全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
#"""*$"!
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#
#*!#&*"
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$
#"+,&"&
%
-
+.//0+#"""*$"!+!"#$+##+!#&
收稿日期$
!"#$*"&*"&
&修改稿收到日期$
!"#$*")*##
基金项目$国家
)$1
重点项目"
!"##*2!1
#&江苏省科技厅项目"
34!"#!$%
#
作者简介$季晨飞"
#)1,(
#!男!在读硕士研究生!主要从事葡萄育种及生物技术研究
4*56.7
$
-
89*#!!#
!
#&%+8:5
"
通信作者$陶建敏!博士!教授!博士生导师!主要从事葡萄栽培育种及生物技术研究
4*56.7
$
;6:
-
.605.0
!
0
-
6<+=><+80
葡萄雄性不育基因的初步定位
季晨飞!张明月!王继源!余晓娟!贾
!
癑!陶建敏"
"南京农业大学 园艺学院!南京
!#"")
#
摘
!
要$为了对葡萄雄性不育基因进行定位研究!以可育葡萄(魏可)"
!"#"$%"&"

()*?+
#为亲本构建的自交群体
11
株为试验材料!运用分离群体分组混合分析法"
@<7A=>/=
B
C=
B
60;6067
D
/./
!
3EF
#!构建了可育株和不育株基因池!结
合
EEG
技术对葡萄雄性不育基因进行定位研究和生物信息学分析该研究筛选到
!
个与葡萄雄性不育基因连锁
的
EEG
标记
HHIJ%$
和
HHK3!%
!且位于该基因两侧!遗传距离分别为
%+8I
和
#+)8I

!
个标记间物理距离
为
##%$A@
!在该区域总共预测到了
###
个候选基因该研究对葡萄雄性不育基因的精细定位及分子标记辅助育
种奠定了良好的基础
关键词$葡萄&雄性不育&基因定位&
EEG
标记
中图分类号$
L,1)
文献标志码$
F
$%&%#()*
++
#&
,
"-.%)*/%01%2#/%$%&%#&$2*
+
%
MKNO=09=.
!
PQFR2I.0
BD
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SFR2M.
D
<60
!
TUV.6:
-
<60
!
MKFT<=
!
WFXM.605.0
"
"
N:7=
B
=:9Q:C;.8<7;!
R60
-
.0
B
F
B
C.8<7;D
!
R60
-
.0
B
!#"")
#
3412*(
$
W:56
Z
;O=567=*/;=C.7=
B
=0=.0
B
C6
Z
=
!
[=6
(
SE
)
Z
:
Z
<76;.:0.087<>.0
B
11.0>.Y.><67/>=C.Y=>
9C:5;O=/=79.0
B
:9
(
S.0A
)"
!"#"$%"&"

()*?+
#
6/56;=C.67/+WO=@<7A=>/=
B
C=
B
6;=6067
D
/./
"
3EF
#
;=8O0:7:*
BD
[6/8:0><8;=>;:/8C==0;O=
Z
:7
D
5:C
Z
O./5@=;[==0;O=9=C;.7=60>/;=C.7=
Z
::7/@
D
EEG;=8O0:7:
B
.=/.0
:C>=C;:7:86;=;O=
B
=0=60>86CC
D
:<;@.:.09:C56;.8/6067
D
/./+W[:EEG56CA=C/:9HHIJ%$60>HHK3!%
[=C=7.0A=>[.;O!%+$#+WO=
D
7:86;=>:0=.;O=C/.>=/[.;O
B
=0=;.8>./;608=/:9%+8I60>#+)8I
!
C=/
Z
=8*
;.Y=7
D
+WO=
Z
O
D
/.867>./;608=@=;[==0HHIJ%$60>HHK3!%./##%$A@@6/=>:0;O=[O:7=
B
=0:5=/=*
<=08=:9
B
C6
Z
=
!
60>;O=C=6C=###860>.>6;=
B
=0=/.0;O./C=
B
.:0+WO=/=C=/<7;/[.7@=0=9.;9.0=*56
ZZ
.0
B
:9
567=*/;=C.7=
B
=0=60>56CA=C*6//./;=>/=7=8;.:0
"
IFE
#
.0
B
C6
Z
=@C==>.0
BZ
C:
B
C65+
5%
6
7"2!1
$
B
C6
Z
=
&
567=/;=C.7.;
D
&
B
=0=56
ZZ
.0
B
&
EEG56CA=C
!!
雄性不育在开花植物中广泛存在!它是一种有
性繁殖过程中雄性器官异常!从而不能产生花粉或
者花粉败育的遗传现象人们已在
$%
个科*
#&!
个
属*
&#,
种植物中发现了植物的雄性不育现象!且数
量在持续增长+#,利用雄性不育种质可免去繁琐的
人工去雄工作!利于生产无籽果实!同时!可降低树
体养分消耗!提高果实品质!增强果实商业价值
雄性不育在粮食作物*油料作物*蔬菜*果树等
上均有研究!其中以粮食作物上研究最为深入目
前!水稻上已登记了
#%"
余份雄性不育材料+!,!实现
基因定位的有
%
个!分布在除
$
号和
##
号外的所
有染色体上!包含温敏核雄性不育*质雄性不育等多
种不育类型其他农作物如小麦*大豆*谷子上雄性
不育的研究也较多+%*&,!应用广泛雄性不育在油料
作物和蔬菜上的研究仅次于粮食作物!许多雄性不
育基因已被定位
Q<60
B
等+,,以
#
对双隐性基因
,&+$%
和
,&+$$
控制的甘蓝型油菜雄性不育系为
材料!将雄性不育基因
,&+$%
定位在
F]?^
标记
4F"#IN#!
和
4F")^"&
之间!与
!
个标记的距离
分别为
"+#8I
和
"+%8I
吴国平等+1,以甜椒细胞
质雄性不育系"
NIE
#
W&
和相应保持系
W&3
为材
料!利用
EGF^
分子标记技术筛选到了
#
条在两系
间有差异性的稳定条带!经比对分析其功能可能与
逆转座子有关在果树上!受材料生长周期较长等
因素的限制!雄性不育的研究主要停留在细胞学和
生化指标方面何天明+),通过可育梨和不育梨品种
中游离氨基酸总量*游离脯氨酸含量和过氧化氢酶
活性的变化差异检测!认为脯氨酸的缺失影响小孢
子的发育!导致花粉败育张婧等+#",在不完全雄性
不育板栗的短雄超微结构观察中发现!其雄花序上
部组织细胞在衰亡过程中呈现有序的死亡变化!与
植物细胞程序性死亡特征相似!可能与板栗雄性不
育形成的机制有关在葡萄上!有研究表明葡萄雄
性不育材料雄蕊发育不良!花粉粒异常无活力!小孢
子发育过程中绒毡层提前解体!可溶性蛋白和脯氨
酸等物质含量均低于可育材料+##,其中!葡萄的绒
毡层发育相关基因
!%-$!
和
!%-
.
/$
的克隆和表
达分析!进一步证明了绒毡层的提前解体与葡萄雄
性不育的产生关系紧密+#!,迄今尚没有葡萄雄性
不育基因遗传分析及标记定位方面的相关报道
本实验在前人研究的基础上+##*#!,!以葡萄可育
品种(魏可)及其自交产生的
11
株实生苗群体为材
料!通过对自交后代中产生的雄性不育现象进行统
计!根据性状分离比确定了葡萄雄性不育类型通
过
3EF
和
EEG
技术的结合!初步定位了葡萄雄性
不育基因
!%+$#
葡萄雄性不育基因的定位为分
子标记辅助葡萄育种和创造更多的葡萄雄性不育新
种质提供了重要依据
#
!
材料和方法
8+8
!
供试材料
供试材料为葡萄品种(魏可)!欧洲种!完全花!
由日本山梨县志村富男于
#)1,
年用(
_<@=7I86;
)与甲斐露杂交获得(
_<@=7I)与甲斐露
均雄蕊发育正常!花粉有活力!为可育植株在(魏
可)的自交实生后代中发现部分不育株!不育株雄蕊
花丝短!且反卷!花药干瘪利用(魏可)自交获得了
(
SE
)群体!该群体总株数
11
株所有材料均种植
于南京农业大学汤山基地
8+9
!
田间调查与花粉萌发力检测
(
SE
)群体播种于
!"",
年春!当年
&
月定植
植株部分于第
!
年始花!大多播种后第
%
年开花结
果于
!"##
"
!"#!
连续
!
年对 (
SE
)群体进行花
器官形态观察和统计!以田间统计为主!辅之以花粉
活力检测
8:;
!
<<=
反应及
<<=
标记多态性筛选
基因组
JRF
的提取采用
NWF3
法+#%,!分别提
取亲本材料和(
SE
)群体材料的基因组
JRF

EEG
反应体系为
JRF
模板
"0
B
!上下游引物
各
"+
#
5:7
-
?
(#
!
>RW^ !+
#
5:7
-
?
(#
!
#"`
N^G@<99=C
!
I
B
N7
!
!+55:7
-
?
(#
!
0*
1
JRF
聚
合酶
"+U
!总体积
!"
#
?

N^G
反应程序为
)$a
预变性
5.0
&
)$a
变性
$/
!
"a
退火
$/
!
,%a
延伸
#5.0
!共
%
个循环&
,%a
延伸
#"5.0
!反应结
束后
$a
保存
N^G
扩增产物用
1b
非变性聚丙烯
酰胺凝胶电泳分离!电泳后银染观察
共有
)1
条
EEG
引物用于多态性筛选
EEG
引物主要选自于
HIN
"
H.;./I.8C:/6;=7.;=N:0/:C*
;.<5
!
F
B
C:
B
=0=EF
!
I:.//
D
NC656
D
=7
!
]C608=
#*
HHK
和
UJH
+
#$*#
,等
%
个系列!
4EW*EEW
引物则来
源于近些年发表的文献+
#&
!
#,
,
8:>
!
连锁标记的筛选和
12348
的定位
从(
SE
)群体中随机挑选
#"
个可育植株和
#"
个不育植株!分别构建可育株和不育株的混合
JRF
基因池使用
EEG
引物进行筛选和群体分析!借鉴
K^ 2^
参考图谱+#1,!利用筛选出具有多态性的
EEG
引物及位点附近引物构建连锁群!将葡萄雄性不育
基因
!%+$#
定位在连锁群上
8+?
!
生物信息学分析
利用
RN3K
数据库"
O;;
Z
$%%
[[[+08@.+075+
0.O+
B
:Y
%#和葡萄全基因组数据库"
O;;
Z
$%%
[[[+
B
=0:/8:
Z
=+80/+9C
%
/
Z
.
Z
%
H.;./*Y.0.9=C6*[O:7=*
B
=*
0:5=+O;57
#!对初步定位区域的候选基因进行查
找与分析通过基因注释文件!提取目的基因序列
再利 用
NJJ
数 据 库 "
N:0/=CY=> J:56.0 J6;6*
@6/=
#!以
4*Y67<=c#+""4
(为阀值!对具有保守结
构域的基因进行功能预测
!
!
结果与分析
9+8
!
田间性状统计与花粉生活力检测
田间调查发现!(
SE
)群体中可育株花形态正
常!花丝直立!花药饱满!而不育株花丝反卷!花药干
&&#!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
瘪"图
#
#花粉生活力检测结果表明!可育株花粉
活力均在
&"b
以上!而不育株花粉活力均小于
b

统计分析可得!可育株株数为
&
株!不育株为
!%
株!可育株和不育株的比例为
!+1$d#
!根据
$
!
"
$
!
c"+"&
#
%+1$
#!计算显示!符合单基因分离
%d#
的
比例!表明葡萄雄性不育可能由隐性单基因控制的
9:9
!
<<=
引物的多态性筛选
利用
EEG
引物对可育株基因池和不育株基因
池进行筛选!得到
!
条在基因池间具有多态性的标
记!分别为
HHIJ%$
和
HHK3!%
"图
!
#通过和已
公布的多条葡萄遗传图谱比较!分析得出
!
条引物
均位于葡萄基因组的
!
号染色体上
9:;
!
12348
基因的初步定位
用筛选到的
!
条引物及位点附近的引物对
(
SE
)群体进行分析"图
%
#!通过
M:.056
Z
$+"
构建
连锁图结果表明!
HHIJ%$
和
HHK3!%
分布于
!%+$#
基因的两端!距离分别为
%+8I
和
#+)8I
"图
$
#
HHIJ%$
和
HHK3!%
这
!
个标记!在遗传
群体分析中出现了较为显著的偏分离现象!
$
! 分别
为
!!+&$
和
#)+""
!而连锁图上其他标记中!离该位
点较近的标记比离该位点较远的标记
$
! 要高"表
#
#!
这可能与
!%+$#
基因对雄配子选择的影响有关+#),
9+>
!
候选基因的生物信息学分析
根据葡萄基因组数据库提供的全基因序列!利
用生物信息学方法对目标基因初步定位区域进行了
图
#
!
可育株"
F
#和不育株"
3
#的花器官形态
].
B
+#
!
WO=97:[=C:99=C;.7=
"
F
#
60>/;=C.7=
"
3
#
.0>.Y.><67/
图
!
!
HHIJ%$
"
F
#和
HHK3!%
"
3
#在
!
个基因池间的扩增结果
I+"@
Z
JRF56CA=C
&
+^
魏可&
#
"
#"+
(
SE
)群体中可育株&
##
"
!"+
(
SE
)群体中不育株
].
B
+!
!
WO=65
Z
7.9.86;.:0C=/<7;/:9HHIJ%$
"
F
#
60>HHK3!%
"
3
#
.09=C;.7=60>/;=C.7=.0>.Y.><67/
I+"@
Z
JRF56CA=C
&
+^S.0A
&
#(#"+]=C;.7=.0>.Y.><67/.0
(
SE
)
Z
:
Z
<76;.:0
&
##(!"+E;=C.7=.0>.Y.><67/.0
(
SE
)
Z
:
Z
<76;.:0
图
%
!
HHIJ%$
在(
SE
)群体间的扩增结果
I+I6CA=C
&
+^
魏可&
E#+
(
SE
)部分个体
].
B
+%
!
WO=65
Z
7.9.86;.:0C=/<7;:9HHIJ%$.0
(
SE
)
Z
:
Z
<76;.:0/
I+I6CA=C
&
+^S.0A
&
E#+K0>.Y.><67/.0
(
SE
)
Z
:
Z
<76;.:0
,&#!
##
期
!!!!!!!!!!!!!!!
季晨飞!等$葡萄雄性不育基因的初步定位
序列分析结果表明!与
!%+$#
紧密连锁的
!
个标
记
HHIJ%$
和
HHK3!%
之间的物理距离为
##%$
A@
!在该区域中共有
###
个候选基因这些基因主
要涉及锌指结构*水解酶家族*转录因子*细胞色素
$^"
和生长激素响应蛋白等通过分析!
TWQ
*
IFJE
和
$^"
超级家族的基因有可能参与葡萄不
育性状"表
!
#!但其功能还需经过更进一步的研究
验证来确定
图
$
!
!%+$#
在葡萄第
!
号染色体的定位结果
].
B
+$
!
WO=!%+$#7:86;.:0:0
B
C6
Z
=8OC:5:/:5=!
表
8
!
连锁群上的引物
W6@7=#
!
C^.5=C/.0;O=7.0A6
B
=
B
C:<
Z
引物名称
C^.5=C
带型分离比率
E=
B
C=
B
6;.:0
C6;.:
$
!
2
引物来源
C^.5=C/:HHIJ%$ %d&"d! !!+&$
#+!#` #"
(
+
#$
,
HHK3!% &d&"d!% #)+"" ,+$1` #"
(
+
#$
,
]FI&1 #d$1d! %+"" "+!!
+
#&
,
]FI#$" #$d$)d! %+1) "+#$
+
#&
,
HIN2, #,d$)d!! #+," "+$%
+
#1
,
HHKU!" #1d$1d!! #+") "+1
+
#$
,
HIN1N! #&d$,d! !+! "+%!
+
#1
,
%
!
讨
!
论
尽管果树雄性不育的研究有了一定进展!但主
要集中在细胞学分析和生化生理分析层面上由于
果树遗传背景复杂!童期较长!通过传统育种方法构
建遗传群体相对不易!所以在不育遗传机理上远远
落后于玉米!水稻等大田作物+!",葡萄雄性不育基
因的定位研究!有助于找到与雄性不育基因紧密连
锁的
JRF
标记一方面可以运用于育种工作中!
通过分子标记辅助选择"
56CA=C6//./;60;/=7=8*
;.:0
!
IFE
#技术在苗期鉴定葡萄雄性不育株!提高
育种效率!加速育种进程&另一方面可以对雄性不育
基因进行精细定位和图位克隆!从而找出控制葡萄
雄性不育的基因
本研究中与雄性不育基因
!%+$#
相邻的
!
个
标记出现了极度的偏分离现象!这可能是因为
!%+$#
基因的存在影响雄配子体的分离!从而通过
影响雄配子的比例间接影响合子的基因型比
例+!#*!!,前人研究表明!偏分离与雄配子体的育性
有关!且偏分离标记成簇出现在连锁群上+!%*!&,本
研究中的(
SE
)群体出现可育和不育的分离现象!雄
性不育基因的定位结果也支持了前人的研究结果!
但是其形成机理还有待进一步的研究考证
E8:;;
等+!,,认为桃的雄性不育性状由
#
个隐性
单基因"
3
$
#控制!后面研究也陆续支持了这一结果
本研究中(
SE
)群体中可育株和不育株比例约为
%d#
!初步认为葡萄上的雄性不育性状也是由
#
个
隐性单基因控制根据前人发表的遗传图谱+#1,!选
用
EEG
分子标记!结合分离群体分组混合分析法
"
3EF
#!首次定位了葡萄雄性不育基因!研究表明!
该基因位于葡萄
!
号染色体上
!
个
EEG
标记
HHIJ%$
和
HHK3!%
之间本研究使用的是葡萄
自交群体!遗传背景较为明晰!易于分析!有利于深
表
9
!
可能参与葡萄雄性不育性状的候选基因
W6@7=!
!
WO=860>.>6;=
B
=0=/6//:8.6;=>[.;O567=/;=C.7.;
D
.0
B
C6
Z
=
基因
2=0=
结构域位置
WO=7:86;.:0:9>:56.0/
起始
E;6C;
终止
40>
4
值
4Y67<=
结构域所属家族
WO=965.7
D
:9>:56.0/
2EHKHW"#"#))"#"#! ,# !"& ,+"14
(,
TWQ
超级家族
TWQ/<
Z
=C965.7
D
2EHKHW"#"#))"#"%$ $ %,# %+%$4
(1%
$^"
超级家族
$^"/<
Z
=C965.7
D
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超级家族
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Z
=C965.7
D
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IFJE
超级家族
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Z
=C965.7
D
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超级家族
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Z
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D
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超级家族
$^"/<
Z
=C965.7
D
1&#!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
入研究葡萄雄性不育基因遗传机理!但是自交群体
出现的遗传交换位点少于杂交群体!筛选到的多态
性标记也就较少!为葡萄的进一步定位带来了困难
所以后续还需利用多种途径!开发新的多态性标记!
进行更加精细的定位
参考文献!
+
#
,
!
_FU?I?Q+I67=/;=C.7.;
D
.0O.
B
O=C
Z
760;/
+
I
,
+R=[T:CA
$
E
Z
=C7.0
B
=C*H=C.6
B
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1"!F
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"中国农业科学#!
"##
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#
+
+
%
,
!
钱焕焕
+
小麦
_
型温敏雄性不育系
_W^ ##&F
的温敏特性研究及隐性恢复基因定位+
J
,
+
陕西杨陵$西北农林科技大学!
"#%+
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NFXEQQ
"曹双河#!
2UXV?
"郭小丽#!
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"刘冬成#!
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DB
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.0
B
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