全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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$
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%
-
,.//0,#"""+$"!(,!"#$,"&,#"(
收稿日期$
!"#$+"!+!%
&修改稿收到日期$
!"#$+"$+%"
基金项目$国家自然科学基金"
%#!"#&#$
!
%#"#*
#&高等学校博士学科点专项科研基金"
!"#!%(#(#!"""*
#&福建省重大科技平台建设
"
!""*1!""#
#
作者简介$林丽霞"
#2*2)
#!女!在读硕士研究生!主要从事园艺植物生物技术研究
3+45.6
$
2"$&&$2*
!77
,894
"
通信作者$赖钟雄!男!博士!研究员!博士生导师!主要从事园艺植物生物技术与遗传资源研究
3+45.6
$
:5.;<"#
!
#&%,894
龙眼体胚发生过程生长素响应因子
1*!23$$
的克隆及表达分析
林丽霞!屈
!
莹!徐
!
洋!林玉玲!赖钟雄"
"福建农林大学 园艺植物生物工程研究所!福州
%("""!
#
摘
!
要$以龙眼松散型胚性愈伤组织为材料!采用
=>+?@=
和
=A@3
技术克隆获得生长素响应因子
!"#($8B1A
全长序列!利用实时荧光定量法检测其在龙眼体胚不同发育时期的转录水平!并将其与绿色荧光蛋白"
CD?
#构建
成亚细胞定位载体侵染洋葱表皮细胞结果表明$龙眼
!"#($
"命名为
%&!"#($
!
CE0F50G
登录号为
HD%2$"#
#
的
8B1A
序列全长为
%%!!I
J
!其中开放阅读框为
!*!2I
J
!
#!I
J
(K
非编码区!
(*I
J
%K
非编码区!编码
2$!
个氨
基酸生物信息学预测显示!
%&!"#($
编码蛋白具有
F%
(
AL<.0+ME/
J
和
ANO+PAA
保守区与结构功能域!中间区
域富含谷甘氨酸(丝氨酸和亮氨酸!是一个定位于细胞质的具有促进转录活性功能的水溶性蛋白系统进化树分
析表明!该基因编码的氨基酸序列与大豆的亲缘关系最近
7
=>+?@=
检测显示!
%&!"#($
在龙眼球形胚和鱼雷形
胚时期表达显著增强!而在
&
个发育阶段中子叶形胚的表达量最低!推测
%&!"#($
参与龙眼体胚中鱼雷胚时期的
形态建成共聚焦显微镜观察结果显示!未添加外源生长素
PAA
的
B6A=D(5
蛋白定位于细胞质中!而经外源生长
素处理的
B6A=D(5
蛋白在细胞膜(细胞质和细胞核中均有表达!推测龙眼生长素响应蛋白
B6A=D(5
能够响应外源
生长素
PAA
而改变其在细胞中的空间位置
关键词$龙眼&体细胞胚胎发生&生长素响应因子&生物信息学&实时荧光定量
?@=
&亚细胞定位
中图分类号$
Q*(
&
Q*2
文献标志码$
A
%&"#
(
)!*+
,
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1
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7"8)3#6*89-
1
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(
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5
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8
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!
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S
!
:P1RL6.0
S
!
:APTU90
S
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S
"
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S
M.8L6VLME50ZD9ME/VM
Y
N0.[EM/.V
Y
!
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S
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S
E0E054EZ%&!"#($
"
CE0F50G588E//.900L4IEM
$
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S
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J
V.906E[E69WVUE
S
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J
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Y
9
S
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Y
7
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J
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J
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J
M9VE.0
.090.90E
J
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J
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7
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J
890V5.0.0
S
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J
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"
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J
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Y
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J
M9I5I6
Y
5/96LI6E
J
M9VE.0
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Y
V9
J
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/
J
50ZANO+PAA890/EM[5V.[EZ./VM.8V50Z/VML8VLM56WL08V.90Z945.0
!
50Z5C60
!
E^M50Z:EL+M.8U4.ZZ6E
ME
S
.90
!
\U.8U\5/890/.ZEMEZ5/5058V.[5V.90Z945.0,?U
Y
69
S
E0EV.85056
Y
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J
M9VE.0E089ZEZI
Y
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S
E0EV.8ME65V.90/U.
J
\.VUA=D(.012+-../3/..,>UE
7
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B6A=D(5U5Z5ME45MG5I6EM./E.0VUEE<
J
ME//.906E[E6/5V
S
69IL65ME4IM
Y
950ZV9M
J
EZ9E4IM
Y
9/V5
S
E/
!
ILV
VUE05Z.M4=1AVM50/8M.
J
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S
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Y
6EZ905M
Y
/V5
S
E
"
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J
EZ9E4IM
Y
949M
J
U9
S
E0E/./ZLM.0
S
690
S
50/945V.8E4IM
Y
9+
S
E0E/./,>UE/LI8E6L65M69856.;5V.905//5
Y
//U9\EZVU5VVUEB6A=D(5
J
M9VE.0\5/6985VEZ.0VUE8
Y
V9
J
65/4
\.VU9LV5ZZ.0
S
VUEE<9
S
E09L/5L<.0PAAI
Y
890W98564.8M9/89
JY
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B6A=D(5
J
M9VE.0\5/6985VEZ.0
VUE8E6 4E4IM50E
!
8
Y
V9
J
65/450Z0L86EL/L0ZEM#,"4
S
%
:PAAVME5V4E0V
!
\.8U850IE/
J
E8L65VEZVU5V
B6A=D(5
J
M9VE.0\5/5I6EV98U50
S
E.V//
J
5V.566985V.90.0VUE8E6/.0ME/
J
90/EV9VUEE
1
>"-!/
$
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,
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0
$/:9LM,
&
/945V.8E4IM
Y
9
S
E0E/./
&
5L<.0ME/
J
90/EW58V9M
&
I.9.0W9M45V.8/
&
ME56+
V.4EME[EM/EVM50/8M.
J
V.90?@=
&
/LI8E6L65M69856.;5V.90
!!
龙眼"
%()*$+
,
-.&)/
0
$/:9LM,
#是无患子科
龙眼属的热带亚热带常绿木本果树!具有较高的经
济价值!其果实富含营养!是药食两用的珍贵补品!
而龙眼果实的产量和品质与其胚胎发育状况密切相
关)#*植物体胚发生体系是研究龙眼这类植物胚胎
发育的良好替代系统)!*众多研究发现激素的调节
是影响体胚发生和发育的最重要因素!其中生长素
可用于启动细胞分裂和胚性潜力的诱导!促进体胚
的早期发育)%*在龙眼体胚的诱导和分化中!其胚
性的启动伴随着高水平
PAA
的存在!生长素
!
!
$+B
是控制龙眼体胚发生的关键因素)$*因此!在龙眼
体细胞胚胎发生过程中!开展有关生长素信号转导
途径中相关基因的研究具有重要意义
生长素响应因子基因"
$-4/+3.
,
)/.3
5
$*2)+
!
!"#
#是一类能与生长素响应元件 "
AL<=3/
#
>C>@>@
特异结合并调控生长素响应基因表达的
转录因子)(*目前!已从拟南芥)&*(水稻)(!*(高
粱)**(玉米)2*和番茄)#"*等植物中分别获得
!%
(
!(
(
!&
(
%(
和
#
个
!"#
基因家族成员!且在部分植物
初步鉴定了不同
!"#
基因成员的功能茶树中!
生长素响应基因
1.!"##
与茶树越冬芽的休眠维
持及解除密切相关)##*芒果中!生长素响应基因
6!"#!
在不定根和根原基的启动与发育过程中
起作用)#!*棉花中!生长素响应因子
!"#%
影响棉
花纤维发育的作用机制)#%*番茄中!
7&!"#$
基因
对番茄果实细胞壁建成起关键性作用!能够增加番
茄果实重量)#$*
A=D
家族在生长素介导的发育过
程中起着重要的作用!包括胚胎发生(营养器官发
育(维管束形成(花和果实发育等)#(*对于生长素
响应因子
!"#(
基因的功能研究开始于拟南芥!在
其"
(
,
#%
$+
5
(
突变体中胚轴的形成和维管组织的
发育受到影响)#&*&在杨树中"
68
%
!"#(
#对于次生
木质部的发育也起到关键的作用)#*!说明生长素响
应因子
!"#(
基因在植物胚胎发育和维管组织的
形成中扮演着重要角色龙眼体胚系统作为木本植
物体胚发生的模式系统之一!在龙眼体胚中仅获得
一个
A=D
家族成员
%&!"##
)
#*
*
因此!本研究以
龙眼+红核子,的松散型胚性愈伤组织为材料!在龙
眼转录组数据库的基础上克隆获得龙眼生长素响应
因子
!"#($
!并采用生物信息学和实时荧光定量
"
7
=>+?@=
#的方法对该基因及其编码蛋白进行功
能分析!与报告基因
9#8
融合构建表达载体进行
亚细胞定位分析!旨在进一步研究生长素响应因子
%&!"#($
基因在龙眼体细胞胚胎发生过程中的表
达及其功能分析
#
!
材料和方法
?,?
!
材
!
料
以赖钟雄)#2*于
#22$
年诱导并长期继代保存的
生长旺盛的龙眼+红核子,胚性愈伤组织作为基因克
隆的试验材料通过不同浓度的
!
!
$+B
和时间来调
控并获得松散型胚性愈伤组织(不完全胚性紧实结
构(球形胚(心形胚(鱼雷形胚和子叶形胚等不同发
育阶段用于实时荧光定量
?@=
分析的材料)!"+!#*
?,@
!
方
!
法
?<@!
总
AB0
提取及
6CB0
合成
!
参照
>M.;96
=E5
S
E0V
"
P0[.VM9
S
E0
#试剂盒说明书提取龙眼胚性愈
伤组织的总
=1A
&采用
DEM4E0V5/
公司的
=E[EM+
VA.Z
>`
D.M/V+^VM50Z8B1A^
Y
0VUE/./H.V
的试剂盒
方法合成第一链
8B1A
按照
CE0E=58EM
>`
H.V.
"
P0[.VM9
S
E0
#试剂盒说明书的步骤!采用
L^
J
EM+
8^M.
J
V
"
酶逆转录合成
8B1A
第二链用于
(K+=A@3
及
%K+=A@3
的巢式
?@=
扩增
?<@<@
!
龙眼体胚生长素响应因子
1*!23$$
克隆
!
参考龙眼转录组数据库中的已知
A=D(
部分序列!
以龙眼胚性愈伤组织第一链
8B1A
为模板!利用
&"#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
B1A`A1&,"
软件设计上下游引物
B6A=D(5+D
#
和
B6A=D(5+=
#
在测序结果得到的龙眼
!"#($
部分序列基础上!以龙眼胚性愈伤组织第二链
8B+
1A
为模板!设计用于扩增
!"#($8B1A%K
末端序
列的
!
条引物
B6A=D(5%K+#
与
B6A=D(5%K+!
!其
中
%K
末端序列下游引物为
CE0E=58EM
>`
+%K?M.4EM
将
!"#($
部分序列和
%K
端获得的序列输入
1@FP
在线软件
F65/V
!在多个物种比对结果的保守区!以
龙眼胚性愈伤组织
8B1A
第一链为模板!设计往
!"#($8B1A
序 列
(K
端 延 伸 扩 增 的 引 物 为
B6A=D(5(K+#
和
B6A=D(5(K+!
将
(K
端延伸的测
序结果与
%&!"#($
部分序列和
%K
末端序列进行拼
接!以龙眼胚性愈伤组织
8B1A
第二链为模板!设
计巢式
?@=
扩增
(K
端的
!
条反式下游引物为
B6A=D(5(K+%
和
B6A=D(5(K+$
!上游引物为
CE0+
E=58EM
>`
+(K?M.4EM
?@=
扩增体系为
8B1A
模板
#
#
:
!上(下游引物
"
#"
#
496
%
:
#各
#
#
:
!
a?M.4EM^>A=C@FLWEM
"含
`
S
!b
#
!,(
#
:
!
Z1>? .`<
"
!,(4496
%
:
#
!
#
:
!
?M.4+
EM^>A= X^ B1A?96
Y
4EM/E",!(
#
:
!补
ZZX
!
]
至总
体积为
!(
#
:
?@=
扩增程序为
2*c
变性
#"/
!
>c
"退火温度!见表
#
#退火
(/
!
!c
延伸
V/
"延伸时
间#!共
%"
个循环!最后
!c
再延伸
(4.0
!根据扩增
不同目的片段!对
?@=
扩增程序进行相应调整将
所获
?@=
产物经电泳(染色(凝胶成像并割取目的
条带进一步回收纯化!连接于
?3A^ R+F6L0VTEM9
@690.0
S
dE8V9M
"购自北京全式金生物技术公司#后
转化至
>
#
感受态细胞!挑单克隆进行菌液培养!
?@=
鉴定后送铂尚公司测序基因克隆的引物序
列(退火温度(延伸时间及相应用途见表
#
?<@
AEF5%A
分析
!
参考
:.0
等)!!*的方法对
%&!"#($
基因在龙眼体胚发育不同阶段的表达进
行实时 荧光 定量
?@=
!在保守区域设 计 引 物
B6A=D(5+QD
和
B6A=D(5+Q=
提取龙眼体胚发
育不同阶段胚性培养物的总
=1A
!参照
R^F=3<+
8^M.
J
V
>`试剂盒反转录合成
8B1A
第一链采用两步
法
7
?@=
!反应体系为
#"
#
: R^F= ?ME4.<3<
:$
;
>`
!上下游引物各
",*
#
:
!
#
#
:
各个样本的
8B1A
!
ZZX
!
]
补足至
!"
#
:
&反应程序为
2(c
预
变性
%"/
!
2(c
变性
(/
!
&"c
退火
%"/
!
!c
延伸
%"/
!
$"
个循环以
:.0
等)!!*筛选的龙眼
<=#$!
(
<#>#!
和
#7%
基因为内参基因
7
?@=
引物见表
#
?,@,G
!
亚细胞定位
!
用限制性内切酶
7
,
3
$
酶切
质粒
J
@A F`PA#%"!+CD?
参考
@690VE8U
公司的
P0+DL/.90
%
XB@690.0
S
H.V
试剂盒说明书设计上
下游引物
B6A=D(5CD?+D
和
B6A=D(5CD?+=
以龙眼胚性愈伤组织
8B1A
为模板!在
!"#($
基
因的开放阅读框中设计上下游引物扩增目的片段!
用
P0+DL/.90
快 速 连 接 酶 构 建 瞬 时 表 达 载 体
J
@A F`PA#%"!+CD?+A=D(5
!并 利 用 农 杆 菌
3XA#"(
侵染法转化洋葱表皮细胞龙眼胚性愈
伤组织生长素响应因子
%&!"#($
在不同浓度生长
素
PAA
处理后进行
7
?@=
分析!结果表明该基因经
#,"4
S
%
:
外源生长素
PAA
处理后有明显较高的表
达量)!%*因此!将转化过的洋葱表皮稍滤干菌液!
分别平铺于
`^
固体培养基和添加了
#,"4
S
%
:
PAA
的
`^
固体培养基上!置于
!(c
培养室共培
养
%Z
!最后在共聚焦荧光显微镜"尼康公司#下观察
并拍照亚细胞定位引物见表
#
!
!
结果与分析
@!
龙眼胚性愈伤组织
1*!23$$6CB0
全长序列
的克隆
在龙眼转录组数据的基础上!利用
B6A=D(5+D
#
表
?
!
基因克隆(
H
5%A
及亚细胞定位引物序列
>5I6E#
!
?M.4EM/L/EZ.0
S
E0E8690.0
S
!
7
?@=50Z/LI8E6L65M69856.;5V.90
引物名称
?M.4EM054E
引物序列
?M.4EM/E
7
LE08E
"
(K+%K
#
退火温度
>4
%
c
延伸时间
V
%
/
用途
BE/8M.
J
V.90
B6A=D(5+D
#
B6A=D(5+=
#
A>@@@AAC>@CA@@AC@>@
@A>C>>>CCA@>@CACCC>>
( %(
]=D
扩增
A4
J
6.W.85V.909W]=D
B6A=D(5%K+#
B6A=D(5%K+!
ACCA>@>C>>CCCACC>@CA>>C
>C@>@>C@AA>>CAA@CCA>C>>>CCA@
&"
&(
$"
$"
%K+=A@3
B6A=D(5(K+#
B6A=D(5(K+!
B6A=D(5(K+%
B6A=D(5(K+$
>A@@@@AA>@>>@@A>@>@AC
CA>@A>>@AC>>>@AAC>C@@A
AC>C>@>>>C>@@C@A>C
A@AC@>CACA>CCAACA>>CC
((
("
((
#!"
%(
%"
(K+=A@3
B6A=D(5+QD
B6A=D(5+Q=
>@>@CC@AACA>>>@@@>C
C@>@>C@AA>>CAA@CCA>C>
&" %"
荧光定量
?@=
7
?@=
B6A=D(5CD?+D
B6A=D(5CD?+=
A>@>CA@>AC>A>CA>CCC@>@>>@>C>>C
@@>>>A@>AC>>>C@A>>ACA@@@>CC>>@>C
&( 2"
亚细胞定位
L^I8E6L65M69856.;5V.90
CE0E=58EM
>`
+%K?M.4EM
CE0E=58EM
>`
+(K?M.4EM
C@>C>@AA@CA>A@C@>A@C>AA@C
@CA@>CCAC@A@CACCA@A@>CA
%K+=A@3
(K+=A@3
"#
&
期
!!!!!!!!
林丽霞!等$龙眼体胚发生过程生长素响应因子
%&!"#($
的克隆及表达分析
和
B6A=D(5+=
#
上下游引物进行龙眼
!"#(
基因保
守序列的扩增!经
?@=
扩增获得
(("I
J
左右亮条
带!与设计的目的片段大小一致测序结果显示!目
的片段为
(%2I
J
!包含上下游引物经序列比对分
析!该基因与
CE0F50G
登录的多种植物
!"#(
基因
高度一致!可认为是龙眼
!"#(
的部分序列在测
序得到的龙眼
!"#(
部分序列的基础上!往
(K
端延
伸扩增了
#2&"I
J
!经
%K+=A@3
和
(K+=A@3!
次巢
式
?@=
扩增!分别获得
(("I
J
和
((%I
J
的序列
其中!
!"#(
基因
(K+N>=
长度为
!#!I
J
!
%K+N>=
的长度为
!(*I
J
!
?96
Y
"
A
#尾巴为
!%I
J
运用
B1A`A1&,"
和
]=DD.0ZEM
对龙眼生长素响应
因子
!"#(
全长序列进行分析!
]=D
全长为
!*!2
I
J
!起始于第
!#%I
J
!终止于第
%"$#I
J
!以
A>C
为
起始密码子!
>AA
为终止密码子!编码
2$!
个氨基
酸"图
#
#将这个转录本核苷酸序列在线进行
F65/V
!
图
#
!
龙眼生长素响应因子全长
8B1A
的核苷酸序列和推测氨基酸序列
开放阅读框用下画线标出!保守区域用阴影标出
D.
S
,#
!
DL66E0
S
VU8B1A50Z
J
LV5V.[E54.0958.Z/E
7
LE08E/9W%&!"#($.0%?&)/
0
$/:9LM,
>UE9
J
E0ME5Z.0
S
WM54E\5/L0ZEM6.0EZ
!
VUE890/EM[EZZ945.0/\EME/U5ZEZ
*"#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
龙眼
!"#(
与黄瓜"
1-*-(..$2@-.
#(番茄"
7)&$>
/-(&
A
*)
,
3+.*-(
#的
!"#(
序列一致性分别为
*#e
和
*"e
!结果说明所得片段为龙眼的生长素响
应因子
!"#(
基因!命名为
%&!"#($
"
CE0F50G
登录
号为
HD%2$"#
#
@<@
!
龙眼胚性愈伤组织
1*!23$$
的生物信息学
分析
用
?M9V
J
5M54
预测
B6A=D(5
编码蛋白的理化
性质!相对分子量为
#"(*&,$
!等电点为
(,%"
该
蛋白中相对含量比较多的氨基酸是
E^M
"
##,#e
#(
:EL
"
#",#e
#(
C60
"
,#e
#和
?M9
"
,#e
#&总的带正
电荷的残基"
AM
S
b:
Y
/
#
2
!总的带负电荷的残基
"
A/
J
bC6L
#
#"$
&
B6A=D(5
蛋白的平均疏水性为
)",$!"
!属于水溶性蛋白
B6A=D(5
中间非保守区
域富含氨基酸为
E^M
"
#$,#e
#(
:EL
"
2,2e
#(
C60
"
*,!e
#和
?M9
"
,(e
#采用
L^I:98%
进行
B6A=D(5
亚细胞定位预测!分析结果指示
B6A=D(5
在细胞中
最可能的定位是在细胞质中
对
B6A=D(5
蛋白进行结构域的分析结果"图
$
#显示!
B6A=D(5
具有
F%+B1A
结合区!
A=D
家族
的保守区
AL<.0+ME/
J
和
PAA+A=D+Z.4EM./5V.90%
种结构域!其中
B6A=D(5
氨基酸序列的
#(#
&
!(%
位是
F%B1A
结合域!
*!2
&
2##
位是
ANO
%
PAA
结构域!因此!龙眼生长素响应因子
A=D(5
蛋白具
有典型的
A=D
家族保守结构域
F:A^ >
J
结果表
明!
B6A=D(5
与甜橙(蓖麻(葡萄(黄瓜的一致性分别
达
*!e
(
$e
(
$e
和
#e
结果说明
B6A=D(5
具有
A=D
转录因子的典型结构!属于
A=D
家族基因
为了比较克隆得到的龙眼
%&!"#($
基因与其
他物种
!"#
家族基因的亲缘关系!分别与拟南芥(
芜菁(草莓和甜橙等多个物种中的
!"#(
基因的全
长氨基酸序列进行比对分析结果"图
!
#显示
%&!"#($
基因与豆科的大豆"
9&
A
*/3($4
#(葫芦
科的黄瓜"
1-*-(..$2@-.
#(芸香科的甜橙"
12+-.
./3/..
#聚集在一个分支上!表明其亲缘关系非常
接近!其中与大豆的亲缘关系最为接近而龙眼
%&!"#($
基因与乌拉尔图小麦"
:+2*-(-+$+2-
#(
野生水稻"
B+
A
C$D+$*E
A
$/2E$
#和玉米"
F3$($
A
.
#
的进化距离较远!尤其与单子叶植物玉米的亲缘关
系最远
@
1*!23$$
在龙眼体细胞胚胎发生过程中的表
达分析
提取龙眼不同体胚阶段的总
=1A
!并反转录为
8B1A
以
:.0
等)!!*筛选的龙眼
<=#$!
(
<#>#!
和
#7%
基因为内参基因!对
%&!"#($
基因进行实时
荧光定量
?@=
扩增
%&!"#($
基因在龙眼体细胞
胚胎 不 同 发 育 阶 段 的 表 达 情 况 "图
%
#显 示!
%&!"#($
基因整体转录水平的变化趋势呈现+
`
,
双峰型的表达模式!松散型胚性愈伤组织"阶段
#
#
到不完全胚性紧实结构"阶段
!
#保持平稳的表达
量!球形胚"阶段
%
#表达量却显著上升!达到了体胚
发生过程中
&
个发育阶段的最高表达量!几乎是松
散型胚性愈伤组织和不完全胚性紧实结构时期的
!
倍!而在心形胚时期"阶段
$
#表达量又迅速下降
至球形胚时期的
$!,%2e
随着体胚的分化生长!
图
!
!
龙眼与其他植物生长素响应因子
蛋白氨基酸序列的进化树分析
图中分支点的数字表示
F99V/VM5
J
验证中基于
#"""
次重复该节点可信度的百分比
D.
S
,!
!
?U
Y
69
S
E0EV.8VMEE9W!"#($9W
%?&)/
0
$/:9LM,50Z9VUEM
J
650V/
J
E8.E/
>UE0L4IEM5VVUE09ZE/ME
J
ME/E0V/VUEME6.5I.6.V
Y
J
EM8E0V9WI99V/VM5
J
[56LE/I5/EZ90#"""ME
J
6.85V.90/
图
%
!
%&!"#($
基因在龙眼体细胞
胚胎发生过程中的转录水平
#,
松散型胚性愈伤组织&
!,
不完全胚性紧实结构&
%,
球形胚&
$,
心形胚&
(,
鱼雷形胚&
,
子叶形胚
D.
S
,%
!
>UEVM50/8M.
J
V.906E[E69W%&!"#($
S
E0EZLM.0
S
690
S
50/945V.8E4IM
Y
9
S
E0E/./
#,>UEWM.5I6E+E4IM
Y
9
S
E0.8856L/
&
!,P0894
J
6EVE894
J
58V
J
M9+E4IM
Y
9
S
E0.88L6VLME/
&
%,C69IL65ME4IM
Y
9/
&
$,XE5MV
E4IM
Y
9/
&
(,>9
J
EZ9E4IM
Y
9/
&
,@9V
Y
6EZ905M
Y
E4IM
Y
9/
2"#
&
期
!!!!!!!!
林丽霞!等$龙眼体胚发生过程生长素响应因子
%&!"#($
的克隆及表达分析
%&!"#($
在鱼雷形胚"阶段
(
#的表达量开始增加
至心形胚的
!#",$"e
!而子叶形胚"阶段
&
#的表达
量下降至鱼雷形胚的
$","(e
!比心形胚时期的表
达量略低!子叶形胚的表达量是龙眼体胚生长发育
&
个阶段中的最低值!说明该基因可能参与了龙眼
体细胞胚胎发生过程中的形态建成
@
龙眼
C?0AI$)
的亚细胞定位
为了探索在外源生长素
PAA
处理下龙眼生长
素响应蛋白
B6A=D(5
在植物亚细胞结构中的分布
情况及变化!将构建的
B6A=D(5
基因的瞬时表达载
体
%(^+B6A=D(5+CD?
转化到洋葱表皮细胞借助
于绿色荧光蛋白信号观察!结果"图
(
!
A
&
@
#显示!
只导入携带
CD?
空载体的洋葱细胞内绿色荧光分
布在细胞膜(细胞质和细胞核中!转
%(^+B6A=D(5+
CD?
载体的洋葱表皮在
`^
固体培养基上培养
%Z
后!观察到绿色荧光仅分布在细胞质中"图
(
!
B
&
D
#而转化过的洋葱表皮在添加了
#,"4
S
%
:PAA
的
`^
培养基上培养
%Z
后!在细胞膜(细胞质和细
图
$
!
龙眼生长素响应因子
%&!"#($
拼接全长翻译蛋白保守结构域图
D.
S
,$
!
@90/EM[EZZ945.09W
J
LV5V.[E54.0958.Z/E
7
LE08E9W%&!"#($
图
(
!
%(^
#
B6A=D(5+CD?
蛋白在洋葱表皮细胞中的定位
A
为
F
与
@
的重叠&
B
为
3
与
D
的重叠&
C
为
X
与
P
的重叠&
F
(
3
(
X
是共聚焦显微镜下
B6A=D(5+CD?
蛋白的绿色荧光信号&
@
(
D
(
P
洋葱表皮细胞外观图
C
&
P,
经
#,"4
S
%
:PAA
处理后的定位
D.
S
,(
!
L^I8E6L65M69856.;5V.909W%(^
#
B6A=D(5+CD?
J
M9VE.0.090.90E
J
.ZEM4568E6/
AW9M4EM
S
EZ.45
S
E9WF50Z@
&
BW9M4EM
S
EZ.45
S
E9W350ZD
&
CW9M4EM
S
EZ.45
S
E9WX50ZP
&
F
!
3
!
XW9M.45
S
E/9W
S
MEE0
W6L9ME/8E08E9WB6A=D(5+CD?WL/.90
J
M9VE.0L0ZEMVUEW6L9ME/8E08E4.8M9/89
J
E
&
@
!
D
!
PW9M9LV699G9W90.90E
J
.ZEM456
8E6/,D.
S
C
&
P,^LI8E6L65M69856.;5V.909WB6A=D(5+CD?WL/.90
J
M9VE.0L0ZEM#,"4
S
%
:PAAVME5V4E0V
"*"#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
胞核中均发出明显的绿色荧光信号"图
(
!
C
&
P
#!说
明在外源生长素
PAA
处理下
B6A=D(5+CD?
融合
蛋白移动至细胞膜和细胞核中表达发挥作用
%
!
讨
!
论
D!
龙眼
C&0AI$)
可能为转录激活子
A=D
蛋白是一类转录调节因子!主要含有保守
的
1
端
B1A
结合域"
BFB
区#和
@
端二聚化结构
域"区域
"
和区域
#!在
BFB
区和
"
区域之间存在
一个非保守区域
`=
)
!$
*
A=D
家族成员的转录活
性决定于其非保守区域所富含的氨基酸组成!中间
区域富含谷氨酰胺(丝氨酸和亮氨酸的具有激活转
录活性!而富含丝氨酸(脯氨酸和亮氨酸的则具有抑
制转录活性)!(+!&*本研究通过对龙眼生长素响应因
子
!"#($
基 因 进 行 生 物 信 息 学 分 析!发 现
B6A=D(5
具有
A=D
家族的典型结构"
B1A
结合
域(
ANO
%
PAA
结构域和中间非保守结构域#!确定
B6A=D(5
属于
A=D
家族蛋白的一个成员龙眼生
长素响应因子
B6A=D#
的中央区域含较多的丝氨
酸(脯氨酸和谷氨酰胺)#**!而
B6A=D(5
中间的非保
守区域富含谷甘氨酸(丝氨酸和亮氨酸!由此可推测
B6A=D(5
应为转录激活子!如同拟南芥
AVA=D(
对
生长素响应基因起转录激活作用)!(*
B6A=D(5
蛋
白与甜橙生长素响应因子
A=D(
的氨基酸序列相
似性最高"
*!e
#!并与其亲缘关系最接近!表明本研
究所克隆的基因为龙眼生长素响应因子基因
D<@
!
1*!23$$
表达量的累积可能促进龙眼体细胞
胚胎发生过程中鱼雷形胚时期的形态建成
内源激素在植物胚胎发育过程中起着关键的作
用)!*李惠华等)#**研究发现龙眼生长素响应因子
%&!"##
在球形胚(鱼雷形胚和子叶形胚时期维持
较低的表达量!且子叶形胚的表达量是在这
&
个发
育阶段的最低值!而心形胚时期表达量明显较高!其
推测
%&!"##
为转录抑制子而本研究发现龙眼
生长素响应因子
%&!"#($
基因!在龙眼体细胞胚
胎发生过程中的相对表达量呈+
`
,双峰型模式!在
胚性愈伤组织和不完全胚性紧实结构时期保持较高
且稳定的转录水平赖钟雄等)!"*对龙眼体细胞胚
胎发生过程中内源激素的变化进行研究!发现内源
生长素
PAA
在胚性愈伤组织和球形胚时期维持较
高的水平!且在球形胚时期达到最高含量!而球形胚
时期后
PAA
的含量明显下降!并在成熟子叶形胚达
到最低点!可见本研究与赖钟雄等)!"*关于内源生长
素
PAA
在球形胚前的含量变化是一致的当体胚
发育到球形胚时期!
%&!"#($
基因的表达量达到
&
个发育阶段中的最高点!此时体胚中内源
PAA
也达
到最高含量这说明了龙眼体胚在原胚时期不断累
积内源
PAA
至最高含量!诱导各个细胞经多次的各
方向分裂形成球形胚!结合本试验!龙眼
%&!"#($
在龙眼体胚中表达量与内源生长素浓度呈正相关
性!说明
%&!"#($
可能是具有激活功能的转录因
子另外!在子叶形胚时期!内源
PAA
的含量最低!
%&!"##
和
%&!"#($
基因在龙眼
&
个发育阶段的
表达量达到最低点!推测龙眼体胚发育后期几乎不
受内源
PAA
的影响本研究中龙眼生长素响应因
子
%&!"#($
基因在鱼雷形胚时期的表达量仅次于
球形胚时期当龙眼心形胚两个突起伸长发育成两
片子叶时!基部和胚柄最顶端的一个细胞分化为胚
根!胚根与子叶之间的部分成为胚轴!体胚分化生长
为鱼雷形胚!此时!
%&!"#($
基因达到一个高表达
量因此!推测龙眼生长素响应因子
%&!"#($
在
龙眼体细胞胚胎发生过程中促进鱼雷形胚时期的形
态建成
D
外源生长素
J00
可能促进龙眼生长素响应蛋
白
C&0AI$)
移动而引起空间位置的变化
当生长素浓度较低时!生长素响应基因转录受
到抑制&而当生长素浓度升高时!生长素响应因子成
为活化的转录因子)!**水稻生长素响应因子
B.>
!"#(
经生长素处理后表达量明显下调)!2*!而外源
生长素
PAA
引起龙眼生长素响应因子
!"#(
的上
调表达)!%*!由此表明生长素浓度的变化将会引起生
长素响应因子
!"#.
的差异表达当转化过的洋葱
表皮仅在
`^
固体培养基上培养时!龙眼生长素响
应蛋白
B6A=D(5
定位于细胞质!与
%&!"#($
基因
亚细胞定位预测结果一致&当转化过的洋葱表皮在
添加了
#,"4
S
%
:PAA
的
`^
固体培养基上培养
时!在细胞膜(细胞质和细胞核中均观察到明显的绿
色荧光信号!表明
B6A=D(5
蛋白由细胞质迁移到细
胞膜和细胞核中并得到表达结合以上研究推测!
龙眼生长素响应蛋白
B6A=D(5
能够积极地响应外
源激素!并在不同的细胞器中发挥其作用研究表
明番茄生长素响应蛋白
6^A=D!
定位于细胞核
中)%"*!那么其亚细胞定位是否会因外源激素的处理
而发生变化!龙眼生长素响应因子
A=D/
家族的其
他成员又是如何响应外源激素因此!在后续工作
中将继续克隆龙眼生长素响应基因其他成员并进行
基因功能研究
#*"#
&
期
!!!!!!!!
林丽霞!等$龙眼体胚发生过程生长素响应因子
%&!"#($
的克隆及表达分析
参考文献!
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#
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"马翠兰#!
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