全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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-
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
!"#$)"#)"!
基金项目$河南省科技攻关项目"
1!#"!##"#!(
#
作者简介$袁秀云"
#1,"
#!女!博士!教授!主要从事植物生物技术研究
2)34.5
$
6
7408.7
6
70
!
#$%+9:3
"
通信作者$崔
!
波!博士!教授!主要从事花卉育种研究
2)34.5
$
54:97.;:
!
#$%+9:3
蝴蝶兰几丁质酶基因的克隆及表达特性分析
袁秀云#!许申平#!宋彩霞!!崔
!
波#"!魏
!
博%
"
#
郑州师范学院 生物工程研究所!郑州
&*""&&
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!
郑州师范学院 生命科学学院!郑州
&*""&&
&
%
河南农业大学 生命科学学院!
郑州
&*"""!
#
摘
!
要$利用
<=)>?<
及
<@?2
技术!克隆到蝴蝶兰
#
个几丁质酶基因
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"
AB0C40D
登录号为
E=11!(*#
#!
该基因
9FG@
全长
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H
!包含
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H
的
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(
1%%;
H
开放阅读框和
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H
%I)J=<
!编码
%#"
个氨基酸&该蛋
白为糖苷水解酶第
#1
家族成员!兼具有溶菌酶活性&生物信息学分析显示!该蛋白具
G)
端信号肽和跨膜结构!为胞
外分泌蛋白&该蛋白与海枣(谷子(油棕和拟南芥的几丁质酶类似蛋白相近!并且在系统进化树上与甘蔗和陆地棉
的
"
类几丁质酶同属一个分支
!"#$%
基因的表达分析表明!
!"#$%
在蝴蝶兰营养器官和生殖器官中均有表
达!根中表达量最高&
#%K
%
(K
低温处理
%
(
$
(
1
和
#*L
时该基因的表达被抑制!
&K
低温处理
#
(
!
和
&M
表达量升
高研究表明!
!"#$%
基因能够响应短期的冷胁迫研究结果为进一步研究蝴蝶兰几丁质酶的系统进化及抗性
育种奠定了基础
关键词$蝴蝶兰&几丁质酶&表达分析&低温胁迫
中图分类号$
N,(*
&
N,($
文献标志码$
@
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R
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R
B:W\.WBQ9.B09B
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YMB0
R
ZM:7
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6
!
YMB0
R
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R
B:W\.WBQ9.B09B
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R
X.975V7X45J0.[BX/.V
6
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YMB0
R
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H
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R
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R
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R
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H
X:VB.0;B5:0
R
BLV:
R
5
6
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6
LX:54/BW43.5
6
#140L34
6
M4[B5
6
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6
3B49V.[.V
6
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W:X34V.9/4045
6
/./.0L.94VBLVM4VVM./
H
X:VB.0 4^/
H
XBL.9VBLV:;B40B8VX49B5754X/B9XBVBL
H
X:VB.0 .^VM4G)
VBX3.045/.
R
045
H
B
H
V.LB40L4VX40/3B3;X40B/VX79V7XB
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R
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6
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6
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9MV.04/B
R
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R
B0B 4^/B8
H
XB//BL.0[B
R
BV4V.[B40LXB
H
X:L79V.[B:X
R
40/ .^VM4
M.
R
MBXB8
H
XB//.:05B[B5.0X::VVM40:VMBX/+=MBB8
H
XB//.:0:W!"#$% 4^/LB9XB4/BL;
6
45:^ VB3
H
BX4V7XB
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%
(KW:X%
!
$
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140L#*L
!
40L.09XB4/BL;
6
&KVXB4V3B0VW:X#
!
40L&M+S7XXB/75V//7
RR
B/VVM4V
VMB!"#$%
H
54
6
/49X79.45X:5B.0XB/
H
:0L.0
R
V:VMB/M:XV)VBX39:5L/VXB//+=MB/BXB/75V/9:75L
H
X:[.LBVMB
W:70L4V.:0W:XW7XVMBX/V7L
6
VMB
H
M
6
5BV.9B[:57V.:0:W9M.V.04/B
R
B0B/40LVMB/VXB//XB/./V409B;XBBL.0
R
:W
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90
3
:"!,
$
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+
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HH
+
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9M.V.04/B
&
B8
H
XB//.:0
H
4VVBX0/
&
5:^ VB3
H
BX4V7XB/VXB//
!!
几丁质酶"
9M.V.04/B
#是一种降解几丁质的糖苷
酶!具有
G)
端信号肽(几丁质结合区和催化区等
%
个典型的结构域)#)!*在植物中!几丁质酶由多基因
家族编码!根据氨基酸序列的差异及结构域的有无!
几丁质酶被分为
!
个家族"
#(
家族和
#1
家族#共
,
类"
?54//
#$"
#!
#
(
%
(
&
(

和
"
属于
#1
家族!
(
和
)
属于
#(
家族)%*在植物中几丁质酶不但参
与植物的抗病防御反应)&*!还能对环境中的各种非
生物胁迫做出响应)**!参与植物发育)$),*及机械损
伤)(*(低温)1)##*(高盐(干旱)#!)#%*和重金属)#&)#**等多
种非生物胁迫的调控因此研究几丁质酶及其功能
有助于深入了解植物的抗病及逆境生理调控机制!
同时也可以为经济作物的抗性品种培育提供理论
依据
几丁质酶在植物中是一种主要的病程相关蛋
白!多年来的研究主要集中在抗病方面)#$*在非生
物胁迫中!几丁质酶也参与植物的低温胁迫生理调
控研究显示!黑麦中有
!
个冷诱导基因
#$%1
和
#$%&$
的蛋白分别属于
?54//
#
和
%
几丁质酶!具
有抗冻活性)1*&无芒雀麦中冷诱导几丁质酶基因
?-#$%#
与黑麦中的
#$%1
同源!但不受渗透胁
迫(脱落酸和乙烯利等胁迫的影响!其在
&K
具有抗
冻活性!在
#"K
具有轻微的抗冻活性)#,*&狗牙根在
冷驯化和脱水过程中!其
?54//
%
几丁质酶基因被
诱导表达)##*&甘蔗的
?54//
(
)
#(
*
(
#
(
&
和
"
)
#1
*几丁
质酶基因能响应多种生物胁迫和非生物胁迫!其中
包括
&K
低温胁迫&除此之外!植物中还存在一些几
丁质酶类似蛋白"
9M.V.04/B)5.DB
H
X:VB.0
!
?]#!也
具有几丁质酶的功能)!"*例如!在桑树)!#*(水稻)!!*
和拟南芥)!%*等植物中均克隆出几丁质酶类似基因!
研究发现这些基因在病虫害防御(环境胁迫和植物
发育等方面具有重要作用通过生物工程技术将几
丁质酶基因转入不同植物!其抗病能力能够增
强)!&*例如!转马铃薯几丁质酶茶树增强了抗疱状
疫病的能力)!**&水稻几丁质酶基因在转基因番茄中
的表达增强了番茄对枯萎病和早疫病的抗性)!$*&水
稻几丁质酶基因转入香蕉增强了香蕉对黑叶条纹病
的抗性)!,*&在烟草中过表达几丁质酶基因!不但具
有较高的真菌和细菌抗性!其对高盐和重金属胁迫
的抗性也增强)!(*可见!通过几丁质酶基因的遗传
转化提高抗逆能力为作物抗性育种提供了一条新
途径
尽管目前在很多植物中都克隆到不同的几丁质
酶基因!而兰科植物中几丁质酶基因及其研究还未
见报道蝴蝶兰"
!"&&()*
+
,-,/
HH
+
#是兰科植物中
常见的观赏兰花!具有很高的观赏价值由于其原
产于热带及亚热带地区!正常生长需要较高的温度
和湿度!低温胁迫是其生长的制约因素!研究蝴蝶兰
低温胁迫下调控基因的功能有助于理解其低温胁迫
的调控机制本研究以蝴蝶兰为材料!利用
<@?2
和
<=)>?<
方法克隆到
#
个几丁质酶基因的全编
码区序列!利用实时荧光定量的方法分析其在蝴蝶
兰不同组织及低温胁迫下的表达特性!旨在进一步
理解该基因在植物中的调控作用!并为蝴蝶兰低温
抗逆机理的研究及今后通过基因工程手段选育抗逆
新种质奠定理论基础
#
!
材料和方法
;+;
!
试验材料与处理
以蝴蝶兰品种+满天红,为试验材料!首先将生
长大小一致的生根瓶苗放在
#%K
%
(K
的昼夜温
度(
#!M
%
#!M
光暗条件的培养箱中!分别于培养
"
(
%
(
$
(
1
和
#*L
时取第二叶片组织!接着再放回正常
温室条件下"
!,K
%
!!K
昼夜温度#(
#!M
%
#!M
光暗
条件下恢复培养!并于
#
和
%L
时取第二叶片组织&
另外将蝴蝶兰植株放于
&K
冰箱分别于
"
(
#
(
!
(
&
(
(
(
#!
(
!&
和
&(M
时取第二片叶组织材料除此之
外!取温室中盛花期的根(叶(花葶(萼片(花瓣(唇
瓣(蕊柱和子房"授粉发育后#等组织&每次取样包含
%
个生物学重复!所有组织取材后迅速用液氮速冻!
于
("K
冰箱备用
;+<
!
方
!
法
;+<+;
!
蝴蝶兰几丁质酶基因全长的克隆
!
叶片组
织总
用
=X.Z:5
试剂"
T0[.VX:
R
B0
#提取!经
#`
琼脂糖凝胶电泳判断其完整性!利用
N*"""
核酸蛋
白分析仪"美国
N74^ B5
#测定
的浓度和纯度
采用
a)a\b
反转录酶"
=4E4<4
#!以
&K
处
理
#M
的叶片总
为模板合成单链
9FG@
&根据
G?CT
登录的序列设计
#
对简并引物
?]=)c
"
*I)?U)
?aA@?==?==?a@AA=E=@??@)%I
#和
?]=)<
!&!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
"*I)AQ==@EA@@A@@A?@A<==EAa?)%I
#!用
于扩增蝴蝶兰几丁质酶基因的中间片段
>?<
扩
增体系为
!"
*
!含
#"d;7WWBX!
*
!
9FG@
模板
#"""
$
!"""0
R
!
&
种
LG=>
各
#*"
*
3:5
-
#
!每
条引物
"+*
*
3:5
-
#
!
%&
@
FG@
聚合酶
#J

>?<
扩增程序为$
1*K
预变性
*3.0
&
1*K
变性
&"
/
!
*$K
退火
&"/
!
,!K
延伸
&"/
!
%!
个循环&
,!K
延伸
#" 3.0
回收目的片段!连接到
H
A2a)=
2@QO
载体上!转入大肠杆菌
F]*
+
菌株!进行克隆
和测序
根据几丁质酶基因的中间片段序列!设计
#
对
%I
端特异引物
AQ>%)#
"
*I)=@AA=A@=AAA?=)
A@@@A==A@)%I
#和
AQ>%)!
"
*I)?AA??@AAA?)
=@=A=@A@==?)%I
#!
#
对
*I
端特异引物
A>Q*)#
"
*I)=??@AA=A@A?@@AA@=@@@AA)%I
#和
A>Q*)
!
"
*I)@@A@@@=A??A??@??=??=)%I
#!按
?5:0VB9M
公司
Qa@<=
=a
<@?2@3
H
5.W.94V.:0D.V
操作说明进
行扩增!回收扩增产物!克隆到
H
A2a)=2@QO
载
体上!转入大肠杆菌
F]*
+
菌株!鉴定后进行测序!
并与中间片段进行拼接
然后根据拼接序列设计
#
对引物
?]T)S"
*I)=A=?A@@A@@@@=A=A?@A=?A)%I
#和
?]T)
S<<<
"
*I)AAA==@=A@@A@@A?@AA==AA)%I
#
进行开放阅读框"
S#扩增引物和测序由上海
立菲生物技术有限公司完成
氨基酸同源性分析在
G?CT
上进行&保守结构
域及功能域在
G?CT
的蛋白保守区数据库中搜索!
并用
Q940>X:/.VB
软件分析&利用
Q.
R
045>
(
=4X
R
BV>
和
U:\c>QS<=
软件分别进行信号肽和亚细胞定
位预测&蛋白理论分子量和等电点采用
>X:V>4X3
软件分析&采用
=a]aa!+"
分析跨膜结构&蛋白
质二级结构预测采用
28>@Q
6
网站上的
AS<>X:)
VB.0/B9:0L4X
6
/VX79V7XB
H
XBL.9V.:0
分 析&使 用
a2A@
软件的
Ge
法构建系统进化树
;+<+<
!
蝴蝶兰几丁质酶基因的表达分析
!
各种组
织总
用
>X.3BQ9X.
H
V<=XB4
R
B0VE.V .^VM
R
F)
G@2X4/BX
"
=4E4<4
#反转录成单链
9FG@
根据
基因全长设计
#
对特异引物
_
?]T)c
"
*I)=A?@A)
=@@AAA@=AAA@A=A=)%I
#和
_
?]T)<
"
*I)@@=)
??A@A?AA?=A@=@?@?)%I
#!产物长度
#(*;
H
!
以
901-)
"
eG#(*$**
#及
5A#
!
"
E?#*%"&*
#为内参基
因!引物分别为
@9V)c
"
*I)A?@A?@=A@@A@=)
?@@AA=AA)%I
#和
@9V)<
"
*I)A??==@A@@@=?)
?@?@=?=A==A)%I
#!
2c#
+
)c
"
*I)???==?==)
A?===?@???==A)%I
#和
2c#
+
)<
"
*I)AA@==A)
=@@???@??==?==?@)%I
#采用
QOC<>XB3.8
28%&
@
=a
%
D.V
"
=4E4<4
#进行
_
<=)>?<
反应反
应体系为
!*
*
!反应条件为
1*K
预变性
#*/
!
*$
K
变性
#*/
!
,! K
退火
#*/
"
&"
个循环#
_
<=)
>?<
反应在
2
HH
B0L:XW a4/VBX9
6
95BX
荧光定量
>?<
仪上进行!
%
次重复引物特异性分别通过溶
解曲线分析并测序!相对表达量按照
!

,,
#
V法计算
!
!
结果与分析
<+;
!
蝴蝶兰几丁质酶基因全长的克隆
以蝴蝶兰
&K
处理
#M
叶片的
9FG@
为模板!
以简并引物
?]T)c
和
?]T)<
进行中间片段的
>?<
扩增!得到
#
个
,,#;
H
保守片段"图
#
!
@
#!此片段
经
C54/VP
分析!包含
#
个
#1
家族几丁质酶结构域!
表明该片段为几丁质酶片段根据该片段序列!采
用
<@?2
技术!利用
AQ>*)#
和
AQ>*)!
引物扩增
获得
*I
端目的片段为
%(*;
H
"图
#
!
C
#!利用
AQ>%)#
和
AQ>%)!
引物扩增获得
%I
端目的片段为
%1&;
H
"图
#
!
?
#将中间片段(
%I
和
*I
端片段序列拼接!然
后在开放阅读框区域设计引物!进行扩增!得到了预
期的片段"图
#
!
F
#!最终得到该基因全长
9FG@
为
#!#";
H
通过
S查找具有完整的开放阅读框
其中包含
%,;
H
*I)J=<
(
1%%;
H
开放阅读框和
!&"
;
H
%I)J=<
"图
!
#!编码
%#"
个氨基酸其核苷酸序
列通过
C54/VG
分析!发现其与野芭蕉和甜菜的几丁
质酶基因分别具有
("`
和
,$`
一致性将该基因命
名为
!"#$%
!提交
AB0C40D
!登录号为
E=11!(*#

<+<
!
蝴蝶兰几丁质酶基因的生物信息学分析
利用
G?CT
的蛋白保守区数据库"
9:0/BX[BL
L:34.0L4V4;4/B
!
?FF
#对蝴蝶兰几丁质酶基因编
#+
保守片段&
!+*I)<@?2
&
%+%I)<@?2
&
&+
开放阅读框片段&
a+F\!"""
图
#
!
蝴蝶兰几丁质酶基因的扩增
#+?:0/BX[BLXB
R
.:0
&
!+*I)<@?2
&
%+%I)<@?2
&
+S&
a+F\!"""
c.
R
+#
!
@3
H
5.W.94V.:0:W9M.V.04/B
R
B0B.0!"&&()*
+
,-,/
HH
+
%&!
!
期
!!!!!!!!!!!!
袁秀云!等$蝴蝶兰几丁质酶基因的克隆及表达特性分析
码蛋白的保守区进行预测!结果表明!该蛋白在第
*1
$
!1*
氨基酸残基之间有一个几丁质酶糖苷酶
#1
家族结构域"
9L""%!*
!
2
值
$+**B)#"%
#!在此结构域
内有
%
个催化残基位点和
,
个糖结合位点"图
%
#!
说明该结构域包含催化区&该结构域还是一个溶菌
酶相似超家族基因的保守结构域!推测该蛋白兼具
溶菌酶活性利用
Q940>X:/.VB
软件分析!该蛋白不
具有几丁质酶结合区和
#1
家族几丁质酶特异的序
列标签&
>X:V>4X3
软件预测结果表明该蛋白分子量
为
%&+!*DF
!等电点为
$+&&
!为酸性蛋白
Q.
R
045>
的预测结果显示!该蛋白在
G)
端的第
#
$
%#
氨基酸
残基之间有一信号肽区域!第
%#
位丙氨酸"
@54
!
@
#
和
%!
位赖氨酸"
6
/
!
E
#之间为信号肽切割位点!从
%!
位氨基酸以后为成熟蛋白利用
=4X
R
BV>
和
U:\c>QS<=!
种软件对该蛋白的亚细胞定位进
行预测!
=4X
R
BV>
的预测显示该蛋白是分泌途径蛋
白!可能性为
1&+(`
!
U:\c>QS<=
的预测显示该
蛋白位于胞外!可能性是
(!`
!推测该蛋白属于胞
外分泌蛋白跨膜结构分析表明!在第
#%
$
%#
氨基
酸残基之间有一个跨膜信号区域表明蝴蝶兰该几
丁质酶为跨膜蛋白二级结构预测表明!该蛋白
+
螺旋占
%!+*$`
!延伸链占
#(+,#`
!
-
转角占
*+(#`
!随机卷曲占
&!+1"`

将蝴蝶兰几丁质酶基因编码的蛋白进行
C54/V>
比对!结果显示!该蛋白与多种植物几丁质酶具有
$*`
$
($`
一致性!其中与海枣(油棕(谷子(拟南芥
等几丁质酶类似蛋白具有
,"`
$
($`
一致性将
这些蛋白与其它各类几丁质酶蛋白一起构建系统进
@=A+
起始密码子&
=@@+
终止密码子&阴影
+G)
端信号肽
图
!
!
蝴蝶兰几丁质酶基因核苷酸序列和推测的氨基酸序列
@=A+QV4XV9:L:0
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=@@+QV:
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9:L:0
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QM4L:^ +G)VBX3.045/.
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045
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图
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蝴蝶兰几丁质酶基因预测蛋白的结构域分析
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北
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植
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物
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学
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报
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卷
图
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蝴蝶兰几丁质酶基因的系统进化分析
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+
化树!包括小麦的
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#
和
(
(陆地棉的
?54//
#
和
"
(草莓的
?54//
%
(拟南芥的
?54//
&
和
)
(美洲
油棕的
?54//
&
(小荨麻的
?54//

(甘蔗的
?54//
"
(水稻的
?54//
#
和
(
(烟草的
?54//
)
和可可的
?54//
%
结果表明!各类几丁质酶蛋白差异明显!
#1
个物种的几丁质酶蛋白被分为
!
大分支!
?54//
(
和
)
为一大分支!属于
#(
家族几丁质酶!
?54//
#
(
%
(

(

和
"
为另一大分支!属于
#1
家族几丁
质酶!此大分支又分为
!
个亚组!
?54//
#
(
%
(

(

为一亚组!蝴蝶兰几丁质酶与拟南芥(海枣(油棕(谷
子的几丁质酶类似蛋白和陆地棉(甘蔗的
?54//
"
为第二亚组!其中蝴蝶兰几丁质酶蛋白在第二亚组
中!与海枣(油棕(谷子和甘蔗等单子叶植物的关系
最近"图
&
#
<+=
!
蝴蝶兰几丁质酶基因的表达模式
以
901-)
和
5A#
!
两种内参基因对其转录表达
进行分析结果表明!该基因在各种组织中均有表
达!其中在根中表达量最高!萼片和唇瓣中次之!在
蕊柱中表达量最低!说明在形态建成中主要促进根
的发育&以
901-)
和
5A#
!
两种内参基因作为标准!
!"#$%
基因的表达分析结果基本一致"图
*
#为
了分析几丁质酶基因与不同低温胁迫的关系!分析
了
#%K
%
(K
低温驯化温度和
&K
冷胁迫条件下该
基因表达水平结果显示!在
#%K
%
(K
昼夜温度
培养
%
(
$
(
1
和
#*L
时!该基因表达随着低温处理时
间的延长逐渐降低!恢复正常温度培养
#
和
%L
时!
该基因表达量没有回升"图
$
!
@
#!此时观察到植株
图
*
!
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在不同组织中的表达
c.
R
+*
!
=MBB8
H
XB//.:05B[B5:W!"#$%.0L.WWBXB0V:X
R
40/
通过低温驯化后能恢复正常生长!没有冻伤现象
而在
&K
低温胁迫下!该基因表达与前者不同!在冷
胁迫
#
(
!
和
&M
时!几丁质酶基因的表达量均比处
理前高!呈逐渐升高的趋势!在处理
&M
时表达量达
到最高!随后其表达量下降!在
(M
表达量最低!
#!
(
!&
和
&(M
维持在处理前的表达水平分析认为!
低温驯化
%
(
$
(
1
和
#*L
时!
!"#$%
表达被抑制!当
恢复正常温度培养时其表达在短期内没有恢复&
!"#$%
对短期的
&K
低温胁迫能够及时做出响
应!但是随着冷胁迫时间的延长!其表达又回到原来
的表达水平"图
$
!
C
#&在两种低温处理条件下!以
901-)
和
5A#
!
两种内参基因作为标准的表达水平
分析也具有相似的结果
*&!
!
期
!!!!!!!!!!!!
袁秀云!等$蝴蝶兰几丁质酶基因的克隆及表达特性分析
图
$
!
蝴蝶兰
!"#$%
基因在不同低温条件下的表达
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XB//.:05B[B5:W!"#$%70LBX
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+
,-,
%
!
讨
!
论
本研究从蝴蝶兰叶片中克隆到
#
个几丁质酶基
因!其生物信息学分析表明!该基因属于
#1
家族几
丁质酶基因!包含一个催化区!在
G)
端有一个信号
肽!具有跨膜结构!属于胞外分泌蛋白系统进化分
析显示该基因编码的蛋白与几丁质酶类似蛋白关系
最近!在进化树上与
?54//
"
几丁质酶在同一分支
上&表达特性分析结果表明!该基因在蝴蝶兰的营养
器官和生殖器官中均有表达!但表达水平有差异&低
温驯化温度抑制其表达!能够响应短期的冷胁迫
植物中各类几丁质酶的基因序列(亚细胞定位
及酶活性存在较大差异
?54//
#
几丁质酶包含
G)
端信号区(几丁质结合区和催化区
%
个功能结构域!
有的
?54//
#
几丁质酶在
?
端还有一个液泡定位
区)!1*!
?54//
%
几丁质酶有信号肽和催化区)%")%#*!
?54//
(
几丁质酶与
?54//
#
和
?54//
%
没有同源
性)%!*!
?54//
&
与
?54//
#
的结构域相似!但催化区
较短)%%)%&*!
?54//
)
几丁质酶在氨基酸结构上与
?54//
#
相似!但其序列与小荨麻凝结素蛋白前体
序列相似性高!在
G)
端有
!
个凝结素保守域)%*)%$*!
?54//

与前
*
类无相似性!有信号肽! 个几丁质
结合位点和催化区!与某些细菌的几丁质酶具有较
高的相似性)%,*!
?54//
"
几丁质酶
G)
端有信号区和
催化区!不含几丁质结合位点!其催化区不含
#1
家
族几丁质酶特异的序列标签)%(*还有一些几丁质
酶类似蛋白!其序列与
#(
和
#1
家族几丁质酶蛋白
同源!但不包含几丁质结合或者催化活性)!"*!具有
几丁质酶相似的抗病原体活性)!#)!!*拟南芥一个几
丁质酶类似蛋白"
@V?=\#
#!具有一个
#1
家族几丁
质酶的结构域!在
G)
端有一个信号肽!属于分泌途
径的蛋白!定位于细胞壁!其在种子(茎和花中均有
表达!在成熟叶片和根中表达较低!该基因不被机械
损伤(水杨酸和乙烯等处理诱导!其转录水平在机械
损伤和乙烯处理
!&M
时明显降低)%1*!推测拟南芥
91#%B#
基因不是胁迫诱导型几丁质酶在拟南芥
中该蛋白的突变引起了根中木质素的异源沉淀(细
胞形状的改变和过剩乙烯的产生)%1*进一步研究
发现该蛋白在根系发育中起重要作用!能够响应土
壤环境的变化影响根系的结构)!%!&"*在棉花中有
!
个几丁质酶类似蛋白与拟南芥
@V?]\#
有较高的
一致性!它们在细胞壁的纤维素合成中发挥重要作
用)&#*本研究的蝴蝶兰几丁质酶基因编码的蛋白
与
@V?]\#
有较高的同源性!二者具有相似的功能
结构域!如具有
G)
端有信号肽!有
#1
家族几丁质酶
的结构域!但没有几丁质酶特异的序列标签!在系统
进化树上与
?54//
"
属于同一分支!由此判断!该研
究中的几丁质酶类似蛋白可能属于
?54//
"
几丁质
酶本研究中蝴蝶兰几丁质酶基因与拟南芥的
@V?]\#
具有相似的组织表达特性!均在营养器官
和生殖器官中表达!由此推测!蝴蝶兰几丁质酶基因
与拟南芥的
@V?]\#
有相似的功能
在热带和亚热带物种中!番荔枝"
9))*)&0"(4=
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#的果皮中具有
!
个抗真菌和低温适应的几丁
质酶!体外研究表明该蛋白不具有抗冻活性)&!*甘
蔗的
?54//
#
和
"
几丁质酶在
&K
处理
#!
和
!&M
时两种几丁质酶均表现持续升高的转录表达)#1*!而
本研究蝴蝶兰几丁质酶基因只在
&K
处理
&M
时表
达达到高峰!
&K
处理
(M
以后其表达下降到处理
前的水平!分析原因可能与几丁质酶的种类和物种
差异有关蝴蝶兰作为热带和亚热带物种!适宜的
生长需要温湿的环境!低温会抑制其生长和发育!目
前蝴蝶兰低温胁迫下的响应机制还不明确!研究报
道也较少最近的研究表明!蝴蝶兰在驯化低温条
件下有一个几丁质酶肽段上调表达)&%*!本研究的几
丁质酶编码的蛋白不包含该肽段!说明二者不是一
个蛋白!同时也表明蝴蝶兰另有驯化低温诱导类型
的几丁质酶!这些基因在蝴蝶兰的生物胁迫和非生
物胁迫中如何调控生理代谢. 其作用底物是什么.
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卷
这些研究结果将有助于蝴蝶兰新种质品种的改良
因此有关蝴蝶兰几丁质酶基因的种类(酶活性及与
低温胁迫的关系待于进一步研究
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