全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
#"""("!)
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*-../*#"""("!)*!"#$*"!*"!%#
收稿日期$
!"#)(#"(!0
&修改稿收到日期$
!"#$("#("$
基金项目$中医药行业科研专项"
!"#!"+""!
#&中医药公共卫生专项"财社
!"##
(
+$
号#
作者简介$张
!
婷"
#101&
#!在读硕士研究生!主要从事花发育基因研究)
2(34-5
$
6
789:;
!
#$%*<=3
"
通信作者$刘虎岐!博士!副教授!硕士生导师!主要从事植物发育生物学及分子生物学的研究)
2(34-5
$
5-7>7
?
-
!
/@.74A*8B7*小花草玉梅正常和自然变异植株
的
!1$%$
基因研究
张
!
婷!邢
!
妮!王
!
超!刘虎岐"
"西北农林科技大学 生命科学学院!陕西杨陵
+#!#""
#
摘
!
要$野生小花草玉梅"
!"#$%"#&()*+&,C49*
-
*%&#.$"%&#
#正常植株和花被片自然变异植株的外观形态差异很
大!该研究以二者为材料!利用常规
DEF
和高效热不对称
DEF
"
G-(H4-5DEF
#技术从其正常和变异植株的基因组
中各分离得到
#
个
I
类基因)序列分析证明!二者隶属于
I
类
JKLM(N=O
基因
KD%
家族的旁系同源基因
!/%(%
分枝!分别命名为
0!&!/%(%
"正常植株#和
1!&!/%(%
"变异植株#)
0!&!/%(%
基因全长
%+1)N
P
!
1!&!/%(%
基
因全长
%010N
P
!二者均含有
#
个
$$$N
P
的开放阅读框"
QFR
#!可编码
!!#
个氨基酸!具有典型的植物
JKLM(N=O
基因结构!其编码肽链包含了
JKLM
区*
S
区*
"
区和
E
区)对比
0!&!/%.%
和
1!&!/%(%
基因的全长序列!发现
1!&!/%.%
基因比
0!&!/%(%
多了
#
段
1N
P
的插入!且在
QFR
序列与
0!&!/%(%
基因相比有

个碱基突变)
对二者的全长序列*所编码的
!!#
个氨基酸及插入序列的生物信息学分析显示!二者在基因启动子*蛋白质基本性
质*结构功能域*二级三级预测结构等方面均有差异!推测这些差异可能是花被片变异产生的原因之一)该研究结
果为进一步探索其变异机制奠定了基础)
关键词$小花草玉梅&花被片变异&
G-(H4-5DEF
&
JKLM(N=O
基因&
0!&!/%.%
和
1!&!/%(%
基因
中图分类号$
T+)
文献标志码$
K
&"(#(
)
*(!+,
-
.,(/,0(*
1
2#2"3!1$%$4,(,#(5"67*8*(9*(!
5*9.6*:*6#*(936"7!/)2&/)(-34*$(-5;*6<
6
*&()+2-/&()
UGKVWH-/
X
!
YZVWV-
!
[KVWE>4=
!
\Z]G7
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-
"
"
E=58
X
8=A\-A8M<-8/<8
!
V=9;>@8.;K^R]/-C89.-;
6
!
_4/
X
5-/
X
!
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!
E>-/4
#
0=296*/9
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H>8.;7B
6
;4`8./=9345
P
54/;4/B;8
P
45/4;7945C49-4/;@>-<>>4C8N-
X
B-AA898/<8.-/4
PP
8494/<84.
34;89-45.A9=3@-5B!"#$%"#&()*+&,C49*
-
*%&#.$"%&#*H>8<54..I
X
8/8.@898-.=54;8BA9=3
X
8/=38.=A
/=9345
P
54/;4/B/4;7945C49-4/;N
6
7.-/
X
<=/C8/;-=/454/BG-(H4-5DEF;8<>/-
?
78.*H>8
6
@898
P
9=C8B;=
N8!/%(%N94/<>=A
P
4945=
X
.@>-<>N85=/
X
;=KD%
X
8/8A43-5
6
A9=3I<54..JKLM(N=O
X
8/8.N
6
.8
?
78/<8
4/45
6
.-.4/B/438B0!&!/%(%
"
-//=9345
P
54/;
#
4/B1!&!/%(%
"
-//4;7945C49-4/;
#!
98.
P
8<;-C85
6
*H>8A75
58/
X
;>=A0!&!/%(%
X
8/8@4.%+1)N
P
@>8984.%010N
P
-/1!&!/%(%
!
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6
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P
=
P
8/
984B-/
X
A9438
"
QFR
#
4/B<4/8/<=B8!!#43-/=4<-B.*H>8
P
9=;8-/.>=@8B4;
6P
-<45JKLM(N=O
X
8/8.;97<(
;798<=/;4-/-/
X
JKLMB=34-/
!
SB=34-/
!
"
98
X
-=/4/BE;893-/7.*H>8<=3
P
49-.=/98.75;=AA7558/
X
;>
.8
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78/<8.N8;@88/0!&!/%(%4/B1!&!/%(%
X
8/8.@4.A=7/B;=>4C841N
P
-/.89;-=/-/1!&!/%(%
X
8/8
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4/B;>89849845.=N4.837;4;-=/.-/QFR.8
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X
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6
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A=934;-<.4/45
6
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X
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78/<8
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P
8<;.=A
X
8/8
P
9=3=;89
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P
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P
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P
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34-/
!
4BC4/<8B
P
98B-<;-=/.;97<;7984/B.==/*H>8.8B-AA898/<8.34
6
N8=/8=A;>8<47.8.=A;8
P
45.C49-4(
;-=/
!
4/B;>-..;7B
6
54
6
.;>8A=7/B4;-=/A=9;>8A79;>898O
P
5=94;-=/=A-;.C49-4;-=/38<>4/-.3*
>,
1
?"6!2
$
!"#$%"#&()*+&,C49*
-
*%&#.$"%&#
&
;8
P
45.C49-4;-=/
&
G-(H4-5DEF
&
JKLM(N=O
X
8/8
&
0!&!/%(
%4/B1!&!/%(%
X
8/8.
!!
花是被子植物独有的非常重要的观赏及生殖器
官)植物花发育可分为成花诱导*花的发端*花器官
发育及花型发育

个阶段!分别由花序分生组织特
性基因*花分生组织特征基因#(!(*同源异型基因%(
和背腹特性基因调控其表达)花器官发育的
KIE(
L2

(0
(模型及,四因子1(##(-模型可以很好地解释其
形成过程中各同源异型基因的互作),
KIEL2

(0
(
-
模型是以核心真双子叶模式植物为基础逐步确立
的!其花在形态上具有典型的萼片*花瓣*雄蕊和雌
蕊四轮结构&而核心真双子叶植物的花器官发育模
型在基部真双子叶植物中并不是严格保守的#!(#%(!
基部真双子叶植物中
I
功能基因的表达区域可能
扩展到外层导致花瓣状器官的分化!使外轮器官与
内层花瓣在形态上具有一致性)
KIEL2
基因中绝
大多数都属于
JKLM(N=O
基因#(#)(!所以
I
类
JKLM(N=O
基因在整个花器官发育过程中起着十
分关键的作用)被子植物
I
类基因包含
!/%
和
/2
两个进化系!它们是由一个共同祖先基因复制而来
的水平同源基因!编码的蛋白质之间可形成异二聚
体!是多种植物花瓣和雄蕊发育所必需的!且经微阵
列技术研究表明!
KD%
%
DZ
直接调节花瓣和雄蕊细
胞形成过程中基因的表达)
KD%
家族包括
!/%.#
*
!/%.!
和
!/%(%
等
%
个进化枝)目前关于
!/%(%
基因的研究较少且主要集中在毛茛科中)有研究表
明!
!/%(%
基因通常只在花瓣中特异性表达且表达
水平一般很高#$(#+(!在耧斗菜#+(和黑种草#+(中沉
默
!/%(%
基因!仅造成其花瓣向萼片的同源异型转
变而其他花器官大部分保持不变!这说明了
!/%(%
基因在控制花瓣形成过程中的关键作用)所以!
!/%(%
基因被称为花瓣身份特征基因!在植物花器
官变化的研究中具有重要的价值和意义)
小花草玉梅"
!"#$%"#&()*+&,C49*
-
*%&#.$.
"%&#
#属毛茛科银莲花属!是基部真双子叶植物!多
年生草本!其正常花的花部集成二歧聚伞花序!花被
无分化!由
)
"
#
0
#枚花被片组成!雄*雌蕊多数#0()
基部真双子叶植物中
I
功能基因表达区域的外延
现象在小花草玉梅花器官发育中有一定体现!它的
花被无分化!花被片花瓣化!白色!行使花瓣的功能!
这种在进化过程中形成的极似花瓣的花被片很可能
也受花瓣特性基因
!/%(%
的影响)另
S94389
研
究#1(!"(表明!该基因在毛茛科的多数类群中只决定
花瓣的形成!但在银莲花族中对花瓣和雄蕊的形成
都具有一定的功能)所以!小花草玉梅花被片和雄
蕊的形态变化都可能与
!/%(%
基因的改变相关)
本研究中花被片自然变异植株除花被片有很大变化
外!雄蕊也有一定改变!因此选择
!/%(%
基因作为
该物种变异植株研究的目标基因)本研究利用常规
DEF
和
G-(H4-5DEF
方法!从小花草玉梅正常和花
被片自然变异植株中分别克隆得到了
0!&!/%(%
和
1!&!/%(%
基因!并运用生物信息学对其序列特
征及预测蛋白进行了综合对比分析!以期探索该变
异植株中花被片变异产生的可能原因!为进一步探
究其变异机制奠定基础)
#
!
材料和方法
@*@
!
材
!
料
!"#
#
!"#)
年
$
#
+
月间采集于陕西陇县关山
地区的小花草玉梅正常和花被片自然变异植株的花
及苞叶!立即冻存于液氮中备用)该花被片自然变
异植株命名为绿白相间花变异植株"图
#
!
I
#)
菌株
345%*H=
P
#"
"
H-4/
X
8/
#*克隆载体
DJ(
L51(H
"
H4S4F4
#*
DEFD983-O
"
H4`4942O6+
7
HJ
*
E[2.6+
7
和
H-4/
X
8/!a6+
7
#*
LVK
提取试剂盒
"
H-4/
X
8/
#和胶回收试剂盒"
H-4/
X
8/
#等分别购自相
关试剂公司&引物合成在上海生工生物工程公司)
@*A
!
方
!
法
@*A*@
!
小花草玉梅正常植株和绿白相间花变异植
株的花部形态学对比
!
以正常和变异植株的花器官
标本为材料!将其置于培养皿中的湿润滤纸上!再覆
盖
#
层湿润滤纸!后将培养皿封口!静置
%>
后进行
花器官各部分分解)分解得到的花被片*雄蕊及雌
蕊在尼康体式显微镜下观察!保存结果)
@!
小花草玉梅
7!(!1$+$
和
8!(!1$%$
基因
中间序列的扩增
!
按照天根
LVK
提取试剂盒说明
书提取小花草玉梅正常植株和绿白相间花变异植株
的基因组
LVK
)然后根据此类基因的保守区域设
计引物进行普通
DEF
扩增!以期获得本材料上此类
基因的保守序列)普通
DEF
扩增引物为
R
"
)b(KH(
WWWHKWKWWKKKWKHHWKWK(%b
#和
F
"
)b(EE(
KHHHWKEKHKWEEKHHKHKWKH(%b
#)反应体
系为$预混酶
#"
$
!
R
*
F
引物各
#
$
!模板
LVK#
$
!加灭菌去离子水至总体积
!"
$
)扩增条件为$
!%!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
1c
预变性
)3-/
&
1c
变性
%".
!
)*)c
退火
%"
.
!
+!c
延伸
1".
!
%)
个循环&
+!c
延伸
#"3-/
)
DEF
产物以
#d
琼脂糖凝胶电泳回收后连接到
P
JL#1(H
载体上!
!c
热激转化大肠杆菌
HQD#"
感受态细胞!经
K3
P
抗性筛选和
Y(
X
45
%
ZDHW
蓝白
斑筛选后选取白色菌落进行液体培养)
DEF
反应
检测阳性克隆!送上海英骏生物技术公司进行测序)
@!
7!(!1$+$
和
8!(!1$%$
基因全长序列的
获得
!
根据上面扩增产物得到的测序结果"保守序
列#设计巢式引物进行
G-(H4-5DEF
反应)
G-(H4-5
DEF
扩增引物分简并引物!#(和特异性引物"表
#
#)
本研究直接使用简并引物
\KL#(#
#
\KL#(
与设计
的特异性引物进行组合扩增!筛选出在小花草玉梅扩
增效果较为理想的随机引物)分别以小花草玉梅正
常植株和绿白相间花变异植株的基因组
LVK
为模板
进行
G-(H4-5DEF
扩增!反应体系和反应条件参考文
献
!#
(!
#d
琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果)
将
G-(H4-5DEF
的第三轮产物进行胶回收!经
连接*转化*筛选和鉴定后送公司测序)测序结果利
用
D9-389D983-89)*"
*
J8
X
45-
X
/
等软件进行分析!
在已知序列的
)b
端方向上选取
%b
端与已知片段具
有完全相同重叠区域的候选片段进行拼接!而在已
知序列的
%b
端方向上选取
)b
端与已知片段具有完
全相同重叠区域的候选片段进行拼接!并根据所获
得的核苷酸序列继续向前步移!直到获得完整的基
因序列为止)本实验经
%
次步移获得了已知序列的
)b
端侧翼序列!经
!
次步移获得了已知序列的
%b
端
侧翼序列"表
#
#!从而得到了基因全长)
小花草玉梅正常植株
0!&!/%(%
基因和绿白
相间花变异植株
1!&!/%(%
基因克隆时所用引物
基本相同!仅在获取
)b
端侧翼序列的第三次步移中
有所不同!前者使用
%FeMD%(#
!而后者使用
%Fe
MD%(!
&二者进行基因克隆时所用程序也基本相同)
@!
7!(!1$+$
和
8!(!1$%$
基因序列的生物
信息学分析
!
I54.;
搜索正常和花变异植株
!/%(%
类基因全长序列的同源基因!与本研究所得序列进
行多重比对!确定所得基因的
ELM
序列!运用
W8/8
M;97<;798L-.
P
54
6
M89C89!*"
对所得基因全长进行
基因结构分析)利用在线网站
G;;
P
$%%
@@@*8O(
P
4.
6
*<>
%
;==5.
%中的
H94/.54;8
程序将所得
ELM
序
列翻译成氨基酸序列!
I54.;
搜索其同源氨基酸序
列!用
LVKJKV0
*
J8
X
45-
X
/
软件进行氨基酸序列
的多重比对)使用
J2WK)*#
软件为该序列与其同
源基因在
LVK
和氨基酸水平上构建邻位相连法的系
表
@
!
C#%D*#8&E
扩增所用引物
H4N58#
!
D9-389.7.8B-/G-(H4-5DEF984<;-=/
引物名称
D9-389/438
引物编号
D9-389V=*
引物序列
D9-389.8
?
78/<8
"
)b
#
%b
#
简并引物
\KLD9-389.
\KL#(# KEWKHWWKEHEEKWKWEWWEEWEfVfVVVWWKK
\KL#(! KEWKHWWKEHEEKWKWEWWEEWEIVIVVVWWHH
\KL#(% KEWKHWWKEHEEKWKWEWWEEWEffVfVVVEEKK
\KL#( KEWKHWWKEHEEKWKWEWWEEWEILVIVVVEWWH
KE# KEWKHWWKEHEEKWKW
特异性引物
MDD9-38.
扩增
%b
端侧翼序列
K3
P
5-A-<4;-=/=A%b
A54/`-/
X
.8
?
78/<8.
第一次步移
H>8A-9.;.;8
P
#ReMD# WHWWHHEWHWKKEWWKKWWHWKKW
#ReMD! HEKEWWHHEHWEEHWKWWWKEKKH
#ReMD%(# EKHWWHWEWHWKKKHHWHKKWHKHWEEHE
第二次步移
H>8.8<=/B.;8
P
!ReMD# EHKHWKKWWWKKHEHHWKKHEHKHKKHWWE
!ReMD! WWHWWHWKWWKEHHEWHWWEHHKE
!ReMD%(# EEKKWWKKKKWKWKKKWWKKHWKKWHWWH
扩增
)b
端侧翼序列
K3
P
5-A-<4;-=/=A)b
A54/`-/
X
.8
?
78/<8.
第一次步移
H>8A-9.;.;8
P
#FeMD# EKHWHHKKHEHEEHHEHWHHWEHHEKWW
#FeMD! WWWKWHHEEKWKWKHHWKEWEEKW
#FeMD%(# KWWWHHWHKWKKHHEKEWHHWHWWKKWW
第二次步移
H>8.8<=/B.;8
P
!FeMD# WWKWEKEWKHHKWWWKKKWWEK
!FeMD! KHEHWHKKHWEEWWWWEEKWHWH
!FeMD%(! WEEHEEEWHWHWWHEHKHKKHEKWWHKKW
第三次步移
H>8;>-9B.;8
P
%FeMD# HWWEHHEKKHKKHKWEKKKHHWWKEW
%FeMD! WKWEKHEHHEKKWWEWKWEKHEW
%FeMD%(# EKHWWKEKHEKKHWWWKHEKHHKWWHHEE
%FeMD%(! EKKHWWWKHEKHHKWWHHEEKEKKHEKEKH
!!
V=;8
$
f
"
X
!
K
!
E
#!
I
"
X
!
H
!
E
#!
L
"
X
!
K
!
H
#!
V
"
K
!
H
!
X
!
E
#
*
%%!
!
期
!!!!!!!!!!!
张
!
婷!等$小花草玉梅正常和自然变异植株的
!/%(%
基因研究
统发育树!进行
I==;.;94
P
检测)选择
2YDKM_
网站
及程序进行以下分析$用
D9=;D4943
分析翻译蛋白的
基本性质&
D9=;M<458
对翻译的蛋白进行疏水性分析&
M-
X
/45ZD
对翻译的蛋白序列进行信号肽预测分析&
HJGJJ
对翻译的蛋白序列进行跨膜区分析&
V8;(
D>=.
对推导的氨基酸序列进行磷酸化位点预测&应
用
GVV
对所推导的氨基酸序列进行二级结构预测&
D>
6
98!M89C89
对翻译蛋白序列进行三级结构的初步
预测)此外!对本研究得到的
!
个基因全长进行了启
动子分析!所用的分析网站为
>;;
P
$%%
N-=-/A=934;-<.*
P
.N*7
X
8/;*N8
%
@8N;==5.
%
P
54/;<498
%
>;35
%)
!
!
结果与分析
A*@
!
小花草玉梅正常植株和绿白相间花变异植株
的花部形态学对比分析
正常和变异植株的花器官分解结果"图
#
#表
明!正常植株"图
#
!
K
#的花被片共
)
枚!一轮!形状
近椭圆!边缘光滑"图
#
!
W
#&雄蕊*雌蕊均正常"图
#
!
E
*
2
#)绿白相间花变异植株"图
#
!
I
#的花被片
共
%#
枚!轮数多轮!外部"图
#
!
G
#的
)
枚花被片颜
色完全变绿!中间"图
#
!
Z
*
g
#的
#!
枚花被片部分变
绿!内部"图
#
!
S
*
#的
#
枚花被片保持白色!这些
花被片的形态发生变化且由外向里逐渐接近雄蕊&
雄蕊数目减少!部分退化!图
#
!
L
中第二排雄蕊均
改变!方框所示的
%
枚雄蕊花药发育不全!其余

枚
花丝扁平&雌蕊"图
#
!
R
#无明显改变)
A!
小花草玉梅
7!(!1$+$
和
8!(!1$%$
基因的
克隆
据保守区域设计引物进行普通
DEF
扩增!获得
部分片段"图
!
!
K
*
W
#!测序分析表明该片段为本材
料上
!/%(%
类基因的部分序列)据所得序列设计
G-(H4-5DEF
反应特异性引物"表
#
#进行扩增!获得
了已知序列
)b
和
%b
端的侧翼序列!不断向前步移并
相互拼接得到基因全长!获得的基因全长经多次分
段单引物验证及不同引物系统重复验证为正确)
在获得基因全长的整个过程中每一次步移都要
进行随机引物的筛选!筛选结果及每一次步移的
H4-5(DEF
电泳分析"图
!
#结果可知$
I
*
E
为获得正
常植株
0!&!/%(%
基因
%b
端侧翼序列的
!
次步移!
筛选得 到的 最佳随机引 物分 别为
\KL#(
和
\KL#(%
!
L
*
2
*
R
为获得
0!&!/%(%
基因
)b
端侧翼
序列的
%
次步移!筛选得到的最佳随机引物分别为
\KL#(
*
\KL#(!
和
\KL#(!
&获得绿白相间花变异
植株
1!&!/%(%
基因全长的
G
*
Z
和
g
*
S
*
同理)
K*
正常花&
I*
变异花&
E*
正常花的雄蕊&
L*
变异花的雄蕊&
2*
正常花的雌蕊&
R*
变异花的雌蕊&
W*
正常花的花被片&
G
#
\*
变异花的变态花被片!排列顺序由外向里
图
#
!
小花草玉梅正常植株和绿白相间花变异植株的花器官及其各部分分解图
K*V=9345A5=@89
&
I*V4;7945C49-4/;
&
E*M;438/.=A/=9345A5=@89
&
L*M;438/.=A/4;7945C49-4/;
&
2*E49
P
85.=A/=9345A5=@89
&
R*E49
P
85.=A/4;7945C49-4/;
&
W*H8
P
45.=A/=9345A5=@89
&
G&\*H8
P
45.=A/4;7945C49-4/;4/B;>8=9B89-.A9=3;>8=7;.-B8
R-
X
*#
!
R5=@89.4/B;>8-9
P
49;-45B8<=3
P
=.-;-=/<>49;.=A/=9345
P
54/;
4/B/4;7945C49-4/;A9=3!4&()*+&,C49*
-
*%&#.$"%&#
%!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
H4-5(DEF
扩增包括
%
轮超级
DEF
反应!
I
中
!
和
%
分别为第一*二轮
DEF
的产物!

*
)
*
$
分别为不同
的第三轮引物下该轮
DEF
的产物&
L
中
#"
和
##
分
别为第一*二轮
DEF
的产物!
#!
和
#%
分别为不同
的第三轮引物下该轮
DEF
的产物&
S
中
%"
为第二
轮
DEF
的产物!
%#
为第三轮
DEF
的产物&其余的
E
*
2
*
R
*
G
*
Z
*
g
和
中的第
#
孔均为第二轮超级
DEF
反应的产物!而第
!
*
%
孔均为第三轮超级
DEF
反应的产物且第
!
*
%
孔的引物均不同&图中所示的
第三轮产物中除箭头标注条带最终成为拼接基因全
长序列所用的片段外!其他条带的测序结果均可验
证其相应箭头所标注目的带序列的正确性!以确保
能得到较为准确的实验结果)
获得基因全长的
I54.;
比对结果表明!两基因分
别与不同植物的
!/%(%
基因有较高一致性!因此分
别命名为
0!&!/%(%
基因"正常植株#和
1!&!/%(%
基因"绿白相间花变异植株#)
A<$
!
7!(!1$+$
和
8!(!1$%$
基因的结构特征
0!&!/%(%
基因全长
%+1)N
P
!含有长度为
##00N
P
"
#%
#
!)%#
#的开放阅读框!
ELM
编码序
列为
$$$N
P
!编码
!!#
个氨基酸!
W8/I4/`
登录号
为
S]!%")
&
1!&!/%(%
基因全长
%010N
P
!含有
长度为
##00N
P
"
#%1$
#
!)0%
#的开放阅读框!
ELM
编码序列为
$$$N
P
!编码
!!#
个氨基酸!
W8/I4/`
登录号为
S]!%"$
)
对所得基因全长进行基因结构分析!结果"图
%
#表明!二者
)b
端侧翼序列分别为
#%%
和
#%1)
N
P
!开放阅读框均包含
+
个外显子和
$
个内含子!外
显子所含碱基数依次为
#00
*
$+
*
$!
*
#"%
*
!
*
)
和
#)1
!且与其他植物的
!/%(%
基因相比!前
$
个外显
子非常保守!所含碱基数基本不变!仅第
+
个外显子
有较大变动!
+
号外显子构成
E
结构域!保守性差)
此外!它们在第
#
个外显子上均含有一段
#!"N
P
左
右
LVK
结合位点"图
%
中方框所示#)
A!
7!(!1$+$
和
8!(!1$%$
基因系统进化分析
由
!/%(%
类基因氨基酸序列的多重比对可以看
出!
0!&!/%.%
和
1!&!/%(%
具有
JKLM(N=O
基因
家族
I
类亚家族中
!/%
基因的典型特征!
#0"N
P
左
右高度保守的
JKLM
结构域!中度保守的
S
区"植物
转录因子的特征结构#!保守性差的
Z
区*
E
端结构域!
以及
DZ
衍生结构域和
D458=KD%
结构域"图

#)比对
#0
个
!/%(%
类同源基因
LVK
全长和氨基酸序列!结
果表明!在
LVK
水平上!
0!&!/%.%
和
1!&!/%(%
基因与大叶铁线莲*长瓣铁线莲的
!/%(%
基因相似
K
#
R*
获得
0!&!/%(%
基因全长的
DEF
扩增结果&
W
#
\*
获得
1!&!/%(%
基因全长的
DEF
扩增结果&箭头所示条带最终成为拼接基因全长序列所用的片段&
J*L\!"""
图
!
!
获得
0!&!/%.%
和
1!&!/%(%
基因全长的
DEF
扩增电泳检测
K&R*H>843
P
5-A-<4;-=/98.75;.A=9A75(58/
X
;>.8
?
78/<8=A0!&!/%(%
X
8/8
&
W&\*H>843
P
5-A-<4;-=/98.75;.A=9A75(58/
X
;>.8
?
78/<8=A1!&!/%(%
X
8/8
&
I4/B.@-;>
499=@..>=@8C8/;745
6
N8<=38A94
X
38/;.7.8BA=9.
P
5-<-/
X
;>8A75(58/
X
;>
X
8/8
&
J*L\!"""
R-
X
*!
!
258<;9=
P
>=98.-.B8;8<;-=/A-
X
798=ADEF43
P
5-A-<4;-=/A=9A75(58/
X
;>
.8
?
78/<8.=A0!&!/%(%4/B1!&!/%(%
X
8/8.
)%!
!
期
!!!!!!!!!!!
张
!
婷!等$小花草玉梅正常和自然变异植株的
!/%(%
基因研究
方框所示区域为
LVK
结合位点
图
%
!
0!&!/%(%
"
K
#和
1!&!/%(%
"
I
#基因结构分析图
I=O8.-/A-
X
79898
P
98.8/;LVKN-/B-/
X
.-;8.
R-
X
*%
!
W8/8.;97<;7984/45
6
.-.
P
-<;798=A0!&!/%(%
"
K
#
4/B1!&!/%(%
"
I
#
X
8/8
VK9KD%(%
"
S]!%")
#
*
小花草玉梅正常植株&
fK9KD%(%
"
S]!%"$
#
*
小花草玉梅变异植株&
E>KD%(%
"
KWG%11#0*#
#*
E>KD%(!
"
KWG%11#+*#
#
*
大叶铁线莲&
E3KD%(%
"
KWG%11!#*#
#*
E3KD%(!
"
KWG%11!"*#
#
*
长瓣铁线莲&
KCKD%(%
"
KWG%11%$*#
#*
KCKD%(!
"
KWG%11%)*#
#
*
黄三七&
VBKD%(%
"
KWG%11%#*#
#
*
黑种草&
29KD%(%
"
KWG%11!*#
#*
29KD%(!N
"
KWG%11!%*#
#
*
拟扁果草&
Z3KD%(%
"
KWG%11!+*#
#*
Z3KD%(!N
"
KWG%11!$*#
#
*
东北扁果草&
\AKD%(%
"
KWG%11%"*#
#*
\AKD%(!
"
KWG%11!1*#
#
*
蓝堇草&
I"
SE+"#%1#*#
#*
I"
KWG%11#)*#
#
*
铁破锣&
DNDHL
"
KKE#%$1)*!
#
*
香脂杨亚种
图

!
VK9KD%(%
*
fK9KD%(%
推导的氨基酸序列与其同源蛋白序列比对
VK9KD%(%
"
S]!%")
#
*V=9345
P
54/;=A!4&()*+&,C49*
-
*%&#.$"%&#
&
fK9KD%(%
"
S]!%"$
#
*V4;7945C49-4/;
=A!4&()*+&,C49*
-
*%&#.$"%&#
&
E>KD%(%
"
KWG%11#0*#
#!
E>KD%(!
"
KWG%11#+*#
#
*8*#$+9,:#&+5*#
-
%*+
&
E3KD%(%
"
KWG%11!#*#
#!
E3KD%(!
"
KWG%11!"*#
#
*8*#$+9,$+5&%
;
#9+*+
&
KCKD%(%
"
KWG%11%$*#
#!
KCKD%(!
"
KWG%11%)*#
#
*!59+#+(+
<
"+9+
&
VBKD%(%
"
KWG%11%#*#
#
*0
<
#**+=+$+,5#"+
&
29KD%(%
"
KWG%11!*#
#!
29KD%(!N
"
KWG%11!%*#
#
*3"#$%"&+==#+")$
&
Z3KD%(%
"
KWG%11!+*#
#!
Z3KD%(!N
"
KWG%11!$*#
#
*2,%
;>
&)$
$+",:)&5)$
&
\AKD%(%
"
KWG%11%"*#
#!
\AKD%(!
"
KWG%11!1*#
#
*?#
;
9%
;>
&)$
-
)$+&%=#,
&
I"
SE+"#%1#*#
#!
I"
KWG%11#)*#
#
*@##,+5+*9:
-
%*+
&
DNDHL
"
KKE#%$1)*!
#
*/%
;
)*),A+*,+$
-
#&+.7N.
P
*
R-
X
*
!
H>8B8B7<8B43-/=4<-B.8
?
78/<8.=AVK9KD%(%4/BfK9KD%(%<=3
P
498B@-;>;>8-9>=3=5=
X
=7.
P
9=;8-/.
$%!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
性最高!均为
++d
!与其他毛茛科植物
!/%(%
基因的
平均相似性分别为
+#d
和
+"*)d
&在氨基酸水平上!
VK9KD%(%
和
fK9KD%(%
与大叶铁线莲的相似性仍
最高!分别为
+)d
和
+d
!与长瓣铁线莲的相似性均
为
+#d
!而与其他毛茛科植物
KD%(%
蛋白的平均相
似性分别为
$$d
和
$*0d
)据
LVK
全长和氨基酸
多序列比对构建系统进化树!从图
)
!
K
可以看出!
0!&!/%.%
和
1!&!/%(%
聚在一起!同时也和大叶
铁线莲
8:!/%(%
*长瓣铁线莲
8$!/%(%
聚在一起
且置信度很高!这与相似性结果一致!也与氨基酸序
列比对进化树"图
)
!
I
#所反映出的基因进化关系基
本一致)因此!
VK9KD%(%
和
fK9KD%(%
蛋白均属
于
D458=KD%
系!
0!&!/%.%
和
1!&!/%(%
基因均
属于
KD%
亚家族中的
!/%(%
基因)
A!
7!(!1$+$
和
8!(!1$%$
基因的启动子分析
对
0!&!/%.%
和
1!&!/%(%
基因的
)b
端侧翼
序列进行启动子分析!可知这
!
个序列除含有启动
子基本元件!如
HKHK(IQY
*
EKKH(IQY
外!还含
有
KIK
响应元件*真菌诱导应答元件*缺氧诱导型
增强子样元件!以及参与生理周期调控*
J_IGC#
结合位点*干旱诱导中的
J_I
结合位点和多种光
响应元 件等 一些其 他的 调控序 列!初 步 推 测
0!&!/%.%
和
1!&!/%(%
基因的表达受植物激素*
光照*生理周期和
J_IGC#
转录因子等的调控)
比较这
!
个基因的启动子分析结果!结合二者
的序列对比"图
$
#可知!
0!&!/%.%
和
1!&!/%(%
基因相比!后者在
!!1
#
!++
处有一段
1N
P
的完全
插入序列!与其起始密码子"
#%1$
#相距
##$0N
P
!由
标尺代表遗传距离!各节点处数字表示重复
#"""
次分析的
I==;.;94
P
值&图中加框为本研究克隆所得基因!其他基因名称同图

图
)
!
0!&!/%.%
*
1!&!/%(%
基因与其同源基因在
LVK
"
K
#和氨基酸"
I
#水平上的系统进化树分析
H>8.<458N4998
P
98.8/;.
X
8/8;-!
4/B;>8/73N89.=/;>8N94/<>8.-/B-<4;8;>8N==;.;94
P
C4578.A=9#"""
98
P
5-<4;84/45
6
.8.
&
E5=/8B
X
8/8.-/;>-..;7B
6
498N=O8B
!
4/B;>8/438.=A=;>89KD%(%>=3=5=
X
.<=998.
P
=/B;=;>=.8-/R-
X
*
R-
X
*)
!
D>
6
5=
X
8/8;-<;988.=ALVK
"
K
#
4/B43-/=4<-B.8
?
78/<8.
"
I
#
=A0!&!/%(%
!
1!&!/%(%4/B;>8-9>=3=5=
X
=7.
X
8/8.
+%!
!
期
!!!!!!!!!!!
张
!
婷!等$小花草玉梅正常和自然变异植株的
!/%(%
基因研究
K*1!&!/%.%
与
0!&!/%(%
基因启动子分析结果的差异片段&
I*
二者
)b
端侧翼序列对比结果的片段&
#*0!&!/%(%
基因&
!*1!&!/%(%
基因
图
$
!
0!&!/%.%
和
1!&!/%(%
基因
)b
端侧翼序列对比结果的片段及二者启动子分析的差别
K*L-AA898/;-45A94
X
38/;=A
P
9=3=;894/45
6
.-.98.75;N8;@88/1!&!/%(%4/B0!&!/%(%
X
8/8.
&
I*R94
X
38/;=A<=3
P
49-.=/98.75;N8;@88/)bA54/`-/
X
.8
?
78/<8.=A;>8;@=
X
8/8.
&
#*0!&!/%(%
X
8/8
&
!*1!&!/%(%
X
8/8
R-
X
*$
!
R94
X
38/;=A<=3
P
49-.=/98.75;N8;@88/;>8;@=)bA54/`-/
X
.8
?
78/<8.=A0!&!/%(%4/B
1!&!/%(%
X
8/8.4/B;>8B-AA898/<8=A
P
9=3=;894/45
6
.-.N8;@88/;>8;@=
X
8/8.
启动子分析结果可知!这段插入序列含有
+
个
EKKH
框)
EKKH
框是存在于启动子及加强区的普通顺式
作用原件!显然这
1N
P
插入序列所涵盖的
+
个
EKKH
框位于加强区中!可调控基因表达水平)
A!
7!(!1$+$
和
8!(!1$%$
基因的氨基酸序列
差异及其他相关性质分析
对比二者氨基酸序列知其有
!
个氨基酸的差
异!分别为第
%
位的
F
#
W
"即精氨酸
K9
X
变甘氨酸
W5
6
#和第
#+0
位的
_
#
L
"即酪氨酸
H
6
9
变天冬氨
酸
K.
P
#)这
!
个氨基酸的变化直接影响其形成蛋
白质的理化性质)
使用各种程序对二者所翻译蛋白质进行蛋白基
本性质和疏水性分析及跨膜区*信号肽和磷酸化位点
的预测分析)结果表明!二者所翻译蛋白均无信号肽
和跨膜区!非分泌蛋白和膜结构蛋白!蛋白质形成后
不分泌到胞外而留于细胞内在胞质或核内起作用!这
与
0!&!/%.%
和
1!&!/%(%
基因作为
JKLM(N=O
转
录因子基因家族成员!编码转录因子蛋白于细胞核内
结合
LVK
来发挥功能相一致)二者所翻译蛋白的磷
酸化位点无显著差别!均为
+
个
M89
位点!
0
个
H>9
位
点和
%
个
H
6
9
位点)然而!二者所翻译蛋白的基本性
质和疏水性有一定差别$
VK9KD%(%
蛋白分子式为
E
##!#
G
#0!
V
%!0
Q
%)
M
##
!分子量
!)*0SL
!预测等电点
为
1*0
"弱碱性蛋白#!负电荷残基总数
!1
个!正电
荷残基总数
%1
个!不稳定指数
)+*%
"可认为该蛋
白不稳定#&而
fK9KD%(%
蛋白分子式为
E
###!
G
#0##
V
%!)
Q
%$
M
##
!分子量
!)*$SL
!预测等电点为
1*%
"弱碱性蛋白#!负电荷残基总数
%"
个!正电荷残基
总数
%0
个!不稳定指数为
)1*+1
"可认为该蛋白不
稳定#&两蛋白的疏水性分析显示!
VK9KD%(%
蛋白
的总平均疏水指数为
&"*0"
!而
fK9KD%(%
蛋白
的总平均疏水指数为
&"*+1)
!以
"
为界!正值表示
图
+
!
VK9KD%(%
"
K
#和
fK9KD%(%
"
I
#蛋白三维结构预测
R-
X
*+
!
H>988(B-38/.-=/45.;97<;798
P
98B-<;-=/=A
VK9KD%(%
"
K
#
4/BfK9KD%(%
"
I
#
P
9=;8-/
疏水性!负值表示亲水性!疏水指数越大!蛋白疏水
性就越强!显然二者均为亲水性蛋白且前者亲水性
大于后者)
A!
50608$%$
和
:0608$%$
蛋白的二级结构及三
级结构预测
对
0!&!/%.%
和
1!&!/%(%
基因所推导的氨基
酸序列进行二级结构预测!结果有一定差异!即二者
的二级结构虽然都只有
%
螺旋"
45
P
>4>85-O
!
G>
#*延
伸链"
8O;8/B8B.;94/B
!
28
#和随机卷曲"
94/B=3<=-5
!
E<
#
%
种结构!但含量略有不同!前者
%
种结构成分的
含量分别为
)*%"d
*
#%*)+d
和
%!*#%d
!而后者则
分别为
)*+)d
*
#%*)+d
和
%#*$+d
)对
VK9KD%(%
和
fK9KD%(%
蛋白序列进行三级结构预测!其初步
的同源建模结果"图
+
#表明!二者所译蛋白的空间
结构明显不同!所以发挥功能的程度有一定差别)
%
!
讨
!
论
经观察!绿白相间花变异植株与正常植株相比!
花被片数目*轮数显著增多!形态由外向里逐渐接近
雄蕊!且颜色由白逐渐转绿&雄蕊退化!数目减少&雌
蕊基本不变)本研究用常规
DEF
和
G-(H4-5DEF
方
0%!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
法克隆得到了小花草玉梅正常和变异植株的
!/%(%
类基 因!分 别 命 名 为
0!&!/%.%
和
1!&!/%(%
)
LVK
全长和氨基酸序列的多重比对及系统发育树分
析表明!
0!&!/%.%
和
1!&!/%(%
均与不同植物的
!/%(%
基因有较高的相似性!都含有典型的
JZSE
结
构且在
E
末端有
DZ
基序和
D458=KD%
基序!故判断
0!&!/%.%
和
1!&!/%(%
为
JKLM(N=O
家族
!/%(%
基因的同源基因!与花器官发育相关#(#)()
1!&!/%.%
与
0!&!/%(%
基因的序列变化$
"
#
#
1!&!/%(%
基因在
)b
上游调控区"
!!1
#
!++
处#有一段
1N
P
的完全插入序列!包含
+
个
EKKH
框!位于启动子加强区)位于启动子加强区的插入
序列可能直接影响该基因的转录起始频率和强度!
调控基因的表达量和表达程度!从而使花器官的表
型发生变化)有研究表明!银莲花族铁线莲属内的
花瓣缺失机制可能是由调控区变异引起的!!(!耧斗
菜族扁果草属的花瓣缺失现象也是由
3"&+!/%(%
基因调控序列的缺失引起的#+(!说明毛茛科植物的
花瓣缺失现象与
!/%(%
基因的调控区有很大关系)
所以小花草玉梅变异植株的花器官变化也可能与
1!&!/%(%
基因的调控区序列改变相关!本研究结
果为此提供了一定证据)
另外!研究表明!在植物致病真菌中!目前所发
现的靶标基因上调均与启动子区的插入突变有关)
这些插入序列中仅有樱桃叶斑病菌和灰霉菌中的插
入序列被鉴定为反转座子!而其他植物病原真菌如
桃褐腐病菌"
$)N
P
插入#!苹果黑星病菌"
))%N
P
插
入#和柑橘绿霉病菌"
)
个
#!$N
P
的串联重复和
#
个
#11N
P
插入#中插入序列的功能属性并无相关信
息!调控机制未知!%()之后发现!某些柑橘绿霉病
菌菌株中
/=8B/)#@
基因启动子区
#11N
P
的序列
插入!本身能够作为一个强启动子来发挥功能!引起
/=8B/)#@
基因的超表?而赋予菌株抗药性!%(&
且
8B/)#
基因启动子区发生的
)
个
#!$N
P
串联重
复插入突变!同样可使
8B/)#
基因过表达而产生抗
药性!()此外!在苹果中!
2.
P
58
6
等发现!调控花青
素的转录因子基因
CB@#"
上游区域有
)
个
!%N
P
的正向重复插入!该插入序列能增强
CB@#"
基因
的表达!使花青素增加而产生果肉为红色的红苹
果!)()所以!同样地!小花草玉梅自然变异植株的
表型变化也可能是由于
1!&!/%(%
基因启动子区
的序列插入导致基因表达上调所致)
"
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的
ELM
序列与
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相
比有

个碱基突变位点)
1!&!/%(%
基因
ELM
序
列的碱基突变!造成其推导氨基酸及所译蛋白结构
性质的变化!可能在花器官中引起相应的表型变化)
1!&!/%(%
基因推导氨基酸序列的第
%
位和第
#+0
位发生了改变!第
%
个氨基酸位于
JKLM
结构域
中!该区域高度保守!具有与
LVK
结合*蛋白质二
聚体化及与其他蛋白质因子相结合的功能!$(!其变
化对所译蛋白质的功能有较大影响)本研究结果表
明$
VK9KD%(%
和
fK9KD%(%
蛋白无信号肽和跨膜
区!既不分泌到胞外也不成为膜结构成分!而作为转
录因子蛋白于细胞核内结合
LVK
来发挥功能&
VK9KD%(%
和
fK9KD%(%
蛋白的分子量*预测等电
点*所含正负电荷残基数目都不同!直接影响二者在
胞质和核内的运动及蛋白质的稳定性&不稳定指数
显示二者所译蛋白都为不稳定蛋白!且花变异植株
中
fK9KD%(%
蛋白更加不稳定&总平均疏水指数显
示
VK9KD%(%
和
fK9KD%(%
蛋白均为亲水性蛋白
且花变异植株中
fK9KD%(%
蛋白的亲水性较正常
株中低!说明二者的亲水*疏水性氨基酸含量和分布
都不同!直接影响其蛋白质的空间结构!二*三级结
构预测结果的差异性可证明这一点)显然!正常植
株
VK9KD%(%
和变异植株
fK9KD%(%
蛋白的理化
性质*稳定性与蛋白质结构明显不同!这可能影响蛋
白活性及其在细胞中的运动*与其他蛋白质因子的
结合*对
LVK
结合位点的识别及与
LVK
结合的亲
和性!进而影响蛋白质功能的发挥而造成花的表型
变化)
综上所述!小花草玉梅变异植株中花被片及雄蕊
的变化可能与
1!&!/%(%
基因的改变相关)
!/%(%
是控制花瓣形成的关键基因!小花草玉梅在进化过程
中形成的极似花瓣的花被片可能也受花瓣特性基因
!/%(%
的影响!且
S94389
研究#1(!"(表明!该基因在银
莲花族中影响花瓣和雄蕊的形成!这说明小花草玉梅
的变异植株中!花被片及雄蕊的变化可能均与
1!&!/%(%
基因有一定相关性)
1!&!/%(%
基因调控
区和编码序列的变化!可能造成其表达量上调及所翻
译蛋白的结构性质发生改变!使雄蕊退化减少!退化
的雄蕊可能转变成花被片使花被片轮数及数目增多)
银莲花族植物的花瓣形态与雄蕊相似而与其他毛茛
科植物的花瓣有所区别!!(!且本研究中!变异植株增
多的部分花被片形态极似雄蕊!均说明雄蕊变为花
被片是有可能的&此外!有文献表明!花被片的起源
可能晚于雄蕊和心皮!花瓣可能来源于萼片!也可能
来源于退化雄蕊0!#!+(!进一步说明雄蕊转变成花
被片是有较大可能的)这种初步形成的猜想还需进
1%!
!
期
!!!!!!!!!!!
张
!
婷!等$小花草玉梅正常和自然变异植株的
!/%(%
基因研究
一步的研究和验证!小花草玉梅材料新颖!变化多 样!拥有巨大的探索空间!值得继续探索和挖掘)
参考文献!

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