence strains induced by ion implantation
低毒性菌株
Hypo virulence
strains
第 10 天的病斑直径
diameter of spot
at the 10th day
(cm)
差异显著性
significant difference
α= 0105 α= 0101
C202121 31258 a A
C802125 31133 a AB
C802228 21992 ab ABC
C1002228 21925 abc ABCD
C1002226 21900 abc ABCDE
C1002223 21900 abc ABCDE
强毒菌株 virulence (CK) 21683 bcd BCDEF
C802122 21633 bcde BCDEF
C1002221 21533 cdef CDEF
C1002125 21450 def CDEF
C802226 21367 def DEF
C802124 21350 def EF
C1002121 21333 def EF
C1002123 21267 def F
C802223 21258 def F
C1002126 21250 ef F
C1002227 21250 ef F
C802229 21225 ef F
C1002122 21208 ef F
C1002127 21125 f F
C1002225 11517 g G
注 :表中数字为 10 次重复的平均数 ;不同的英文字母表示差异显著。
下表同。
Note :The data are mean of 10 observations ; values in the same column with
different letter are significantly different . The same as following tables.
12　1 期 苹果炭疽菌低毒性菌株的筛选及控病效果
21112 　磁场诱变处理后 ,在培养基上筛选出诱变菌株
11 株 (表 2) 。
表 2 　磁场处理诱变的低毒性菌株
Table 2 　hypo virulence strains induced by magnetic field
菌株
strains
第 10 天的病斑直径
diameter of spot
at the 10th day (cm)
差异显著性
significant difference
α= 0105 α= 0101
CK 31875 a A
C01052129 31875 a A
C01052122 31850 a A
C01052121 31217 b B
C01052226 31158 b B
C01052222 31142 bc B
C01152122 31100 bc B
C01052227 21992 bc B
C01152129 21967 bc B
C01052228 21917 bc B
C01152221 21817 c B
C01252122 21325 d C 　　经 DPS 统计分析 ,经离子注入的各诱变菌株接种在苹果上 , 病斑的扩展存在差异 ( F = 71048 >Fα= 0101 (20 ,105) = 2103) ,10d 后 C1002225 菌株的病斑扩展的最慢 ,与其他菌株都达到极显著水平 ,说明该菌株对苹果的致病性弱 ,可能是较理想的低毒性菌株。清水对照没有致病 ,说明各菌株都是由接种发病 ,机械伤不会产生病斑。图 1 显示不同菌株在苹果上的病斑扩展速率 ,结果表明 :接种 C1002225 菌株在苹果上的病斑扩展速度最慢 ,每天增长约 011cm。从表 2 中看出 :经磁场诱变的各个菌株接种在苹果上 , 病斑的扩展速率存在差异 ( F = 161496 , >Fα= 0101 (11 ,60) = 2163) ,10d 后 C01252122 菌株的病斑扩展最慢 ,达到极显著水平。说明该菌株对苹果的致病性较弱。
图 1 　离子注入诱变的低毒性菌株接种在苹果上病斑的扩展速率
Fig. 1 　Extending speed of the lesions on apple of hypo virulence strains induced by ion implantation
图 2 　磁场处理诱变的低毒性菌株接种在苹果上病斑的扩展速率
Fig. 2 　Extending speed of the lesions on apple of hypo virulence strains induced by magnetic field illumination
　　图 2 中经磁场处理低毒性不同的菌株在苹果上的
病斑扩展速率结果表明 :接种 C01252122 菌株在苹果上
的病斑扩展速度最慢 ,每天增长约为 012cm。
212 　低毒性菌株对苹果炭疽病的控制效果 21211 　先接低毒性菌株后接强毒性菌株的控制效果从表 3 中可看出 ,先接低毒性菌株再接强毒性菌株在苹果上的病斑扩展速率比直接接低毒性菌株的扩展速率快 ,但比不经处理的强毒菌株扩展的慢 ,各个菌
22 核　农　学　报 21 卷
株之间达到显著差异 (离子注入的 F = 971351 , >
Fα= 0101 (2 ,15) = 6136 , 磁 场 处 理 的 F = 111563 , >
Fα= 0101 (2 ,15) = 6136) ,可能是由于低毒性菌株对苹果的
致病性弱 ,如果先接低毒性菌株 ,使之先侵占位点 ,产
生抗性 ,强毒菌株的侵占机会相对来说就小 ,所以 ,导
致病斑在苹果上的扩展速率降低 ,有关的机理还有待
进一步研究。离子诱变的低毒性菌株对苹果的控制效
果较好达到 55 %左右。
表 3 　先接苹果炭疽病低毒性菌株后接强毒性菌株在苹果上的抑制效果
Table 3 　Inhibitory effect of inoculating virulence strain (CK) after inoculating the hypo virulence strain on apple
菌株
strains
第 10 天的病斑直径
the 10th day
spot dia. (cm)
抑制率
inhibition
rate ( %)
菌株
strains
第 10 天的病斑直径
the 10th day
spot dia. (cm)
抑制率
inhibition
rate ( %)
强毒菌株 (CK) virulence strain (CK) 41258 B b 2 强毒菌株 (CK) virulence strain (CK) 31842 B b 2
离子注入诱变的弱毒菌株 (C1002225)
hypo virulence strains induced
by ion implantation (C1002225) 11908 C c 2 磁场处理的弱毒菌株 (C01252122)hypo virulence strains induced bymagnetic field illumination (C01252122) 21925 C c 2
先接弱毒菌株 24h 后再接强毒菌株
inoculating CK after 24h inoculating
the hypo virulence strain
21317 C d 551186 先接弱毒菌株 24h 后再接强毒菌株inoculating CK after 24h inoculating
the hypo virulence strain
31042 C c 231861
注 :表中数字为 10 次重复的平均数 ;表中不同的字母英文字母 ,大写表示 1 %显著水平 ,小写表示 5 %显著水平。下表同。
Note :Mean of 10 observations ; values in the same column with different letter are significantly different (level of significance is 5 % for letters in lowercase , and 1 % for
those in uppercase. The same as following tables.
21212 　不同比例混合接种效果
表 4 的结果表明 :低毒性与强毒性菌株按不同比
例混合接种苹果的控制效果之间的差异显著性不明
显 ,但都与单接种的强毒菌株达到显著差异 (离子注入
的 F = 461525 , > Fα= 0101 (6 ,35) = 3147 ,磁场处理的 F =
101086 , > Fα= 0101 (6 ,35) = 3147) 。其中强毒性与低毒性的
菌株以 1∶2 的比例混合时接种效果较好 ,但不及先接
低毒性后接强毒性的效果。
表 4 　苹果炭疽病低毒性菌株与强毒性菌株不同比例混合接种在苹果上的抑制效果
Table 4 　Inhibitory effect of difference proportion mixture of the hypo virulence strain with virulence strain (CK) on apple
强毒菌株∶弱毒菌株
virulence strain∶
hypo virulence strain
第 10 天的病斑直径
the 10th day
spot dia. (cm)
抑制率
inhibition
rate ( %)
强毒菌株∶弱毒菌株
virulence strain∶
hypo virulence strain
第 10 天的病斑直径
the 10th day
spot dia. (cm)
抑制率
inhibition
rate ( %)
离子注入
Ion
implantation
1∶0 41258 A a 2
3∶1 21742 B b 351616
2∶1 21325 BC c 451401
1∶1 21192 C cd 481532
1∶3 2116 7 C cd 491119
1∶2 21075 C cd 511272
0∶1 11908 C d 2 磁场处理Magneticillumination 1∶0 31842 A a 23∶1 31628 A a 515531∶1 31600 A a 016292∶1 3155 0 A a 715921∶3 31108 B b 1910891∶2 31067 B b 2011740∶1 2192 5 B b 2
表 5 　先接苹果炭疽病强毒性菌株后接低毒性菌株在苹果上的抑制效果
Table 5 　Inhibitory effect of inoculating the hypo virulence strain after inoculating CKon apple
菌株
strains
第 10 天的病斑直径
spot at the 10th
day diameter (cm)
抑制率
inhibition
rate ( %)
菌株
strains
第 10 天的病斑直径
the 10th day
spot dia. (cm)
抑制率
inhibition
rate ( %)
强毒菌株 (CK) virulence strain (CK) 41258 B b 2 强毒菌株 (CK) virulence strain (CK) 31842 B b 2
离子注入诱变的弱毒菌株 (C1002225)
hypo virulence strains induced by
ion implantation (C1002225) 11908 C c 2 磁场处理的弱毒菌株 (C01252122)hypo virulence strains induced bymagnetic field illumination (C01252122) 21925 C c 2
先接强毒菌株 24h 后接弱毒菌株
inoculating the hypo virulence strain
after 24h inoculating CK
31375 D d 201744 先接强毒菌株 24h 后接强毒菌株inoculating the hypo virulence strain
after24h inoculating CK
31392 D d 111712
32　1 期 苹果炭疽菌低毒性菌株的筛选及控病效果
21213 　先接强毒性菌株后接低毒性菌株的效果
表 5 的结果表明 :单独接强毒性菌株 ,其病斑直径
要比单独接低毒性的病斑直径大得多 ,同时也比先接
强毒性菌株后接低毒性菌株引起的病斑直径要大 ,其
差异达到极显著差异 (离子注入的 F = 801877 , >
Fα= 0101 (2 ,15) = 6136 , 磁 场 处 理 的 F = 451792 , >
Fα= 0101 (2 ,15) = 6136) 。先接低毒性菌株再接强毒菌株的
第 10d 的病斑直径要比单接强毒菌株的小 ,但比低毒
性菌株的病斑直径大 ,有关机理还需作进一步研究。
3 　讨论
经离子注入和磁场处理诱变 ,在培养基上筛选出
的诱变菌株 ,考察其对苹果炭疽病的防治效果 ,结果表
明 :经离子注入诱变后的 C1002225 菌株和磁场处理诱
变后的 C01252122 菌株接种于苹果 ,苹果炭疽病的病斑
扩展速率最慢 ,且对苹果炭疽病的控制效果较好。菌
株 C1002225 对苹果有保护作用 , 达到 55 % ; 菌株
C01252122 对苹果的保护作用较离子注入的小。先接
种低毒性菌株对苹果的保护作用较好 ,可能是接种低
毒性菌株后 ,诱导苹果产生一定的抗性。研究表明 ,所
筛选出来的低毒性菌株具有一定遗传稳定性 (另文发
表) 。据有关报道 ,利用炭疽菌的低毒株对一些植物上
的炭疽病进行防治 , 可以取得较好结果。张元恩
(1989)用弱致病瓜类炭疽菌 ( C. lagenarium) 预先接种
黄瓜可诱导对瓜类炭疽病菌的系统抗性 ,这种诱导出
的抗病性还可以从砧木传到接穗 ,经两次接种对炭疽
病的抗性就可以持续到收获时[5～12 ] 。小川奎用尖孢镰
刀菌的非致病菌株的 105 个/ ml 孢子悬浮液浸泡带有
伤口的甘薯幼苗根部[13 ] ,其诱导抗性的强弱与诱导接
种的方法、接种后时间和诱导菌种的密切关系[14 ] 有待
进一步研究。
对于低毒株的广泛使用 ,人们主要担心低毒是否
会变为强毒、与其他病毒混合感染是否会引起更大的
危害或成为其他作物的传染源等问题。另外 ,要将低
毒株接种于每株作物 ,在实际操作中有很大的难
度[15 ] 。为了成功的利用低毒性 ,我们不仅要了解低毒
菌株的流行病学和生态学 ,而且随着对植物病毒遗传
基因、结构和功能的分子生物学研究的深入 ,人们可以
通过置换强毒株致病基因的碱基 ,研制出更有效的低
毒株 ,也可将低毒株的干扰基因赋予寄主植物 ,使其成
为抗病性植物 ,这显示了低毒株仍具有广阔的应用前
景。
参考文献 :
[ 1 ] 　黄雪梅 ,张昭其 ,季作梁. 果蔬采后诱导抗病性. 植物学通报 ,
2002 ,19 (4) :412～418
[ 2 ] 　Larson T C , Choi G H D L. Regulatory pathways governing modulation of
fungal gene expression by a virulence2attenuating mycovirus. EMBO ,
1992 ,11 (12) :45～39
[ 3 ] 　方中达. 植病研究方法. 北京 :中国农业出版社 ,1998 ,19～30 ,91
～156 ,355～397
[ 4 ] 　余增亮. 离子与生命科学———一个新的研究领域. 物理 ,1997 ,26
(6) :333～338
[ 5 ] 　吴询耻 ,史维泽. 番茄尖孢镰刀菌诱导棉花抗枯萎病的效果———
诱导棉花抗黄 ,枯萎. 植物病理学报 ,1993 ,23 (3) :225～229
[ 6 ] 　李　冠 ,陈　坚. 诱导免疫哈密瓜的某些生理生化特性研究. 植
物病理学报 ,1992 ,22 (3) :130
[ 7 ] 　李洪连 ,王金生. 黄瓜对炭疽病诱导抗性的初步研究 Ⅱ. 诱导抗
病机制的研究. 植物生理学报 ,1993 ,19 (4) : 327～332
[ 8 ] 　张元恩. 植物诱导抗性研究进展. 生物防治通报 ,1987 ,3 (2) :88～
90
[ 9 ] 　张元恩. 诱导黄瓜系统抗病性研究. 北京农业大学学报 ,1989 ,15
(1) :65～68
[10 ] 　张元恩 ,葛银林. 氟乐灵 (Trifluralin)对棉花枯萎病的诱抗作用. 植
物病理学报 ,1994 ,24 (1) :80～84
[11 ] 　周雪平 ,濮祖芹. 含卫星 RNA 的黄瓜花叶病毒弱株系的分离鉴定
及在病毒病防治上的应用. 中国病毒学 ,1994 ,9 (4) :319～326
[12 ] 　葛银林 ,李德葆. 植物抗病性的诱导、机制、分子生物学研究进
展. 中国生物防治 ,1995 ,11 (3) :134～141
[13 ] 　小川奎. 甘薯蔓割的生物防治. 国外农业科技 ,1986 , (1) :45～47
[14 ] 　吴营昌 ,王守正. 利用弱致病菌株诱导黄瓜抗枯萎病研究. 河南
农业大学学报 ,1991 ,25 (4) :433～43
[15 ] 　邵碧英 ,祖　建 ,林奇英 ,谢联辉. 烟草花叶病毒低毒株的筛选及
其交互保护作用. 福建农业大学学报 ,2001 ,30 (3) :297～303
42 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2007 ,21 (1) :20～24