全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ２０１５， ４２（６）： ９２１ － ９２６ ＤＯＩ： １０􀆰 １３８０２ ／ ｊ． ｃｎｋｉ． ｚｗｂｈｘｂ． ２０１５􀆰 ０６􀆰 ００９
基金项目：国家现代农业（玉米）产业技术体系（ＣＡＲＳ⁃０２）
∗通讯作者（Ａｕｔｈｏｒｓ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）， Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｄｏｎｇｊｉｎｇａｏ＠ １２６． ｃｏｍ， ｃａｏｙａｎ２０８＠ １２６． ｃｏｍ
收稿日期： ２０１５ － ０７ － １５
玉米大斑病菌两性交配型菌株的出现频率
及其育性分析
杨　 阳　 马双新　 贾　 慧　 刘微微　 曹志艳∗　 董金皋∗
（河北农业大学， 河北省植物生理与分子病理学重点实验室， 保定 ０７１００１）
摘要： 玉米大斑病菌属于异宗配合真菌，在自然界中存在 Ａ、ａ 交配型菌株和 Ａａ 两性交配型菌株，
为明确两性菌株的出现频率及其对有性生殖的影响，采用有性态诱导和交配型 ＰＣＲ 鉴定的方法，
对 ２０１１—２０１４ 年采集的野生菌株及室内诱导产生的有性杂交后代 Ｆ１、Ｆ２ 代进行交配型组成鉴定，
通过检测两性菌株子囊壳和子囊孢子的发育情况明确其有性生殖能力，结合 ＲＴ⁃ＰＣＲ 技术对有性
生殖过程中 ＭＡＴ１ 和 ＭＡＴ２ 基因的表达情况进行分析。 结果表明，野生菌株和有性杂交后代中均
存在两性交配型菌株，且出现频率相当，介于 ２􀆰 ０９％和 ６􀆰 ２５％之间；Ａａ 两性菌株的育性与杂交时
对应菌株的交配型组成相关，两性菌株与 Ａ 交配型菌株或 ａ 交配型菌株杂交均可育，能产生成熟
的子囊壳和子囊孢子，但其自交时败育，只产生子囊壳，不产生子囊孢子。 两性菌株 Ａａ 自交和两
性菌株 Ａａ与 Ａ 交配型或与 ａ 交配型菌株杂交时，Ａａ 菌株中 ＭＡＴ１ 和 ＭＡＴ２ 基因表达量无明显差
异，推测 ＭＡＴ基因在有性生殖产生子囊壳的过程中发挥了重要作用。
关键词： 玉米大斑病菌； 两性菌株； 育性分析； 交配型
Ｔｈｅ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｉｓｅｘｕａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｔｕｒｃｉｃａ
Ｙａｎｇ Ｙａｎｇ　 Ｍａ Ｓｈｕａｎｇｘｉｎ　 Ｊｉａ Ｈｕｉ　 Ｌｉｕ Ｗｅｉｗｅｉ　 Ｃａｏ Ｚｈｉｙａｎ∗ 　 Ｄｏｎｇ Ｊｉｎｇａｏ∗
（Ｔｈｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｈｅｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ⁃Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ， Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｂｅｉ，
Ｂａｏｄｉｎｇ ０７１００１， Ｈｅｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｍａｔｉｎｇ ｔｙｐｅ Ａ， ａ ａｎｄ Ａａ ｂｉｓｅｘｕａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃ ｆｕｎｇｕｓ Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ
ｔｕｒｃｉｃａ ｉｎ ｔｈｅ ｎａｔｕｒｅ． Ｂｙ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｓｅｘｕａｌ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， ｍａｔｉｎｇ ｔｙｐｅ ｏｆ ｔｈｅ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ
２０１１ ｔｏ ２０１４ ａｎｄ ｓｅｘｕａｌ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ Ｆ１ ａｎｄ Ｆ２ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ， ａｎｄ ｍａｔｉｎｇ ｔｙｐｅ
ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｔｈｅ ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｓｅｘｕａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｗａｓ
ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ ａｓｃｕｓ ａｎｄ ａｓｃｏｓｐｏｒｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｔｈｅ ＭＡＴ１ ａｎｄ ＭＡＴ２ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｓｅｘｕａｌ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ⁃
ｔｉｍｅ ＰＣＲ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｓｅｘｕａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ
ｏｆ ｂｉｓｅｘｕａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ， ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ ｆｏｒ ２􀆰 ０９％ －６􀆰 ２５％ ． Ｔｈｅ ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｓｅｘｕａｌ ｓｔｒａｉｎ Ａａ
ｗａｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｍａｔｉｎｇ ｔｙｐｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ． Ｂｉｓｅｘｕａｌ ｓｔｒａｉｎ Ａａ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｄｕｃｅ
ａｓｃｕｓ ａｎｄ ａｓｃｏｓｐｏｒｅｓ ｗｈｅｎ ｉｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ａ ｏｒ ａ， ｂｕｔ ｉｔ ｄｉｄ ｎｏｔ ｇｉｖｅ ａｓｃｏｓｐｏｒｅｓ ｗｈｅｎ ｂｉｓｅｘｕａｌ
ｓｔｒａｉｎ ｓｅｌｆｉｎｇ． Ｆｕｒｔｈｅｒ， ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＭＡＴ１ ａｎｄ ＭＡＴ２ ｉｎ Ａａ ｓｈｏｗｅｄ ｎｏ ｏｂｖｉｏｕｓ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ， ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＭＡＴ ｇｅｎｅ ｐｌａｙｅｄ ａ ｐｉｖｏｔａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｃｕｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ
ｓｅｘｕａｌ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓ． ｔｕｒｃｉｃａ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｔｕｒｃｉｃａ； ｂｉｓｅｘｕａｌ ｓｔｒａｉｎ； ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ； ｍａｔｉｎｇ ｔｙｐｅ
　 　 玉米大斑病是由玉米大斑病菌 Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｔｕｒ⁃
ｃｉｃａ引起的一种真菌性病害，主要危害玉米的苞叶、
叶鞘和叶片，其中以叶片危害为主（白金铠，１９９７）。
近年来由于大面积种植感病玉米品种以及该病菌新
小种的不断出现，玉米大斑病的危害范围和程度日
趋严重，已在我国东北、西北等地造成较大危害。 有
性杂交广泛存在于高等真菌中，其后代可发生致病
力变化，产生毒力增强的菌株，或形成新的致病小
种，并扩大病菌的寄主范围（李华等，２００５；Ｍｕｎｉｚ ｅｔ
ａｌ． ，２０１４）。 玉米大斑病菌变异频繁、生理分化
明显。
玉米大斑病菌为异宗配合真菌，自然界中存在
２ 个相反的交配型组成，分别是 Ａ 交配型和 ａ 交配
型。 Ｗａｒａｐｏｎ ｅｔ ａｌ． （２０１４）对泰国玉米大斑病菌交
配型分子检测发现，Ａ与 ａ所占比例接近 １ ∶ １；Ａｂａ⁃
ｄｉ ｅｔ ａｌ． （１９９３）报道，采自以色列和美国的 ５１ 个玉
米大斑病菌菌株中，１６ 个为 ａ 交配型，２９ 个为 Ａ 交
配型，６ 个与 ａ、Ａ均不交配；王利智等（２０１１）发现云
南省 ８１ 株玉米大斑病菌菌株中交配型 Ａ 所占比例
最大，为 ４９􀆰 ４％ ，远高于 ａ交配型所占比例 １２􀆰 ３％ ；
孙淑琴等（２００５）利用菌株对峙杂交法测定并发现
中国玉米大斑病菌存在 ３ 种交配型，包括 Ａ、ａ及 Ａａ
交配型，且 Ａａ两性菌株所占比例最大，ａ 交配型数
量最少。 Ａ、ａ交配型组成的不均衡性以及 Ａａ 两性
菌株出现的频率和育性是否对有性生殖产生影响，
目前尚不明确。
真菌的有性生殖由 ＭＡＴ 基因控制 （ Ｂöｈｍ ｅｔ
ａｌ． ，２０１３）。 Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９８２）从酿酒酵母 Ｓａｃ⁃
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ中得到了第 １ 个 ＭＡＴ基因，交配
型基因 Ａ编码 α转录因子，交配型基因 ａ 编码高迁
移率蛋白家族蛋白。 此外，从玉米小斑病菌 Ｃｏｃｈ⁃
ｌｉｏｂｏｌｕｓ ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ、粗糙脉孢霉 Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、
柄孢壳菌 Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ ａｎｓｅｒｉｎａ等丝状子囊菌中也发现
了交配型基因，并且 ２ 个相反的交配型基因在染色
体上有相同的取向和侧翼序列 （ Ｌｕ ｅｔ ａｌ． ，２０１１；
Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． ，２０１２；Ｇｒｏｇｎｅｔ ｅｔ ａｌ． ，２０１４）。 镰孢菌中，
ＭＡＴ基因敲除突变体在有性态诱导 ７ ｄ后能够形成
黑色的子囊壳，但子囊壳败育，不能形成子囊孢子
（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． ，２０１３）。 Ｂöｈｍ ｅｔ ａｌ． （２０１３）发现青霉
菌的 ＭＡＴ基因不仅参与调控有性生殖及其相关机
制，ＭＡＴ１⁃１⁃１ 基因在青霉素产量、菌丝形态建成和
分生孢子形成过程中也起着重要作用。
本实验室前期对玉米大斑病菌的有性态产生情
况进行了研究，孙淑琴等（２００５）在对交配型的测定
中发现，玉米大斑病菌的交配型趋向于两性化，病菌
之间有性杂交的机会及选择性扩大，使其变异程度
更加复杂；安鑫龙（２００１）详细分析了诱导介质对子
囊孢子产生的影响，并发现子囊壳的产生与菌株的
有性生殖能力密切相关；张泗举等（２００８）通过反复
试验建立了玉米大斑病菌交配型基因 ＭＡＴ１ 和
ＭＡＴ２ 的分子检测方法。 但目前为止尚未有关于玉
米大斑病菌交配型基因功能方面的报道，为进一步
研究其有性生殖过程及其调控机制和影响因素，需
对不同诱导组合下交配型基因的表达规律进行深入
研究。 本研究拟对采自 ２０１１—２０１４ 年的野生菌株
和室内诱导产生的有性杂交后代的交配型组成及分
布频率进行分析，并对有性生殖过程中交配型基因
的表达情况进行检测，以期为进一步明确玉米大斑
病菌有性生殖过程奠定理论基础。 另外，两性菌株
的存在对提高有性生殖能力和病菌的变异是否存在
作用尚不清楚，因此，研究病原菌两性交配型菌株的
交配能力，将有助于了解病原菌的致病变异方向和
制定病害防治策略。
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试菌株：采自 ２０１１—２０１４ 年的野生玉米大斑
病菌菌株和室内有性杂交产生的 Ｆ１ 和 Ｆ２ 代菌株，
由本实验室保存并提供。
培养基：马铃薯葡萄糖琼脂 （ ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ
ａｇａｒ，ＰＤＡ）培养基：马铃薯 ２００ ｇ、琼脂 １３ ｇ、葡萄糖
２０ ｇ、蒸馏水 １ ０００ ｍＬ；马铃薯葡萄糖（ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘ⁃
ｔｒｏｓｅ，ＰＤ）培养基：铃薯 ２００ ｇ、葡萄糖 ２０ ｇ、蒸馏水
１ ０００ ｍＬ；Ｓａｃｈ培养基：马铃薯 ２００ ｇ、ＦｅＣｌ３ ０􀆰 ０２ ｇ、
ＭｇＳＯ４ ０􀆰 ２５ ｇ、ＣａＣＯ３ ４􀆰 ０ ｇ、Ｃａ（ＮＯ３） ２ １􀆰 ０ ｇ、琼脂
１３ ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０􀆰 ２５ ｇ、蒸馏水 １ ０００ ｍＬ。
试剂：ＬＡ⁃Ｔａｑ酶、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓ，宝生
物工程（大连）有限公司；ＴｒａｎｓＺｏＬ Ｕｐ 试剂盒、Ｅａｓｙ⁃
Ｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ⁃Ｓｔａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｓｉｓ Ｓｕｐｅｒ Ｍｉｘ，北京全式
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仪器：Ｃｈａｍｐ Ｇｅｌ５０００ 全自动凝胶成像仪，北京
赛智创业科技有限公司；ＲＳ２３２Ｃ 型蛋白核酸测定
仪，德国 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 公司；Ｇｒａｄｉｅｎｔ ９６ 型 ＥａｓｙＣｙｃｌｅｒ
ＰＣＲ仪，美国赛默飞世尔公司；ＤＹＹ⁃６Ｄ 型电泳仪，
北京市六一仪器厂。
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ 玉米大斑病菌 ＤＮＡ的提取
将试管中保存的 ２０１１—２０１４ 年采集并分离的
２２９ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
野生玉米大斑病菌及有性杂交产生的 Ｆ１ 代和 Ｆ２ 代
菌株接种到 ＰＤＡ平板上，２５℃培养箱中黑暗培养 ７
ｄ，在超净工作台中用打孔器在菌落边缘打孔，然后
用接种针挑取 ３ ～ ５ 个菌盘置于 ＰＤ 培养基中，２５℃
静置黑暗培养 ７ ｄ，用无菌滤纸将菌丝体的水分吸
干，于液氮中速冷，采用 ＣＴＡＢ 法提取菌株基因组
ＤＮＡ（安鑫龙等，２００１）。
１􀆰 ２􀆰 ２ 玉米大斑病菌交配型的分子鉴定
根据张泗举等（２００８）方法合成测定玉米大斑病菌
交 配 型 的 引 物 ＭＡＴ１⁃１： ＡＣＡＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＴＣＡ⁃
ＣＡＡＴＣＣ 和 ＭＡＴ１⁃２：ＡＴＡＧＴＣＧＡＴＣＡＡＴＴＣＡＧＧＣＡＴＧ；
ＭＡＴ２⁃１：ＣＧＴＣＣＧＡＴＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＣ 和 ＭＡＴ２⁃２：
ＡＣＧＣＡＧＧＴＧＴＴＣＴＴＣＴＴＴＣＧＣ，对保存的玉米大斑病
菌的交配型组成进行 ＰＣＲ 鉴定，扩增体系为：模板
２􀆰 ０ μＬ、１０ × ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ２􀆰 ５ μＬ、引物各 １ μＬ、ｄＮＴＰｓ
２􀆰 ０ μＬ、Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶 ０􀆰 ２ μＬ、ｄｄＨ２Ｏ １６􀆰 ３ μＬ。
ＭＡＴ１⁃１ 和 ＭＡＴ１⁃２ 引物组合预期能扩增出 ８００ ｂｐ
左右的目的条带，其交配型为 Ａ，ＭＡＴ２⁃１ 和 ＭＡＴ２⁃２
引物组合预期能扩增出 ２５０ ｂｐ 左右的目的条带，为
ａ交配型，２ 对引物均能扩增出目的条带的菌株为
Ａａ交配型。
１􀆰 ２􀆰 ３ 玉米大斑病菌有性态的诱导
参照安鑫龙（２００１）的方法，以灭菌的大麦秆为
介质，半埋在 Ｓａｃｈ 培养基中，把 ２ 个不同交配型菌
株的菌丝块分别接种在诱导介质两边，离大麦秆
１􀆰 ５ ～ ２􀆰 ０ ｃｍ，置于 ２５℃培养箱中黑暗培养，６ ～ ７ 周
后观察结果，待大麦秆上出现黑色子囊壳后，转移到
光照培养箱中，继续光照培养 １０ ～ １５ ｄ。 诱导成熟
后将饱满的单个子囊壳挑至灭菌的载玻片上，用盖
玻片压碎，置于光学显微镜下观察子囊孢子的有无
及其成熟情况。 诱导组合分别为 Ａ交配型菌株与 ａ
交配型菌株杂交、Ａａ交配型菌株分别与 Ａ交配型或
ａ交配型菌株杂交、Ａａ菌株自交。 每个组合 １２ 次重
复。 通过检测不同组合下子囊壳、子囊和子囊孢子
的产生情况，以确定其育性。
１􀆰 ２􀆰 ４ 不同诱导时期 ＭＡＴ基因的表达
为进一步确定 ＭＡＴ 基因在有性杂交过程中的
作用，于不同诱导时期取样，采用 Ｔｒｉｚａｌ 法提取总
ＲＮＡ，使用 ＥａｓｙＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ⁃Ｓｔａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｓｉｓ Ｓｕ⁃
ｐｅｒ Ｍｉｘ合成第一链 ｃＤＮＡ，通过 ＰＣＲ检测基因的表
达量确定交配型基因的表达规律。 有性态诱导前菌
丝的收集：将不同交配类型的菌株接种在 ＰＤＡ平板
上，２５℃黑暗培养 ７ ｄ，收集菌丝，液氮速冻后提取
ＲＮＡ。 有性态诱导期间菌丝收集：以无菌大麦秆为
介质，半埋在 Ｓａｃｈ 培养基里，把 ２ 个不同交配型的
菌丝块分别接种在诱导介质两边，在诱导 １５ ｄ和 ３０
ｄ时分别收集不同组合中交配型（Ａａ、Ａ、ａ）菌株的
菌丝，液氮速冻后提取 ＲＮＡ。 诱导组合同 １􀆰 ２􀆰 ３。
利用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５􀆰 ０ 软件根据交配型 ＭＡＴ１
和 ＭＡＴ２ 基因序列合成 ＭＡＴ１ 基因上游引物 ＭＡＴ１⁃
Ｆ： ＡＣＡＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＴＣＡＣＡＡＴＣＣ 和 下 游 引 物
ＭＡＴ１⁃Ｒ： ＡＴＡＧＴＣＧＡＴＣＡＡＴＴＣＡＧＧＣＡＴＧ；ＭＡＴ２ 基
因上游引物 ＭＡＴ２⁃Ｆ：ＣＧＴＣＣＧＡＴＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＣ
和下游引物 ＭＡＴ２⁃Ｒ：ＡＣＧＣＡＧＧＴＧＴＴＣＴＴＣＴＴＴＣＧＣ；以
β⁃微管蛋白基因（Ｔｕｂｕｌｉｎ）作为内参基因，其上游引物
Ｔｕｂｕｌｉｎ⁃Ｆ： ＧＧＧＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＧＧＡＴＧＴＴＧ，下游引
物 Ｔｕｂｕｌｉｎ⁃Ｒ： ＴＡＡＣＡＡＣＴＧＧＧＣＡＡＡＧＧＧＴＣＡ。 ２０
μＬ ＲＴ⁃ＰＣＲ 反应体系：ｃＤＮＡ 模板 １􀆰 ０ μＬ、Ｍｉｘ １０
μＬ、引物各 １􀆰 ０ μＬ、双蒸水 ７ μＬ；ＰＣＲ 条件：９４℃ ５
ｍｉｎ；９４℃ ３０ ｍｉｎ；５５℃ ３０ ｓ；７２℃ １ ｍｉｎ 进行 ３２ 个
循环；７２℃ １０ ｍｉｎ。 取 ＰＣＲ产物 １０ μＬ用于电泳检
测和灰度分析。
２ 结果与分析
２􀆰 １ 玉米大斑病菌两性交配型菌株的出现频率
利用有性态诱导和 ＰＣＲ 鉴定的方法对 ２０１１—
２０１４ 年分离获得的野生玉米大斑病菌菌株进行交
配型鉴定，结果表明，采集的菌株中存在 Ａａ 两性交
配型菌株，年度间出现频率相近，最高的年份为
２０１２ 年，达到 ４􀆰 ７１％ ，最低的年份为 ２０１４ 年，为
２􀆰 ０９％ （表 １）。 另外，本研究对前期实验室内诱导
获得的 ９４ 个有性杂交后代进行交配型组成分析，６２
个 Ｆ１ 代菌株和 ３２ 个 Ｆ２ 代菌株中均出现了 Ａａ两性
菌株，出现频率分别为 ４􀆰 ８３％和 ６􀆰 ２５％ （表 １），与
自然条件下 Ａａ 菌株出现的频率相当。 表明 Ａａ 交
配型菌株的出现频率相对较低，介于 ２􀆰 ０９％ 和
６􀆰 ２５％之间，年度间和后代间差异不大。
２􀆰 ２ 玉米大斑病菌两性菌株的育性
将交配型为 Ａａ的菌株 １１⁃０８Ａ接种于大麦秆两
侧进行对峙培养（图 １⁃Ａ），发现菌株 １１⁃０８Ａ自交后
能在大麦杆上产生黑色的子囊壳（图 １⁃Ｂ），但是镜
检看不到成熟的子囊和子囊孢子（图 １⁃Ｃ ～ Ｄ）。 同
样，交配型为 Ａａ的菌株 １１⁃５０Ｄ和 １２⁃１０Ｃ各自自交
也可产生子囊壳，但不能形成子囊和子囊孢子（表
２）；将 Ａａ 交配型菌株 １１⁃０８Ａ 和 Ａ 交配型菌株
１３⁃１０Ｆ进行对峙培养（图 １⁃Ｅ），可在大麦杆上产生
子囊壳（图 １⁃Ｆ），镜检发现子囊壳中着生大量子囊
（图 １⁃Ｇ），子囊中有 ８ 个子囊孢子，子囊孢子多以 ４
３２９６ 期 杨　 阳等： 玉米大斑病菌两性交配型菌株的出现频率及其育性分析
　 　 　表 １ ２０１１—２０１４ 年玉米大斑病菌两性菌株的出现频率
Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｂｉｓｅｘｕａｌ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｔｕｒｃｉｃａ
来源
Ｓｏｕｒｃｅ
菌株总数
Ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒ
ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ
两性菌株数
Ｎｏ． ｏｆ
ｂｉｓｅｘｕａｌ ｓｔｒａｉｎ
出现频率 （％）
Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ
ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ
野生 ２０１１ １０５ ４ ３􀆰 ８０
Ｗｉｌｄ ２０１２ １０６ ５ ４􀆰 ７１
２０１３ １６８ ５ ２􀆰 ９７
２０１４ １４３ ３ ２􀆰 ０９
杂交 Ｆ１ ６２ ３ ４􀆰 ８３
Ｈｙｂｒｉｄ Ｆ２ ３２ ２ ６􀆰 ２５
图 １ 玉米大斑病菌有性态诱导结果
Ｆｉｇ． １ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｓｅｘｕａｌ ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｔｕｒｃｉｃａ
Ａ： 两性菌株自交的有性态诱导； Ｂ： 两性菌株自交产生的子囊壳； Ｃ ～ Ｄ： 两性菌株自交不产生子囊和子囊孢子； Ｅ：
两性菌株与 Ａ交配型杂交的有性态诱导； Ｆ： 两性菌株与 Ａ交配型杂交产生的子囊壳； Ｇ ～ Ｈ： 两性菌株与 Ａ 交配型杂交
产生子囊和子囊孢子； Ｐ： 子囊壳； Ｓ： 子囊孢子。 Ａ： Ｔｈｅ ｓｅｘｕａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｓｅｘｕａｌ ｓｔｒａｉｎ； Ｂ： ｔｈｅ ｐｅｒｉｔｈｅｃｉａ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ
ｓｅｌｆｉｎｇ ｏｆ ｂｉｓｅｘｕａｌ ｓｔｒａｉｎ； Ｃ － Ｄ： ｎｏ ａｓｃｏｓｐｏｒｅ ａｎｄ ａｓｃｕｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｌｆｉｎｇ ｏｆ ｂｉｓｅｘｕａｌ ｓｔｒａｉｎ； Ｅ： ｔｈｅ ｓｅｘｕａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｅ⁃
ｔｗｅｅｎ ｂｉｓｅｘｕａｌ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ Ａ ｓｔｒａｉｎ； Ｆ： ｔｈｅ ｐｅｒｉｔｈｅｃｉａ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｂｉｓｅｘｕａｌ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ Ａ ｓｔｒａｉｎ； Ｇ － Ｈ： ｔｈｅ ａｓｃｏｓｐｏｒｅ ａｎｄ ａｓｃｕｓ ｐｒｏ⁃
ｄｕｃｅｄ ｂｙ ｂｉｓｅｘｕａｌ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ Ａ ｓｔｒａｉｎ； Ｐ： ｐｅｒｉｔｈｅｃｉａ； Ｓ： ａｓｃｏｓｐｏｒｅ．
　
细胞形式存在（图 １⁃Ｈ）；同时 ａ 交配型菌株 １３⁃１０Ｃ
和 Ａａ交配型菌株 １１⁃０８Ａ 或 Ａ 交配型菌株 １３⁃１０Ｆ
交配也能产生子囊壳、子囊和子囊孢子（表 ２）。
２􀆰 ３ 有性态诱导不同时期 ＭＡＴ基因的表达规律
有性态诱导前，玉米大斑病菌 ＭＡＴ１ 和 ＭＡＴ２
两个基因在不同交配型的菌株中表达量存在差异，
如在 Ａａ交配型菌株 １１⁃０８Ａ、Ａ 交配型菌株 １３⁃１０Ｆ
和 ａ交配型菌株 １３⁃１０Ｃ 中，只有 Ａ 交配型菌株有
ＭＡＴ１ 基因表达，ａ 交配型菌株中只有 ＭＡＴ２ 基因表
达；Ａａ菌株中既有 ＭＡＴ１ 基因表达，也有 ＭＡＴ２ 基因
表 ２ 玉米大斑病菌有性态诱导结果
Ｔａｂｌｅ ２ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｓｅｘｕａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｔｕｒｃｉｃａ
诱导组合
Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
ｔｙｐｅ
菌株
Ｓｔｒａｉｎ
子囊壳
Ｐｅｒｉｔｈｅｃｉａ
子囊和子囊孢子
Ａｓｃｕｓ ａｎｄ
ａｓｃｏｓｐｏｒｅ
Ａａ × Ａａ １１⁃０８Ａ × １１⁃０８Ａ ＋ －
１１⁃５０Ｄ × １１⁃５０Ｄ ＋ －
１２⁃０１Ｃ × １２⁃０１Ｃ ＋ －
Ａａ × Ａ １１⁃０８Ａ × １３⁃１０Ｆ ＋ ＋
Ａａ × ａ １１⁃０８Ａ × １３⁃１０Ｃ ＋ ＋
Ａ × ａ １３⁃１０Ｆ × １３⁃１０Ｃ ＋ ＋
　 　 ＋ ： 有子囊壳或子囊孢子产生； － ： 无子囊壳或子囊孢
子产生。 ＋ ： Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ａｓｃｕｓ ａｎｄ ａｓｃｏｓｐｏｒｅ； － ： ｎｏ ａｓｃｕｓ ａｎｄ
ａｓｃｏｓｐｏｒｅ．
表达（图 ２）。 有性态诱导 １５ ｄ时，ＭＡＴ１ 和ＭＡＴ２ 基
因在 Ａａ交配型菌株 １１⁃０８Ａ 中都有表达，且表达量
无明显差异；Ａ交配型菌株 １３⁃１０Ｆ 中只有 ＭＡＴ１ 基
因表达；ａ交配型菌株 １３⁃１０Ｃ 中只有 ＭＡＴ２ 基因表
达。 有性态诱导 ３０ ｄ时，ＭＡＴ１ 和 ＭＡＴ２ 基因在 Ａａ、
Ａ和 ａ 交配型菌株中的表达与诱导 １５ ｄ 时一
致（图 ３）。
４２９ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
图 ２ 玉米大斑病菌有性态诱导前 ＭＡＴ１
和 ＭＡＴ２ 基因的表达分析
Ｆｉｇ． ２ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＭＡＴ１ ａｎｄ ＭＡＴ２ ｇｅｎｅｓ
ｂｅｆｏｒｅ ｔｈｅ ｓｅｘｕａｌ ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｔｕｒｃｉｃａ
　
　 图 ３ 玉米大斑病菌进行有性态诱导 １５ ｄ和 ３０ ｄ时
ＭＡＴ基因的表达分析
　 　 Ｆｉｇ． ３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＭＡＴ ｇｅｎｅｓ １５ ｄ ａｎｄ ３０ ｄ
ａｆｔｅｒ ｓｅｘｕａｌ ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｔｕｒｃｉｃａ
　
３ 讨论
有性生殖是一些植物病原真菌发生变异的一种
重要机制，可将不同致病能力的菌株通过减数分裂
和遗传物质重组拓宽子代菌株的致病范围，形成新
的致病小种（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ＆ Ｕｌｌｓｔｒｕｐ，１９６２；Ｍｉｌｇｒｏｏｍ，
１９９６；Ｈｅｉｔｍａｎ，２０１０）。 玉米大斑病菌生理小种组成
复杂，遗传分化差异显著，并且存在 Ａ、ａ 和 Ａａ 等交
配型组成形式。 本研究发现，不论在玉米大斑病菌
野生菌株还是有性杂交后代中均存在 Ａａ 两性交配
型菌株，但其所占比例相对较低，仅在 ２􀆰 ０９％ ～
６􀆰 ２５％之间。 王克荣等（１９９７）在栗疫病菌中也发
现了少量与 Ａ、ａ杂交均能形成子囊壳的两性菌株，
并认为两性菌株的出现说明栗疫病菌中可能存在其
它有性生殖遗传机制；Ｓｈａｔｔｏｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９９６）报道，
异宗配合疫霉菌体内可能同时携带控制 Ａ１、Ａ２ 交
配型的遗传因子，当某种交配型因子被诱变时就会
产生不同的交配型，这种变异可能有助于疫霉菌通
过有性杂交过程中的基因重组增加其遗传多样性，
产生活力旺盛、适应性强的个体。 本研究中，两性菌
株均可与 Ａ或 ａ交配型菌株杂交产生有性后代，增
加了有性生殖的几率，但其自交败育，Ａａ 交配型菌
株的有性生殖是受交配型基因控制还是遗传物质重
组影响尚不清楚，有待进一步深入研究。
玉米大斑病菌有性态的诱导及子囊孢子的稳定
产生是分析其遗传特性的前提，不同交配型的菌株
在人工诱导的条件下能够产生有性生殖后代。 安鑫
龙（２００１）对玉米大斑病菌的有性态进行了深入研
究，证明子囊壳的产生非常不规律，相同条件下，同
样的菌株杂交，有可能影响子囊壳形成，表明环境条
件也会对有性态产生影响，可能是自然界到现在很
少发现玉米大斑病菌有性态的一个重要原因。 本研
究采用 ３ 个两性菌株 １１⁃０８Ａ、１１⁃５０Ｄ 和 １２⁃０１Ｃ 自
交并分别与 Ａ或 ａ 交配型菌株杂交，发现杂交时能
够产生成熟的子囊和子囊孢子，而自交仅能够产生
子囊壳，不产生子囊和子囊孢子，说明玉米大斑病菌
的有性生殖除了受环境影响之外还可能受到一些基
因的调控。 在酿酒酵母中发现了参与酵母有性生殖
过程的基因，这些基因受 ＭＡＰＫ 信号途径控制
（Ｙａｍａｄａ⁃Ｉｎａｇａｗａ ｅｔ ａｌ． ，２００７）。 在小麦赤霉病菌
中，通过基因敲除之后对敲除突变体进行有性态诱
导发现，小麦赤霉病中还存在参与有性生殖的 ８ 个
基因，这些基因缺失后，菌丝生长缓慢，子囊壳、子囊
和子囊孢子的产生受到抑制，有性生殖过程明显延
迟，说明上述基因对小麦赤霉病的有性生殖过程有
一定的影响（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． ，２０１２；２０１５）。 本研究有性
交配组合中两性菌株 Ａａ 的 ＭＡＴ１ 和 ＭＡＴ２ 基因表
达无差异，说明 ＭＡＴ 基因在菌株交配识别、子囊壳
产生过程中发挥了重要作用，但是两性菌株自交败
育的原因还有待进一步研究分析，推测在两性菌株
中其它有性生殖相关基因的表达可能受到了影响，
今后还需创制不同交配型基因的缺失突变体并对两
性菌株有性态诱导不同时期其它有性生殖基因的表
达情况进行深入分析。
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（责任编辑：李美娟）
６２９ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷