全 文 ：B U L L ET IN OF B O T AN IC人 L R E S E AR CH
第 8卷 , 第 4 期
V o l 8
.
N o
.
4
一。s 日年一。月
0 fC 1 . 8 .
羊角月芽藻对福毒作用的反应和积累的研究
1
. 镐对羊角月芽藻的毒性作用
林碧琴 张晓波
S T UD IE S O N T HE T OX IC O L O G !C A L RE SP ON SE AND
B !OA C C UMU LA T ION O F SE L E NAS T RUM
C AP R! C OR N UT UM T O C ADM !UM
I
:
T HE T O X IC AC T ION O F C ADM IUM T O
S E L ENAS T RUM C A P R !C ON U T UM
L i n B e
一 e h i n Z h a n g X i a
o · b o
〔提要 〕 本文研究 T 一种淡水绿藻— 羊角月芽藻 ( S e l e n a s * , u m e 口 p r i e o r 。 ; t u 。 ) 对福的毒性作用 。 结果表明它对铜的毒性作用反应敏感 , 适于用来进行铜的毒性检验 。
锡对 5 . c o P r宕c o r , : `* u , 毒作用的半数有效浓度 96 E C。 。 为 o . s 3 m g八 e d e l: ) , Zp p m
cd cl
: 作用96 小时细胞出现死亡 , 在非致死浓度范围内 (0 . 25 一 1 . SP p m ) , 随铜浓度增加其
D N A 和叶绿素 a 含量明显减少 , D N A 酶 、 脱氢酶 、 过氧化物酶活性受到强烈影响 , 细胞
分裂、 光合放氧和细胞膜透性也受到强烈的抑制和破坏 。
一 、 引 官
锡是一种在自然界含量较少的元素 , 它在地壳中的含量约为 1 . 5 x l 。“ 了 (三根靖弘
等 , 19 9 1 ) 。 但随着工业的发展 , 镐 的用途愈来愈广泛 。 自锡污染公害病— 骨痛 病 的病因阐明以来 , 锦污染已 日益引起人们的关注 。
迄今为止 , 在锡对各种生物的危害方面已做了大量的研究 ( B gr an , 19 7 1 , 孙赛初
等 , 1 9 8 5 , 王焕校等 , 1 9 8 4 ; S i o a 尸t a l , 1 9 7 9 ; 5 1。 ` h a l e t a l , 1 0 7 6 ) , 但 在 藻 类
本文作者工作单位 : 辽 宁 , 沈阳 , 辽宁大学生物系 ( B io lo g y D叩 a r 口 e . t o f L i o o n i . g U n i , e r s i t了 , S h , n y a 。。 ,
主加。 . 抽价 。
一 19 5 一
方面的研究仍处于薄弱环节 , 尤其在锡对藻类生理生化功能的影响和作用机理探讨等方 `
面 , 报导甚少 。
藻类是水生态系统的原初生产者 , 是水生食物链的基础 。 它具有生命 力强 、 繁 殖 .
快 、 对环境条件变化反应敏感等特点 。 利用藻类检验污染物的毒性并研究具体的防治措
施已日益受到重视。 已有报导表明 ( L ve 一 K i m et al , 1 98 0 ) : 锡污染不仅 对藻类能产 -
生直接的影响 , 而且锡能被转移到更高的营养水平 。 因此 , 利用藻类进行锡毒性检验和 `
生物极累的研究具有重要愈义 。
首先研究铜对羊角月芽藻的毒性作用 , 重点探讨铜对其生理生化功能的影响 。
二 、 材料和方法
(一 ) 实脸材材
羊角月芽藻 ( S时翻盯 tr 峨 ` oP ir co 饰州姗 ) 取自中科院水生生物研究所藻种保截室。
重金属 : 锡采用分析纯 c dc l: 。
(二 ) 实脸方法 :
1
。 培养方法 :
( 1) 培养荃 : 基础培养墓 B BM 。
(2 ) 接种 t : 光密度侧定值 ( 6 6 5 n m ) 为 0 . 05 , 细胞数约为 7 x 10 5个 / m l。
( 3) 培养条件 : 培养器为 2 50 x 40 , 二大试管 ,温度控制在 25 ℃ 士幻 光照强度 3 0。介
L 。幻 光暗周期 14 : 10 场 通气搅拌并充以足 t 二氧化碳 。 每一镐浓度设二个重复 。
2
。 锡浓度剂址选择 :
按对数浓度设组 , 以生长的光密度侧定为指标 , 侧定锡抑制藻类生长的半数有教浓度
。 s E C o o (实验测得 9 6 E C。。为 o . s 3m g / L e d e l: ) 。 在 9 6E C s。的士 T 各取三个浓度为正式
实脸的染毒剂 t ( o , 0 . 2 5 ; 0 . 5 0 ; 0 . 7 5 , 1 . 0 , 1 . 2 5 ; 1 . s o m g / L C d e l, ) 。
3
. 侧定方法 :
( 1 ) 生长最 : 按藻类学方法手册 ( H e l l e b u s t e t a l ) 介绍 的方法 , 以细 胞 计 数 ,
光密度 、 干重为指标 , 测定不同锡浓度下羊角月芽藻的生长量。
( 2 ) 叶绿素 a : 采用 ( W i t h a m e t a l , 1 9 7 1 ) 法提取 、 测定 , 计算 。
( s ) 光合放氧量 : 采用 (W a r b u r g , 19 6 0 ) 改良法测定。
( 4 ) D N A 含量 : 按 ( S c h n e s d e r , 1 9 6 4 ) 法提取 D N A ,用 B u r t o n的二苯胺法测定 。
( 5 ) 可溶性碳水化合物 : 用 ( D u b o u s e t a l , 19 5 6 ) 的苯酚硫酸法提取测定 。
(6 ) 蛋白质含量 : 用 ( L a y n e , 1 9 5 7 ) 法提取 , 紫外法测定 。
( ” 细胞膜透性— 细胞外渗液电导率的测定 : 样品处理按 (卞 泳 梅 , 1 9 8幻 法 ,侧定用 D D S一 1 1A 型电导仪 。
( 8) 几种酶活性的测定 :
酶液提取 : 收集水样 , 液氮冻融 , J C一 3 型超声处理仪 80 %强度冰浴破碎 20 分钟 , .
1。。。。rP 。 下离心 30 分钟 , 取上清液保存待测定用。
A
。 蛋白酶 (蛋白水解酶 ) ` 采用 F ol in p h en d 试剂法 。
B
.
A T P一磷酸酶 : 样品处理按 (蔡剑萍 , 19 8 0) 法 ,按 (张龙翔等 , 1 9 8 1) 定磷法测定 ,
19 6
c
. 过粼化物酶 : 按华东师大编 《植物生理学实脸指导系介绍的方法测定 。
D
。
D N人酶 ( D双 A 水解酶 ) , 采用 ( K 妞 n i t z , z , “ ) 、法测定 .
E
。 脱离酶 : 采用刃天青法 。
三 、 实 挂 结 果
1
。 福对羊兔月芽藻毒作用的半数有效浓度 96 E C: 。 的测定 。 表 i 、 图 1 示 96 E C ,
钓测定情况 , 数据处理及结果 。 韶作用羊角月芽藻的 96 E C 。。 值为 。 . 83 m ` / L 。 d。 I.t
2
。 锦对羊角月芽藻生长的影响 :
表 2示不同浓度 c d o l : (0 一 1 。 s p p m ) 作用 9 6小时后对其生物皿的影响 (光 密 度 、
细胞数 、 千重 ) 。
表 1 9 6 E C 。 . 测定 . 羊角月穿藻 ( S e l e ” a s* r o fn e a P r c` o r . 创 t “价 ) 对
锅毒作用反应的百分数和机率单位对应表
盅…墨…墨一二一一 }一— {一些i竺 ~0 。 5 } 一 0 。 3 J 0 0 5 6 }哭梦副
光密度之 , …
}二竺竺兰 }— {阵翌竺 .卜二兰竺一 }, 一生燮 …一二 2竺一 {反应百分数
机 率 单 位
( M )
1 00%
6 0
.
3 4%
一 .一一 ~~ ~ ~ ~~ 曰`~ ~ 一 护
n0
、
O甘门lù吕O口.4 .3一2
0 5 5
0 5 5
0
.
1 4 9
0
.
1 1 9
2 6
.
6 3%
5
,
3 4
4
.
3 8
1 8
.
7 0乡石
q`孟任,`Q盯ǎb马月n曰nùl八jI…八曰n户0 。 0 5 3 1 3 . 3 1 ;
2 0
。
O
0
。
9
1
.
3 0
.
0 5 4
0
.
1 0 0
0
。
0 6 4 、
.
0 1 2
.
6 9夕石
. 光 密度值各数据均为二个平行实验 的平均值
结果表明 : 当铜浓度超过 o . 75 p p m , 生长明显受到抑制
图 1 9 6 E C二 侧定 : 福作用于羊角月芽燕的荆皿反应曲线
△ : l o 0 EC一 。 一 。 , 0 5 o 6 E C一 = 0 . 5 3口g / L c d e l :
直峨方祝 Y = 一 x . 3 x + ` 二 2 . , r . 一 o . a 3 , t二 5 . 0 0 -
因为 t > t ( 0 . 0 1 , 3 ) 即 5 . 0 0 4 > 5 . 8 4 1 所 以 L 与 M 呈明显负相关
( 以细胞数指标表 现 更明
显 ) 。 另外 , l p p 。
c d cl
: 使其生长的
滞 缓 期 延 长 , 2
p p m e d e l : 使 细
胞停止生长 , 96 小
时 出 现 死 亡 , 8
p p m e d e l , 作用 2 4
小时内细胞 出现死
亡 。
3
. 铜对 羊 角
月芽藻生理生化功
能的影响 :
( 1 ) 对 叶 绿
素 、 D N A 、 蛋 白
一 1 9 7 一
c
.过粼化物酶 :按华东师大编 《植物生理学实脸指导系介绍的方法测定 。
D
。
D N人酶 D (双A 水解酶 ) , 采用 ( K 妞 n i t z , z , “ ) 、法测定 .
E
。 脱离酶 : 采用刃天青法 。
三 、 实 挂 结 果
1
。 福对羊兔月芽藻毒作用的半数有效浓度 96 E C: 。 的测定 。 表 i 、 图 1 示 96 E C ,
钓测定情况 , 数据处理及结果 。 韶作用羊角月芽藻的 96 E C 。。 值为 。 . 83 m ` / L 。 d。 I.t
2
。 锦对羊角月芽藻生长的影响 :
表 2示不同浓度 c d o l : (0 一 1 。 s p p m ) 作用 9 6小时后对其生物皿的影响 (光 密 度 、
细胞数 、 千重 ) 。
表 1 9 6 E C 。 . 测定 . 羊角月穿藻 ( S e l e ” a s* r o fn e a P r c` o r . 创 t “价 ) 对
锅毒作用反应的百分数和机率单位对应表
盅…墨…墨一二一一 }一— {一些i竺 ~0 。 5 } 一 0 。 3 J 0 0 5 6 }哭梦副
光密度之 , …
}二竺竺兰 }— {阵翌竺 .卜二兰竺一 }, 一生燮 …一二 2竺一 {反应百分数
机 率 单 位
( M )
1 00%
6 0
.
3 4%
一 .一一 ~~ ~ ~ ~~ 曰`~ ~ 一 护
n0
、
O甘门lù吕O口.4 .3一2
0 5 5
0 5 5
0
.
1 4 9
0
.
1 1 9
2 6
.
6 3%
5
,
3 4
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.
3 8
1 8
.
7 0乡石
q`孟任,`Q盯ǎb马月n曰nùl八jI…八曰n户0 。 0 5 3 1 3 . 3 1 ;
2 0
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O
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。
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0 5 4
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1 0 0
0
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0 6 4 、
.
0 1 2
.
6 9夕石
. 光 密度值各数据均为二个平行实验 的平均值
结果表明 : 当铜浓度超过 o . 75 p p m , 生长明显受到抑制
图 1 9 6 E C二 侧定 : 福作用于羊角月芽燕的荆皿反应曲线
△ : l o 0 EC一 。 一 。 , 0 5 o 6 E C一 = 0 . 5 3口g / L c d e l :
直峨方祝 Y = 一 x . 3 x + ` 二 2 . , r . 一 o . a 3 , t二 5 . 0 0 -
因为 t > t ( 0 . 0 1 , 3 ) 即 5 . 0 0 4 > 5 . 8 4 1 所 以 L 与 M 呈明显负相关
( 以细胞数指标表 现 更明
显 ) 。 另外 , l p p 。
c d cl
: 使其生长的
滞 缓 期 延 长 , 2
p p m e d e l : 使 细
胞停止生长 , 96 小
时 出 现 死 亡 , 8
p p m e d e l , 作用 2 4
小时内细胞 出现死
亡 。
3
. 铜对 羊 角
月芽藻生理生化功
能的影响 :
( 1 ) 对 叶 绿
素 、 D N A 、 蛋 白
一 1 9 7 一
( 3) 铜对羊角月芽藻光合放氧 t的影响. ; . “ , 二 ; 、 一结果表明 (表 8 ) : 锡对其光合放氧有强烈的抑制作 用 , 在。一 .0 7印 p , 一比。卜滚度间抑制作用不明显 , 当 cd 0 1: 浓度大乎 0 . 75 , p二 时 , 其光合放氧明显受到抑制 。(4 j 铜对羊角月芽藻五种酶活性的影响 : ` ’
从表 4 可以看出锡对其五种酶的活性均有一定程度的影响 , 其中 D N A 酶 、 过 ’ 权化
物酶 、 脱氢酶受影响程度较大 , 而蛋 白酶和 A T P一磷酸酶受影响较小 。 D N A 酶 . 蛋 白
酶和过氧化物酶活性随锡浓度增加 而 增 加 , D N 酶 A 和 蛋 白酶 活 性 在 。一 o . 7 5 p p位
cd cl
, 间受影响较小 , 而锡浓度大于 。 . 7 5 p pm 时受影响较大 , 过氧化物酶结果相反 。 脱
氢酶和 A T P一磷酸酶活性随锡浓度增加而降低 。
表 4 不同浓度 。 d e l : 对羊角月芽燕 5 . e a p r i e o r n u * u o X 种酶活性的影响 .
镜 浓 度
m g /L
D N A 酶酶单位 /
m g蛋白 . 分
过氧化物酶 { 蛋 白 酶 } A T P 酶 脱 遥
镣 浓 度
母一一 (一0 . 25
0
.
50
1 7
.
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一抑制百分数
( I )
4
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1 7
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.
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.
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.
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.
11 … 3 7 · 。7 { 3。 · 。。 }二三
2 9
。
6 2
1
。
2 5 2 7
。
2 7
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.
5 7
2 7
.
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。
0S 3 1
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5 8
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.
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2 6
.
6 7
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.
36 %
… 4 3 . 6 9%
一 — { — — -一一 一 . -
} 52
.
4 3%
66
.
9 9 %
{
{ 75
.
7 3 %
I C 。 。 二 3 . 7 口 g / L
. 醉单位定义 : 以每分钟消光系数变化 。 . 01 的醉盆为一个醉活性单位 .
二 各数据均为三个平行样 的平均 值 。
四 、 讨 论
1
。 从镐对羊角月芽藻生长影响的几个测定指标来看 : 随铜浓度增加 , 细胞数 减 少
的程度比光密度和干重大 , 看来锡对其繁殖的抑制大于对其生长的抑制 。 其原因可能有
四点 : ①羊角月芽藻受锡毒害后 , 与其细胞分裂有直接密切关系的 D N A 含量大大减少 ,
使细胞分裂受到抑制 , 而 D N A 酶活性随铜浓度增加而增加 、 促进 D N A 分解则与 D N A
含 t 减少有关 。 ② D N A 酶 、 蛋 白酶活性随铜浓度增加而增加 , 促 进了 D N A 、 蛋 白质
的分解 , 使二者含量减少 , 而碳水化合物含量却随铜浓度增加而增加 , 这种细胞内生命
物质的不均衡 、 不协调将导致细胞只增大不分裂 。 ③细胞分裂受抑制还与其细胞表面结
构受破坏有关 ( G IP p s et al , 1 9 8 2) 。 ④锡与核酸 、 蛋白质等形成大分子复合物 ( F r
Ic h o k
e t a t , 1 9 7 5 a )
, 阻止了细胞分裂所需要的硫氢基 ( I k 扭 a d a e t a l , 1 96 5 ) , 而
其细胞分裂受到抑制 。 `
2
. 铜对羊角月芽藻光合作用能力的影响主要表现在其叶绿素含最减少和光合 放 玩
受到渊 . -叶绿素含量减少一方面与载色体结构受破坏 、 、 类囊体表面积减少有关 , 二另一方面是
一 19 9 一
翎偏铁和镁竞争`抑封了月芽藻对铁和镁的吸咚和利用 , 使叶绿合成舜班 , 铁和镁都是
葬类细抱色. 系烧和叶姆素合成的必须元素 ( B众 .r 吐 。 1, 19 ” 》。 -
锡抑翻单角月护蕊的光合放氧其主要原因是铭与钙 、 锰竞争 、 抑制其对钙 、 锰的吸
收和利用 。 锰是 P S l 中放氧的必须元素 , 目前也有人认为钙在蓝藻的光合放权 上起重
要作用 ( B r a . d . t a l , 19 5一)。
3 。 虽然拓强烈地抑制单角月芽藻的光合作用 , 但从本实脸的结果来看 : 做为 光 合
作用产物的碳水化合物 (可溶性碳水化合物 ) 的含 t 却随锡浓度的升高而增加 , 这可能
是由于光合产物运输受阻以及蛋白质和不溶性糖分解的结果 (孙赛初等 , 19 8 5 ) 。
4
。 生物体的新陈代谢和生命活动是各种生理生化反应的结果 , 而酶在其中有 举 足
轻重的作用和位置 。 实验结果表明锡对脱氢酶 、 过氧化物酶 、 脱权核糖核酸酶有强烈的
影响 。 脱氢酶是藻类非常重要的一类酶 , 许多关键的合成分解代谢 , 氧化还原反应都有
脱氮酶参与 , 这类酶受抑制必然会使藻类细胞的生长发育受到影响 。 过氧化物酶是一种
解毒酶 , 锡作用后羊角月芽藻的过氧化物酶的活性增加是它对锡毒害的一种解毒机 制 ,
而这种解毒作用在低福浓度 ( < 。 。 75P p nt ) 藻类细胞受害较轻的情况下起作用 , 这已在
实脸结果中得以证明。
关于酶活性受影响的作用机理 : 一种可能是锡的作用使做为酶辅助因子的金属离子
的吸收和利用受阻的结果多 另一种可能是锡与酶蛋 白的某些基团结合成鳌合物 , 使酶的
结构和构型发生变化而 影响酶的活性 。
五 、 结 论
1
。 羊角月芽藻对锡的毒性作用反应敏感 , 适于 用来检验铜的毒性 。 锡作用羊 角 月
芽藻的 , 6 E C 50 值为 。 。 s 3 m g / L e d c t: , l p p m e d c l: 使其生 长 的 滞 缓 期 延 长 , Zp p 。
c d d
: 使其停 止生长 , 96 小时出现死亡 , 3 p p o c d c 12 作用 24 小时内出现死亡 。
2
。 在非致死锦浓度范围内 ( 。 . 25 一 l 。 s p p二 ) , 随锡浓度增加 , 锡对羊角月藻 的 生
长挤殖有明显抑制作用 , 细胞分裂受抑制强烈。
3
。 。 . 25 一 1。 s p p m cd o l , 使羊角月芽藻的 D N人 和叶绿素 a 含最明 显 减 少 , 脱 氢
酶 、 D N人 酶 、 过氧化物酶活性受到强烈影响 , 前者受抑制 , 后二者受促进 , 其光召放氧
能力和细胞膜透性也受到抑制和破坏 。
A B ST R AC T
T卜e t o x i c o l o ` i c a l r . o p o 妞 s e o f t h e f r e o h贫 a t e r ` r . e n a l g a s o l考” a s t r姗
c `尹 i e o r , ` t . 优 t 0 e a d m i u和 , a s w e l l a s u p t a k e 乒匕 d a e e u 山 u l a t i o n e a p a e i t y . h a s
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b o n u e l e a . e a e t i甲 i t y , d e五y d r o g e n a s e a e t i v i t y a n d P e r o x i d a s e a e t i丫 i t了 a r e
一 遨 f r e e t e d i n t e n s e l y . i t s e e l l d i v i s i o n o x 了 , e n e v o l u t i o n a n d c e l一m e m b r a n e p e r ·
皿 e a b i l i t r a r e a l s o i n h i b i t e d a n d d e s t r o了 e d s三g n i f i e a n t l了。
参 考 文 做
户
( l 〕 三根靖弘等 (环境污染物质 与毒性 》 无机篇 P Z . P` 5 . P 53一 5 5 (一。一 )
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〔 3 ) 卞泳梅、 陈淑元 . 植物生理学 通讯 N l . P 41 . ( 19 8 2 )
〔 4 〕 孙赛初 、 王焕校 、 李启任 , 植物生理学报 1一 1 13一 12 1 ( 一, 5 5 )
〔 5 〕 华东师大生物系值物教研室编 《植物生理学实验指导 》 P 143 一 1“ ( 1 9 8 0)
[ 6 〕 蔡剑萍等 , 植物生 理学通 讯 N 2. P s 3 ( x o s o )
( 7 〕 B a k e r , N . D . , M a y b i e l d , C . 1. , a n d I . n is s , W . E . (一。5 3 ) . C ` e 用 。 : 户几。 r e一 2 , 3 5一4 ; .
〔 s 〕 B at n d , J . J . , a n d Be e k e r , D . W . ( 一g a` ) . J . B ` o e o e r 夕 e t i e s a , d B ` o 用 e 用 6 r a . e ; . 1 5 . 2 3 ,一
2 4 8
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( 9 〕 fB 笋 。 , G . W . ( l 。了一) . P r o c . R . S o c . L o . d 。 B x了7 , 5 5 。一3 4 0 .
〔 10〕 D . b o . s , M . , e t a l . (一。5 6 ) . 通。 a l . C h e 沉 . 28 , 3 5 0 .
〔一 〕 aF ] e h o k , e t a l . ( 一, 7 5 . ) . J . S助协了e r . C y * 0 1. 7 , J 3 ,一 5 2 .
( 12 〕 G i p p is , J . F . , a n d oC l le r , B . A . W . ( 10 5 2 、 . 纽通 “ s f . J 。 M a r . F r e : h脚 a t e r . R e : . 33 . 0 7。一
08 7
-
( 一3〕 H . l l e b u s * , J . A . , a o d tC a i g ie , J . 5 . H A N D BO O K O F P H 丫OC L O G IC O L ;M E T HO D S
.
V 一 3 2 1
一 34 3 .〔 z魂〕 I k a d a , M 二 a n d W a t a n a b e , Y . (一g e s ) . E 劣 P 。 C e l l . R e s . 3 , . 5 5 4一 5 9 0 .
〔一5〕 K u o i t z , M . ( 一。 50 ) . J . G e 二 几夕5 10 1. 33 , 3峨9一 3 6 3 .·〔一e 〕 L ` y n e , E . ( 1白5 7 ) . M E T H O D s IN E N Z Y M O L O G Y . v 3 . 4 ; 了.
( x 7〕 L 下-e K im , H二 W o 之. ia k , P . C . , a . d F l et e卜e r . R . A . ( 19 5 0 ) . C a o . J 。 B o , . 58 , 1了a o一 J 7日。 .
( 1 . 〕 51皿 ` , J . F . , ` . d C h i n , B . ( 10 7。 ) . oT x ` e o 了o g y . A p p l . P h a r 用 a c o l o g , . ` 0 , 2 5 3一2 5 0 .
(一。〕 5 1. 。卜a l , R . L . , M e r a li , 2 . , a n d rH d i n a , P . D . ( x g 了6 ) . F 心 d e r a t i o , . P 几oc e e d i . 口 , . 35 , 75一
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〔2 0 〕 S e h n e i d e r , W . C . ( 1 0 6 咯) . IH ID . 7峨7 .
〔2门 W i t b a 口 , F . H . , B la y d e s , D . F . , a n d D iv l i。 , R . M . ( 1 97 盆) . E X P E又IM E N T S IN P L A N T P斗
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( 2 2 〕 W a r b o r g , Q . , a n d K u i p p a h l , G . ( 一g e o ) . 2 . N a t u r t o r so h . x 5 6 , 3 6毛 .
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