全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ２０１５， ４２（３）： ４１８ － ４２４ ＤＯＩ： １０􀆰 １３８０２ ／ ｊ． ｃｎｋｉ． ｚｗｂｈｘｂ． ２０１５􀆰 ０３􀆰 ０２０
基金项目： 国家自然科学基金（３１１３００４４，３１４００１３６，３１４０１７１２）
∗通讯作者（Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）， Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｗｅｉｔａｉｙｕｎ＠ ｆａｆｕ． ｅｄｕ． ｃｎ
收稿日期： ２０１４ － １０ － １７
抑制南方水稻黑条矮缩病毒非结构蛋白 Ｐ５⁃１ 的表达
阻碍病毒在昆虫体内的增殖
曹金强　 王针针　 陈红燕　 毛倩卓　 贾东升　 魏太云∗
（福建农林大学植物病毒研究所， 福建省植物病毒学重点实验室， 福州 ３５０００２）
摘要： 为明确南方水稻黑条矮缩病毒（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｒｉｃｅ ｂｌａｃｋ⁃ｓｔｒｅａｋｅｄ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ，ＳＲＢＳＤＶ）编码的非结
构蛋白 Ｐ５⁃１ 参于 ＳＲＢＳＤＶ在介体白背飞虱体内侵染过程中的作用机制，通过原核表达蛋白制备
ＳＲＢＳＤＶ编码的非结构蛋白 Ｐ５⁃１ 的多克隆抗体，并应用 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 和免疫荧光标记法检测抗体
的特异性，以注射法将来源于 Ｐ５⁃１ 基因的 ｄｓＲＮＡ（ｄｓＰ５⁃１）注入获毒 １ ｄ的白背飞虱体内，５ ｄ 后通
过免疫荧光标记法检测 ｄｓＰ５⁃１ 对 ＳＲＢＳＤＶ在白背飞虱体内增殖的影响，同时以注射来源于 ＧＦＰ基
因的 ｄｓＲＮＡ（ｄｓＧＦＰ）为对照。 结果显示，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和免疫荧光标记分别检测到 ＳＲＢＳＤＶ侵染水
稻和白背飞虱表达的 Ｐ５⁃１ 蛋白，表明所制备的 Ｐ５⁃１ 抗体具有特异性。 ｄｓＧＦＰ 处理的对照组白背
飞虱带毒率高达 ８１％ ，而 ｄｓＰ５⁃１ 处理的白背飞虱带毒率仅为 ２１％ ，且 Ｐ５⁃１ 蛋白的表达和 ＳＲＢＳＤＶ
在昆虫体内的增殖均受到抑制。 表明 Ｐ５⁃１ 蛋白是病毒在昆虫体内增殖的关键因子，可作为阻断病
毒在昆虫体内增殖的理想靶标。
关键词： 南方水稻黑条矮缩病毒； Ｐ５⁃１ 蛋白； 抗体制备； ＲＮＡ干扰； 增殖
Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｏｆ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ５⁃１ ｏｆ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｒｉｃｅ ｂｌａｃｋ⁃ｓｔｒｅａｋｅｄ
ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｖｉｒａｌ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎｓｅｃｔｓ
Ｃａｏ Ｊｉｎｑｉａｎｇ　 Ｗａｎｇ Ｚｈｅｎｚｈｅｎ　 Ｃｈｅｎ Ｈｏｎｇｙａｎ　 Ｍａｏ Ｑｉａｎｚｈｕｏ　 Ｊｉａ Ｄｏｎｇｓｈｅｎｇ　 Ｗｅｉ Ｔａｉｙｕｎ∗
（Ｆｕｊｉａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｆｕｊｉａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｆｕｚｈｏｕ ３５０００２， Ｆｕｊｉａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ５⁃１ ｏｆ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｒｉｃｅ ｂｌａｃｋ ｓｔｒｅａｋｅｄ
ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ （ ＳＲＢＳＤＶ） ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｓｅｃｔ ｖｅｃｔｏｒ ｗｈｉｔｅ⁃ｂａｃｋｅｄ ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ （ＷＢＰＨ）， Ｓｏｇａｔｅｌｌａ ｆｕｒｃｉｆｅｒａ
（Ｈｏｒｖáｔｈ）， ｈｅｒｅ ｔｈｅ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐ５⁃１ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ， ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ
ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｐ５⁃１． Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ
ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ． ＷＢＰＨ ｗａｓ ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｓＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｐ５⁃１ ｇｅｎｅ （ ｄｓＰ５⁃１ ） ｏｆ
ＳＲＢＳＤＶ ｏｒ ｄｓＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＧＦＰ ｇｅｎｅ （ｄｓＧＦＰ） ａｔ ｄａｙ ｏｎｅ ａｆｔｅｒ ｖｉｒｕｓ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ． Ｆｉｖｅ ｄａｙｓ ｌａｔｅｒ， ｔｈｅ
ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｓＰ５⁃１ ｏｎ ｖｉｒａｌ ｍｕｌｉｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｓｅｃｔ ｖｅｃｔｏｒ ｗａｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ．
Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ５⁃１ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ， ａｎｄ ｔｈｅ
ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｐ５⁃１ ｗａｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｉｎ ｖｉｒｕｌｉｆｅｒｏｕｓ ＷＢＰＨ ｂｙ ｕｓｉｎｇ
ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ． Ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｖｉｒｕｌｉｆｅｒｏｕｓ ｉｎｓｅｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｗａｓ ８１％， ｗｈｉｌｅ ｔｈａｔ ｏｆ ｄｓＰ５⁃１
ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｗａｓ ２１％ ． ｄｓＰ５⁃１ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐ５⁃１ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
ＳＲＢＳＤＶ ｉｎ ｔｈｅ ｂｏｄｙ ｏｆ ＷＢＰＨ ｖｅｃｔｏｒ． Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ Ｐ５⁃１ ｗａｓ ｔｈｅ ｋｅｙ ｆａｃｔｏｒ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ
ｖｉｒａｌ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｖｅｃｔｏｒ， ｗｈｉｃｈ ｍａｙ ｓｅｒｖｅ ａｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｖｉｒａｌ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ＷＢＰＨ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｒｉｃｅ ｂｌａｃｋ ｓｔｒｅａｋｅｄ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ； Ｐ５⁃１ ｐｒｏｔｅｉｎ； ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ； ＲＮＡ
ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ； ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ
　 　 南方水稻黑条矮缩病毒 （ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｒｉｃｅ ｂｌａｃｋ
ｓｔｒｅａｋｅｄ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ，ＳＲＢＳＤＶ）属于呼肠孤病毒科刺
突呼肠孤病毒亚科斐济病毒属 ２ 群的一个暂定种
（周国辉等，２００８；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． ，２０１０）。 ２００９—２０１０
年，由该病毒引起的病毒病在我国南方稻区大面积
暴发（张松柏等，２０１０；周国辉等，２０１０；翟保平等，
２０１１），同期在越南北部也普遍发生 （郭荣等，
２０１０），给水稻生产造成巨大的损失，目前仍是我国
南方稻区流行的重要病毒病。
ＳＲＢＳＤＶ 病毒粒体为正二十面体球状颗粒，直
径 ６５ ～ ７０ ｎｍ。 基因组由 １０ 条 ｄｓＲＮＡｓ 组成，共编
码 ６ 个结构蛋白和 ７ 个非结构蛋白（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． ，
２０１０；Ｈｏａｎｇ ｅｔ ａｌ． ，２０１１）。 目前对非结构蛋白的研
究较多，已明确 Ｐ６ 在本氏烟 Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ
中具有 ＲＮＡ沉默抑制子功能（卢嫣红等，２０１１），而
在昆虫培养细胞中定位于病毒原质，参与病毒的复
制（Ｍａｏ ｅｔ ａｌ． ，２０１３）；Ｐ７⁃１ 在 ＳＲＢＳＤＶ 侵染的白背
飞虱 Ｓｏｇａｔｅｌｌａ ｆｕｒｃｉｆｅｒａ培养细胞和体内可形成包裹
病毒粒体的管状结构，参与病毒在介体昆虫体内的
扩散（Ｊｉａ ｅｔ ａｌ． ，２０１４），与其亲缘关系最近的水稻黑
条矮缩病毒（Ｒｉｃｅ ｂｌａｃｋ ｓｔｒｅａｋｅｄ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ，ＲＢＳＤＶ）
编码的 Ｐ７⁃１ 蛋白在本氏烟中可定位于胞间连丝
（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ． ，２０１３ａ），与病毒的运动有关，在拟南芥
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ 中过表达 Ｐ７⁃１ 蛋白可引起雄性
不育（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ． ，２０１３ｂ）。 Ｐ９⁃１ 形成颗粒状的内含
体，是病毒原质的主要成分，参与病毒的复制（Ｊｉａ ｅｔ
ａｌ． ，２０１２）；Ｐ５⁃１ 定位于病毒原质的丝状内含体，且
丝状内含体上分布着大量未成熟的病毒粒体，其边
缘分布着成熟的病毒粒体，因此推测 Ｐ５⁃１ 是病毒原
质的组分，参与病毒的复制和装配 （Ｍａｏ ｅｔ ａｌ． ，
２０１３）。
ＳＲＢＳＤＶ由介体白背飞虱以持久增殖型方式传
播，白背飞虱取食水稻病株汁液后，仅有少量病毒粒
体可侵入昆虫的上皮细胞进行初侵染，并经过复制
和装配产生大量新的子代病毒粒体，然后才能扩散
到其它组织进行再侵染（ Ｊｉａ ｅｔ ａｌ． ，２０１２；贾东升，
２０１３），因此阻止病毒的复制和装配将阻断病毒在
昆虫体内持久性侵染。 为此，本试验根据 Ｐ５⁃１ 定位
于病毒原质且周围分布着未成熟和成熟病毒粒体的
研究基础（Ｍａｏ ｅｔ ａｌ． ，２０１３），首先通过原核表达蛋
白制备 Ｐ５⁃１ 的抗体，然后应用免疫荧光标记技术和
ｄｓＲＮＡ诱导的 ＲＮＡ 干扰（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）
技术鉴定 Ｐ５⁃１ 在 ＳＲＢＳＤＶ 复制和装配过程中的功
能，为筛选病毒关键蛋白用于阻断介体昆虫携带和
传播 ＳＲＢＳＤＶ奠定基础。
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试水稻病株和白背飞虱：ＳＲＢＳＤＶ 侵染的水
稻病株采自海南三亚市，通过介体传毒分离获得
ＳＲＢＳＤＶ 的纯系植株并种植于福建农林大学植物
病毒研究所田间水稻病毒圃。 介体白背飞虱采自
福建农林大学试验田，于 ２７ ℃条件下饲养在水稻
幼苗上。
供试菌株与载体：大肠杆菌表达菌株 Ｒｏｓｅｔｔａ
为本实验室保存，入门载体 ｐＤＯＮＲ２２１、表达载体
ｐＤＥＳＴ１７ 购自美国 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司。 ＳＲＢＳＤＶ 编码
Ｐ１０ 蛋白的多克隆抗体由本实验室制备保存。
试剂：Ｔ７ 转录试剂 Ｔ７ ＲｉｂｏＭＡＸＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＲＮＡｉ
Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔｓ和反转录酶 Ｍ⁃ＭｕＬＶ 购自美国 Ｐｒｏｍｅｇａ
公司；ＢＣＩＰ ／ ＮＢＴ显色液、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ⁃１００ 购自美国 Ｓｉｇ⁃
ｍａ公司；入门载体重组酶 Ｇａｔｅｗａｙ ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ Ｅｎ⁃
ｚｙｍｅ Ｍｉｘ、表达载体重组酶 Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ Ｅｎ⁃
ｚｙｍｅ Ｍｉｘ、Ｔｒｉｚｏｌ、荧光素粉 ｒｈｏｄａｍｉｎｅ 和 ＦＩＴＣ、Ａｃｔｉｎ
染料 Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ⁃Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、交联碱性磷酸酶的
羊抗兔二抗购自美国 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。
仪器：Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５ 共聚焦显微镜，德国 Ｌｅｉｃａ
公司；Ｅｆｆｅｎｄｏｒｆ ＩｎｊｅｃｔＭａｎ ＮＩ ２ 微针注射仪，德国 Ｅｆ⁃
ｆｅｎｄｏｒｆ公司。
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ ＳＲＢＳＤＶ Ｐ５⁃１ 表达载体的构建
以 ＳＲＢＳＤＶ 基因组第 ５ 条链序列（ ＧｅｎＢａｎｋ：
ＨＭ５８５２７５􀆰 １）设计扩增 Ｐ５ 基因开放阅读框 １ ～
７５０ ｂｐ 基因片段的引物 Ｐ５⁃１ＧＦ ／ Ｒ （表 １ ）。 以
ＳＲＢＳＤＶ侵染的水稻病株总 ＲＮＡ 为模板进行 ＲＴ⁃
ＰＣＲ扩增目的基因片段，获得的目的基因片段参
照 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ重组系统试剂说明书进行入门载体重
组和目的载体重组反应，最终获得表达载体 ｐＤ⁃
ＥＳＴ１７⁃Ｐ５⁃１。
１􀆰 ２􀆰 ２ ＳＲＢＳＤＶ Ｐ５⁃１ 的原核表达和抗血清的制备
通过热击法将原核表达载体 ｐＤＥＳＴ１７⁃Ｐ５⁃１ 转
入表达菌株 Ｒｏｓｅｔｔａ获得阳性诱导表达菌株，参照郭
９１４３ 期 曹金强等： 抑制南方水稻黑条矮缩病毒非结构蛋白 Ｐ５⁃１ 的表达阻碍病毒在昆虫体内的增殖
年梅等（２０１２）方法添加 ０􀆰 １ ｍＭ异丙基硫代半乳糖
苷于 ２８ ℃、２３０ ｒ ／ ｍｉｎ 条件下诱导表达目的蛋白。
收集到的菌体经煮沸裂解后通过 １２％ ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ
凝胶电泳分离，电泳后的凝胶置于 ０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ 预冷
ＫＣｌ溶液中处理 ３ ～ ４ ｍｉｎ即可观察到乳白色蛋白条
带，参照蛋白 Ｍａｒｋｅｒ将目的蛋白条带用刀片切割回
收，加入弗氏佐剂研磨至乳化状并免疫新西兰兔，免
疫 ５ 次后动脉取血获得抗血清， － ２０ ℃保存备用。
１􀆰 ２􀆰 ３ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法检测抗体
提取 ＳＲＢＳＤＶ侵染的水稻病株和健康水稻植株
总蛋白，参照贾东升等（２０１４）Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测方法
将总蛋白经 １２％ ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ 凝胶电泳分离并转印
到聚偏二氟乙烯膜上，以稀释 １ ０００ 倍的 Ｐ５⁃１ 抗血
清为一抗，稀释 ３０ ０００ 倍的交联碱性磷酸酶的羊抗
兔抗体为二抗进行杂交，最后于 ＢＣＩＰ ／ ＮＢＴ 显色液
中进行显色反应并观察效果。 检测后具有特异性的
Ｐ５⁃１ 抗血清参照 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＩｇＧ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ试剂
说明书提纯抗体免疫球蛋白 Ｇ（ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ，
ＩｇＧ），并参照贾东升等（２０１４）方法将提纯后的 ＩｇＧ
与荧光素 ｒｈｏｄａｍｉｎｅ 交联，获得荧光抗体 Ｐ５⁃１⁃ｒｈｏ⁃
ｄａｍｉｎｅ，将实验室制备保存的 ＳＲＢＳＤＶ Ｐ１０ 多克隆
抗体与荧光素 ＦＩＴＣ交联，获得荧光抗体 Ｐ１０⁃ＦＩＴＣ。
表 １ 本研究中所用到的引物
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
引物 Ｐｒｉｍｅｒ 引物序列 Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｐ５⁃１ＧＦ ５′ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＡＣＡＴＡＴＴＣＧＡＡＡＧＴＧＡＡＧＡＴＧＡ３′
Ｐ５⁃１ＧＲ ５′ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＧＴＴＧＴＴＴＧＴＣＡＣＴＴＴＧＴＣＴＡＣＧ３′
Ｐ５⁃１Ｔ７Ｆ ５′ＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＡＣＧＣＣＧＡＴＴＧＣＴＧＡＡＣ３′
Ｐ５⁃１Ｔ７Ｒ ５′ＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＴＣＣＧＡＧＡＴＴＴＣＴＡＡＧＴＣＧＡＡＧＣ３′
ＧＦＰＴ７Ｆ ５′ＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＧＡＧＴＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴ３′
ＧＦＰＴ７Ｒ ５′ＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＴＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴＧ３′
　 　 下划线序列为 Ｇａｔｅｗａｙ重组位点，斜体序列为 Ｔ７ 启动子位点。 Ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｓ ｔｈｅ Ｇａｔｅｗａｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ， ａｎｄ ｔｈｅ ｉｔａｌｉｃ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｓ ｔｈｅ Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｉｔｅ．
１􀆰 ２􀆰 ４ Ｐ５⁃１ 在带毒介体白背飞虱体内的定位
取约 ２００ 头 １ ～ ２ 龄的无毒白背飞虱若虫在
ＳＲＢＳＤＶ侵染的水稻病株上饲毒 ２ ｄ，随后转到健
康水稻上饲养。 在饲毒后 １０ ｄ 取 ３０ 头若虫参照
Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （２０１２）方法解剖其消化道器官。 同时
以未饲毒的白背飞虱为对照组。 解剖获得的消化
系统器官首先经 ４％多聚甲醛试剂固定 ２ ｈ，接着
用 ０􀆰 ２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ⁃１００ 渗透液处理 ３０ ｍｉｎ，然后用
荧光抗体 Ｐ５⁃１⁃ｒｈｏｄａｍｉｎｅ （红色） 和 Ａｃｔｉｎ 染料
Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ⁃Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３（蓝色）孵育 １ ｈ，共聚焦
显微镜下观察Ｐ５⁃１在带毒昆虫体内的定位。
１􀆰 ２􀆰 ５ ｄｓＰ５⁃１对 ＳＲＢＳＤＶ在白背飞虱体内侵染的影响
根据 ＳＲＢＳＤＶ Ｐ５⁃１ 基 因 序 列 （ ＧｅｎＢａｎｋ：
ＨＭ５８５２７５􀆰 １）和绿色荧光蛋白 ＧＦＰ基因序列（Ｇｅｎ⁃
Ｂａｎｋ： ＡＦ３２４４０７􀆰 １）设计 ５′端含有 Ｔ７ 启动子序列
的 ｄｓＲＮＡ 合成引物 Ｐ５⁃１Ｔ７Ｆ ／ Ｒ 和 ＧＦＰＴ７Ｆ ／ Ｒ （表
１），参照 Ｔ７ ＲｉｂｏＭＡＸＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＲＮＡｉ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔｓ说
明书体外合成源于 Ｐ５⁃１ 基因的 ｄｓＲＮＡ（ｄｓＰ５⁃１）和
源于 ＧＦＰ基因的 ｄｓＲＮＡ（ｄｓＧＦＰ）。 取 １００ 头 ３ 龄白
背飞虱若虫饲毒 １ ｄ，随后通过微针注射法将 ０􀆰 ５
μｇ ／ μＬ ｄｓＲＮＡ ０􀆰 １ μＬ注射到其腹部，然后在健康水
稻幼苗上饲养。 注射后 ６ ｄ 分别抓取 ５０ 头白背飞
虱按 １􀆰 ２􀆰 ４ 以荧光抗体 Ｐ５⁃１⁃ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（红色）、Ｐ１０⁃
ＦＩＴＣ（绿色）和 Ａｃｔｉｎ 染料 Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ⁃Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３
（蓝色）进行免疫荧光标记，共聚焦显微镜下观察
ｄｓＰ５⁃１ 对 ＳＲＢＳＤＶ 在白背飞虱体内复制和扩散
的影响。 　
１􀆰 ３ 数据分析
采用 ＳＰＳＳ １７􀆰 ０ 软件进行试验数据分析，用 ｔ检
验法检验 ｄｓＧＦＰ 与 ｄｓＰ５⁃１ 处理组之间白背飞虱带
毒率的差异显著性。
２ 结果与分析
２􀆰 １ 原核表达载体 ｐＤＥＳＴ１７⁃Ｐ５⁃１ 的构建
以 ＳＲＢＳＤＶ侵染水稻病株总 ＲＮＡ 为模板，ＲＴ⁃
ＰＣＲ扩增获得约 ８１４ ｂｐ的基因片段，其大小等于引
物 ５′端重组序列与目的基因片段之和（图 １）。 随后
经 ＢＰ和 ＬＲ重组反应将目的片段重组构建到表达
载体 ｐＤＥＳＴ１７，测序鉴定后获得正确的表达载体
ｐＤＥＳＴ１７⁃Ｐ５⁃１。
２􀆰 ２ Ｐ５⁃１ 目的蛋白的诱导表达
转入表达载体 ｐＤＥＳＴ１７⁃Ｐ５⁃１ 的大肠杆菌
Ｒｏｓｅｔｔａ菌落经 ０􀆰 １ ｍＭ 异丙基硫代半乳糖苷诱导
表达目的蛋白，总蛋白经 １２％ ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ 凝胶电
０２４ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
图 １ ＰＣＲ检测表达载体 ｐＤＥＳＴ１７⁃Ｐ５⁃１ 质粒
Ｆｉｇ． １ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ
ｐＤＥＳＴ１７⁃Ｐ５⁃１ ｂｙ ＰＣＲ
Ｍ： ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ； １⁃２： ｐＤＥＳＴ１７⁃Ｐ５⁃１．
　
泳分离并用考马斯亮蓝染色，可观察到约 ３１ ｋＤ大
小的特异性表达蛋白条带，大小与预测目的蛋白
相符（图 ２）。
图 ２ ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ分析 ＳＲＢＳＤＶ Ｐ５⁃１
在大肠杆菌的原核表达
Ｆｉｇ． ２ ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐ５⁃１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ＳＲＢＳＤＶ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
Ｍ： 蛋白 ｍａｒｋｅｒ； １： ＩＰＴＧ诱导表达的蛋白； ２： 未加
ＩＰＴＧ诱导表达的蛋白。 Ｍ： Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ； １： ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘ⁃
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＩＰＴＧ； ２； ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ
ＩＰＴＧ．
　
２􀆰 ３ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测 Ｐ５⁃１ 抗血清
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测结果显示 ＳＲＢＳＤＶ 侵染水稻
病株样品可杂交到约 １０８ ｋＤ 的蛋白条带，其大小
与 Ｐ５⁃１ 蛋白的预测值相符，而健康水稻样品中无
相应条带，表明所制备的 Ｐ５⁃１ 抗体具有特异性
（图 ３）。
２􀆰 ４ Ｐ５⁃１ 在带毒白背飞虱体内的分布
对饲毒后 １０ ｄ 的白背飞虱和未饲毒的白背飞
虱消化道组织进行免疫荧光标记检测，共聚焦显微
镜下观察到 Ｐ５⁃１（红色）呈颗粒状或片状分布在带
图 ３ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法检测 ＳＲＢＳＤＶ Ｐ５⁃１
抗体的特异性
Ｆｉｇ． ３ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ＳＲＢＳＤＶ Ｐ５⁃１
Ｍ： 蛋白 ｍａｒｋｅｒ； １： 健康水稻总蛋白； ２： ＳＲＢＳＤＶ
侵染的水稻总蛋白。 Ｍ： Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ； １： ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ
ｈｅａｌｔｈｙ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔ； ２： ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔ．
　
毒白背飞虱中肠表面的环肌和纵肌上（蓝色），而未
饲毒的白背飞虱体内均检测不到荧光信号，表明
Ｐ５⁃１ 的抗体可特异性标记病毒侵染形成的 Ｐ５⁃１，且
饲毒后 １０ ｄ病毒编码的 Ｐ５⁃１ 主要分布在中肠表面
的肌肉组织上（图 ４）。
２􀆰 ５ ｄｓＰ５⁃１ 抑制 ＳＲＢＳＤＶ在白背飞虱体内的增殖
对 ｄｓＧＦＰ处理的白背飞虱消化道组织进行免
疫荧光标记检测，观察到约 ８１％被病毒侵染且表
达了 Ｐ５⁃１（红色）和 Ｐ１０（绿色）蛋白，二者均分布
在中肠表面的肌肉组织（蓝色），在中肠上皮细胞
内没有分布（图 ５ 和图 ６⁃Ａ、Ｂ）。 而 ｄｓＰ５⁃１ 处理的
白背飞虱仅 ２１％的个体被病毒侵染，７９％个体的
中肠上皮细胞和外表肌肉组织中均未检测到 Ｐ５⁃１
和 Ｐ１０ 蛋白（图 ５ 和图 ６⁃Ｃ、Ｄ），表明 ｄｓＰ５⁃１ 干扰
了 Ｐ５⁃１ 蛋白的表达，从而抑制了病毒粒体的复制
和装配。
３ 讨论
病毒原质是植物呼肠孤病毒的增殖场所，病
毒在病毒原质中完成病毒基因组的复制、病毒蛋
白的表达和病毒粒体的装配（Ａｔｔｏｕｉ ｅｔ ａｌ． ，２０１２）。
ＳＲＢＳＤＶ编码的 Ｐ５⁃１ 蛋白是病毒在介体昆虫培养
细胞内形成病毒原质基质的组分之一（Ｍａｏ ｅｔ ａｌ． ，
２０１３），因此是病毒在昆虫体内增殖所必须的非结
构蛋白之一。 为了进一步明确 Ｐ５⁃１ 在病毒侵染介
体昆虫细胞中的功能，本研究以原核表达 Ｐ５⁃１ 蛋
白 Ｎ 端氨基酸片段所制备的 Ｐ５⁃１ 抗体，可用于
１２４３ 期 曹金强等： 抑制南方水稻黑条矮缩病毒非结构蛋白 Ｐ５⁃１ 的表达阻碍病毒在昆虫体内的增殖
图 ４ Ｐ５⁃１ 在带毒白背飞虱中肠组织中的分布
Ｆｉｇ． ４ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ５⁃１ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｄｇｕｔ ｏｆ ｖｉｒｕｌｉｆｅｒｏｕｓ ｗｈｉｔｅ ｂａｃｋｅｄ ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ
Ａ： 病毒侵染的白背飞虱； Ｂ： 病毒未侵染的白背飞虱； ｍｇ： 中肠； ｃｍ： 环肌； ｌｍ： 纵肌。 Ａ： Ｔｈｅ ｍｉｄｇｕｔ ｏｆ ｖｉｒｕｌｉｆｅｒｏｕｓ
ＷＢＰＨ； Ｂ： ｔｈｅ ｍｉｄｇｕｔ ｏｆ ｎｏｎ⁃ｖｉｒｕｌｉｆｅｒｏｕｓ ＷＢＰＨ； ｍｇ： ｍｉｄｇｕｔ； ｃｍ： ｃｉｒｃｕｌａｒ ｍｕｓｃｌｅ； ｌｍ： ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｍｕｓｃｌｅ．
　
图 ５ ｄｓＰ５⁃１ 对白背飞虱带毒率的影响
Ｆｉｇ． ５ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｓＰ５⁃１ ｏｎ ｔｈｅ ｖｉｒｕｌｉｆｅｒｏｕｓ ＷＢＰＨｓ
图中数据为平均数 ±标准差。 不同字母表示经 ｔ 检
验法检验在 Ｐ ＜ ０􀆰 ０５ 水平差异显著。 Ｄａｔａ ａｒｅ ｍｅａｎ ±
ＳＤ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ Ｐ ＜
０􀆰 ０５ ｌｅｖｅｌ ｂｙ ｔ ｔｅｓｔ．
　
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 检测 ＳＲＢＳＤＶ 侵染水稻产生的 Ｐ５⁃１
蛋白，以及免疫荧光标记检测昆虫体内的病毒蛋
白，表明以 Ｐ５⁃１ 蛋白的 Ｎ 端部分片段所制备的抗
体可用于 Ｐ５⁃１ 功能的研究，避免了抗体制备过程
中原核表达大分子蛋白的困难（郑胜兰等，２０１４）。
同时也为利用免疫电镜技术检测病毒在昆虫体内
的分布提供了特异性抗体（胡伟贞等，１９８５）。
ＳＲＢＳＤＶ非结构蛋白 Ｐ５⁃１ 作为病毒原质的组
分蛋白，与其它另外 ２ 个病毒编码的非结构蛋白
Ｐ６ 和 Ｐ９⁃１ 共同形成完整的病毒原质，并在病毒原
质中呈丝状结构分布，由于未成熟和成熟的病毒
粒体主要分布在 Ｐ５⁃１ 形成的丝状结构上（Ｍａｏ ｅｔ
ａｌ． ，２０１３），因此推测 Ｐ５⁃１ 参与病毒粒体的复制和
装配。 本研究通过注射法将 ｄｓＰ５⁃１ 导入白背飞虱
体内，不仅抑制了其在昆虫消化道器官的表达，而
且抑制了病毒粒体外层衣壳蛋白 Ｐ１０ 的表达，阻
碍了病毒在昆虫体内的增殖，即抑制 Ｐ５⁃１ 的表达
可阻碍病毒的增殖，由此证明 Ｐ５⁃１ 是协助 ＳＲＢＳ⁃
ＤＶ在介体昆虫体内增殖的重要蛋白。 本试验结
果同时也表明 ＳＲＢＳＤＶ Ｐ５⁃１ 可作为理想的靶标蛋
白，通过基于 ｄｓＲＮＡ 诱导的 ＲＮＡｉ 技术原理阻断
病毒在昆虫体内的增殖，从而阻止病毒通过介体
白背飞虱的高效传播。
此外，本试验中 ＳＢＢＳＤＶ Ｐ５⁃１ 的表达受到抑制
后，同时抑制病毒外层衣壳蛋白 Ｐ１０ 的表达，这一现
象反映出 Ｐ５⁃１ 对病毒在昆虫体内的增殖存在着调
控功能。 因此，Ｐ５⁃１ 作为病毒原质的组分之一，是
否对组成病毒粒体的其它结构蛋白的表达也存在调
节作用，还有待下一步深入研究。
２２４ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
图 ６ ｄｓＰ５⁃１ 抑制 ＳＲＢＳＤＶ在白背飞虱体内的增殖
Ｆｉｇ． ６ Ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＲＢＳＤＶ ｗａｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｄｓＰ５⁃１ ｉｎ ＷＢＰＨｓ
Ａ ～ Ｂ： ｄｓＧＦＰ处理后 Ｐ１０ 和 Ｐ５⁃１ 在白背飞虱中肠的定位； Ｃ ～ Ｄ： ｄｓＰ５⁃１ 处理后 Ｐ１０ 和 Ｐ５⁃１ 在白背飞虱中肠的定位；
ｍｇ： 中肠。 Ａ － Ｂ： Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ１０ ａｎｄ Ｐ５⁃１ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｄｇｕｔ ｏｆ ｖｉｒｕｌｉｆｅｒｏｕｓ ＷＢＰＨｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｓＧＦＰ； Ｃ － Ｄ： ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｐ１０ ａｎｄ Ｐ５⁃１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｄｇｕｔ ｏｆ ｖｉｒｕｌｉｆｅｒｏｕｓ ＷＢＰＨｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｓＰ５⁃１； ｍｇ： ｍｉｄｇｕｔ．
　
参 考 文 献 （Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）
Ａｔｔｏｕｉ Ｈ， Ｍｅｒｔｅｎｓ ＰＰＣ， Ｂｅｃｎｅｌ Ｊ， Ｂｅｌａｇａｎａｈａｌｌｉ Ｓ， Ｂｅｒｇｏｉｎ Ｍ，
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（责任编辑：李美娟）
４２４ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷