全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(5): 474-479(2012)
收稿日期: 2011-09-23; 修回日期: 2012-05-30
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(30971878); 浙江大学自主计划青年资助项目(2009QNA6024)
通讯作者: 周 波,研究员,博导,主要从事水稻与稻瘟菌互作研究; Tel: 0571-86419152, E-mail: bzhzd@zju. edu. cn
第一作者: 李 萍(1986 - ), 女 ,山东济宁人,在读硕士,主要从事植物与病原菌互作研究; E-mail: lovedaozhonghua@163. com。
稻瘟病菌无毒蛋白 AvrPiz-t
半胱氨酸残基的功能分析
李 萍1,2, 董 波2, 周 恒1,2, 周 波2*
( 1浙江大学农业与生物技术学院, 杭州 310058; 2 浙江省农业科学院植物病毒与生物技术研究所, 杭州 310021)
摘要:稻瘟病菌无毒基因 AvrPiz-t编码了一个包含 108 个氨基酸的未知功能的预测分泌蛋白,其与对应的水稻抗稻瘟病基
因 Piz-t介导了基因对基因的抗病反应。 序列分析发现 AvrPiz-t的预测成熟蛋白 AvrPiz-t90含有 4 个半胱氨酸残基,推测它
们可能参与了 AvrPiz-t蛋白分子内或分子间的相互作用。 为了检测这 4 个半胱氨酸对 AvrPiz-t功能的影响,利用定点突变
技术对 4 个半胱氨酸残基分别进行了位点突变并构建了相应的稻瘟病菌互补载体。 功能互补分析发现,上述 4 个突变体
都丧失了 AvrPiz-t无毒基因的功能。 由此推断,半胱氨酸对 AvrPiz-t蛋白功能的表达是非常重要的。
关键词: 稻瘟病菌; 无毒基因; 半胱氨酸; 致病性
Functional analysis of cysteine residues of the Magnaporthe oryzae avirulence
protein AvrPiz-t 　 LI Ping1,2, DONG Bo2, ZHOU Heng1,2, ZHOU Bo2 　 ( 1 College of Agriculture and Bio-
technology , Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 2 Institute of Virology and Biotechnology, Zhejiang Academy of
Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China)
Abstract: The Magnaporthe oryzae avirulence gene AvrPiz-t encodes a small predicted secreted protein (108
amino acids) without known function and mediates resistance in a gene-for-gene fashion to Piz-t in rice. Se-
quence analysis of AvrPiz-t revealed that its predicted mature form AvrPiz-t90 consists of 4 cysteine residues,
which is predicted to be involved in intra- and intermolecular interactions. To further investigate the signifi-
cance of these 4 cysteine residues in the function of AvrPiz-t, a site-mutagenesis approach was utilized to ge-
nerate 4 constructs encompassing mutations at each cysteine residue. Complementation tests revealed that these
4 derived AvrPiz-t mutants lost avirulence function to Piz-t, which indicated that these 4 cysteine residues were
critical for the avirulence function of AvrPiz-t.
Key words: Magnaporthe oryzae; avirulent gene; cysteine residue; pathogenicity
中图分类号: S435. 111. 41　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2012)05-0474-06
　 　 水稻是非常重要的粮食作物,养活了世界
50%以上的人口[1]。 由于病原菌等多种因素的危
害,稻谷的产量和质量都受到很大的影响。 由子囊
菌稻瘟病菌 Magnaporthe oryzae(无性世态 Pyricu-
laria oryzae)引起的稻瘟病是世界上最重要的水稻
病害之一。 其造成的水稻产量损失达 10% ~
30% ,严重发病田块损失高达 80% ,甚至颗粒无
收[2]。
目前,防治该病的主要措施是培育抗病品种。
研究发现,寄主抗性的表现不仅取决于寄主品种本
身的抗病基因型,还取决于病原菌的基因型,即只
有寄主植物中存在抗性基因而病原菌中同时存在
无毒基因时,植物才能发生抗病反应[3,4]。 因此,
稻瘟病菌无毒基因功能的丧失将会导致相应抗病
　
　 5 期 　 　 李 萍,等:稻瘟病菌无毒蛋白 AvrPiz-t半胱氨酸残基的功能分析
品种抗性的下降甚至消失,继而导致稻瘟病的大发
生。 展开对稻瘟病菌无毒基因的克隆及相关研究
将有助于抗病品种的开发和利用。
到目前为止,在已鉴定的 40 多个稻瘟病菌无
毒基因中, 9 个已被克隆。 其中 PWL1[5] 和
PWL2[6]控制稻瘟病菌对弯叶画眉草的致病性,
AvrPi-ta[7]、Avr1-CO39 [8] 、 ACE1[9]、 AvrPiz-t[10]、
AvrPii、AvrPia 和 AvrPik / km / kp [11]控制稻瘟病菌
对水稻的致病性。 由于植物病原菌无毒基因间的
同源性比较低,而且产物的结构和生化性质尚不明
确,对无毒基因间可能存在的进化和功能上的相关
性研究难于开展。
AvrPiz-t为本课题组利用图位克隆的方法从
田间菌株 81278ZB15 中分离的无毒基因。 AvrPiz-t
能诱导含 Piz-t抗性基因水稻品种的特异性免疫反
应和抑制烟草叶片中 BAX 所介导的程序性细胞
死亡 [10]。 为了进一步研究 AvrPiz-t 的相关功能,
寻找影响其功能的关键位点,本文对 AvrPiz-t 的序
列进行了分析,发现在 AvrPiz-t 的预测成熟蛋白
AvrPiz-t90中含有 4 个半胱氨酸残基。 利用定点突
变技术分别构建了 4 个半胱氨酸位点的突变载体
并转化稻瘟病菌菌株 GUY11。 致病性分析表明 4
个半胱氨酸残基对 AvrPiz-t 蛋白的功能起着至关
重要的作用。
1　 材料与方法
1. 1　 水稻品种与培养
用于接种试验的水稻品种包括不含有抗性基
因 Piz-t的日本晴,以日本晴为背景的转 Piz-t 抗性
基因水稻以及本身携带 Piz-t 抗性基因的 Toride1,
3 个品种的水稻均为本实验室保存。 为保证不同
品种水稻的生长一致性,将 3 种水稻品种去壳后于
75%的酒精中浸泡 1 min,再用 50%的次氯酸钠消
毒 30 min后,分别播种到 1 / 2MS 培养基或含 100
mg / L 潮霉素的 1 / 2MS 筛选培养基上,在 26 ~
28℃、12 h光照条件下培养 4 ~ 5 d,选出生长一致
的小苗转移到土中,于 28℃,12 h 光照条件下继续
培养 12 d,待接种用。
1. 2　 供试稻瘟病菌菌株及稻瘟病菌培养
用于稻瘟病菌转化及致病性鉴定的对照菌株
均为来自法国的无 AvrPiz-t 蛋白功能的稻瘟病菌
菌株 GUY11。 用于稻瘟病菌培养的完全培养基
(CM)的配制参见相关文献[12]。 将保存有稻瘟病
菌菌株的滤纸片置于 CM 平板上,26℃,12 h 强光
照下培养 12 d用于产孢,待接种用。
1. 3　 致病性分析
收集稻瘟病菌的孢子,0. 04%吐温 20 配制成
1 ×105 个 / mL 孢子悬浮液,参照文献上的方法均
匀的喷洒到水稻植株上[12],置于适宜的条件下,6
d后进行致病性分析。
1. 4　 稻瘟病菌互补载体的构建
本试验中使用的稻瘟病菌转化载体为
pCSN43-NCGR[10]。 在 AvrPiz-t 互补载体[10]基础
上,构建了 AvrPiz-t:eGFP 融合载体用于功能互补
分析(详见结果分析部分)。 4 个半胱氨酸残基突
变体则是在 AvrPiz-t:eGFP 融合载体基础上,利用
定点突变试剂盒 ( KOD-Plus-Mutagenesis Kit,
TOYOBO-Shanghai-Life Science Company) 构建。
所有的载体都经过测序分析,确保其序列和方向的
正确性。
1. 5　 稻瘟病菌转化试验
稻瘟病菌原生质体的制备及转化参考
Sweigard等[6]的方法,将上述构建的 5 个载体导入
稻瘟病菌菌株 GUY11 的原生质体中,在含有 300
mg / L潮霉素抗性的 TB3 培养基上培养。 挑取对
潮霉素产生抗性的转化子置于含有 150 mg / L 潮
霉素的 CM筛选培养基上,再次筛选培养并保种。
1. 6　 DNA的提取和 PCR检测
1. 6. 1　 DNA的提取　 用简易 CM液体培养基(酵
母提取物 6 g / L、酪蛋白水解物 6 g / L、蔗糖 10 g /
L),于 28℃、150 rpm 培养稻瘟病菌,48 h 后收集
菌丝,用改良后的 CTAB 法[13]提取稻瘟病菌基因
组 DNA,用于 PCR检测。
1. 6. 2 　 PCR 检测 　 根据目的片段序列设计引物
Pro-F (5′-TGCCAGTTTCATTCGAAGTG-3′,序列
来源于 AvrPiz-t的启动子区)和 eGFP-R(5′-CTTG-
TACAGCTCGTCCATGC-3′,序列来源于 eGFP 的
CDS的末端序列)用于稻瘟病菌转化子的检测。
PCR反应体系为:基因组 DNA 10 ng,10x 缓冲液
2. 5 μL,2. 5 mmol / L的 dNTP 2 μL,10 μmol / L的
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植物病理学报 42 卷
上下游引物各 0. 5 μL,5 U / μL 的 Taq DNA 聚合
酶(TaKaRa)0. 3 μL,总反应体系为 25 μL。 循环
条件:94℃预变性 2 min,94℃变性 30 s,60℃退火
30 s, 72℃延伸 1 min, 循环 35 次, 最后 72℃ 10
min。
取 5 μL PCR扩增产物用 1%琼脂糖凝胶进行
电泳,电泳结果置于 EB 中染色 15 min,然后在凝
胶成像仪中观测结果并拍照。
2　 结果分析
2. 1　 AvrPiz-t:eGFP载体的构建和功能互补分析
为便于稻瘟病菌转化子的鉴定和 AvrPiz-t 基因
表达分析,在原有 AvrPiz-t 互补载体[10]基础上构建
了C端 eGFP的融合载体AvrPiz - t : eGFP (图 1) 。
构建过程中所使用的引物见表 1。
　 　 AvrPiz-t:eGFP 融合载体的 GUY11 转化子的
致病性分析发现,AvrPiz-t:eGFP的 GUY11 转化菌
株对 Toride 1 和 Piz-t转基因日本晴水稻表现为无
毒,而对日本晴则表现为有毒。 这个结果表明,
AvrPiz-t C端融合的 GFP 不会影响 AvrPiz-t 的无
毒功能。
2. 2　 AvrPiz-t的 4 个半胱氨酸残基突变载体的构
建和互补转化子的鉴定
AvrPiz-t的序列分析发现,除去 N 端 18 个氨
基酸信号肽,得到成熟 AvrPiz-t90,含有 4 个半胱氨
酸残基,分别位于全长 AvrPiz-t 的第 23、62、70 和
75 氨基酸位点 (图 2)。 利用定点突变技术,以
AvrPiz -t:eGFP为模板,对上述4个半胱氨酸残基
Fig. 1　 A schematic diagram of the AvrPiz-t:eGFP vector
Only the region encompassing the introduced fragments was shown. The fragments corresponding
to the promoter and coding sequence (CDS) of AvrPiz-t, eGFP and terminator of AvrPiz-t
were indicated in marked boxes. The junction restriction enzymes were marked with arrows.
Table 1　 Primers used in this study
Primer Sequence(5′ - 3′) Purpose
gAvrPiz-tF aagctttgaaacatgatttcccaggc
Amplification of promoter of AvrPiz-t and CDS
gAvrPiz-tR ggtaccttggcgctgagcctgagggtc
eGFPF ggtaccatggtgagcaagggcgagg
Amplification of eGFP
eGFPR gtcgactcacgaactccagcaggacc
T-AvrPiz-tF gtcgactagggtgttcttttattcg
Amplification of terminator of AvrPiz-t
T-AvrPiz-tR gagctctccgttgaagcaacaggatc
F-C23A gctaatcatcatctcctgtac
Construction of AvrPiz-t mutant AvrPiz-tC23A
R-C23A ttgtacgaagctggcggaggc
F-C62A gctaaaaacgcgtcacccgt
Construction of AvrPiz-t mutant AvrPiz-tC62A
R-C62A aatcgcgaccagcctctttg
F-C70A gctaactatctgaaatgcac
Construction of AvrPiz-t mutant AvrPiz-tC70A
R-C70A gtgtacgggtgacgcgtttt
F-C75A gctaccaatttggcagcaggct
Construction of AvrPiz-t mutant AvrPiz-tC75A
R-C75A tttcagatagttgcagtgtacg
　 　 The nucleotide sequences recognized by restriction enzymes were underlined.
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　 5 期 　 　 李 萍,等:稻瘟病菌无毒蛋白 AvrPiz-t半胱氨酸残基的功能分析
Fig. 2　 Four cysteine residues in AvrPiz-t
Amino acid residues were listed by single alphabetic characters underneath the nucleotide sequences.
The predicted singal peptide was underlined. Four cysteine residues were boxed.
进行了突变,将半胱氨酸残基突变为丙氨酸残基,
分别获得了 AvrPiz-tC23A、AvrPiz-tC62A、AvrPiz-tC70A
和 AvrPiz-tC75A。
　 　 利用 PCR 方法,对 4 个 AvrPiz-t 突变体
(AvrPiz-tC23A、 AvrPiz-tC62A、 AvrPiz-tC70A 和 AvrPiz-
tC75A)的 GUY11 转化子进行分子鉴定,结果表明所
挑选的潮霉素抗性转化菌株均表现为 PCR扩增阳
性(图 3),表明目的片段已经插入到了稻瘟病菌菌
株 GUY11 的基因组中。
2. 3　 AvrPiz-t突变子致病性分析
从每个转化系已检测过的转化子中各选择 3
个突变子,并以稻瘟病菌菌株 GUY11 作为对照进
行致病性鉴定。 收集以上 16 种稻瘟病菌菌株的孢
子均匀的喷雾到日本晴、Toride1 和转 Piz-t 抗性基
因的日本晴上,接种 6 d后观察病斑产生情况并拍
照(图 4)。 统计观察结果发现,对照菌株 GUY11
及转 AvrPiz-t:GFP 菌株的接种结果和 Li 等[10]的
研究结果一致,而 4 个半胱氨酸位点突变的稻瘟病
菌突变系恢复了对 Toride1 和转 Piz-t 抗性基因水
稻的致病性,接种后均出现了明显的病斑,说明半
胱氨酸位点的突变导致了 AvrPiz-t 相应无毒功能
的丧失。 上述喷雾接种试验均重复 3 次,图 4 只显
示了对照菌株 GUY11 及每个转化系其中一个转
化子的接种结果。
Fig. 3　 PCR amplification pattern of the transformants harboring the
mutated AvrPiz-t gene at each cysteine residue
Two independent transformants were randomly selected as representatives. LaneM: DL 2 000 ladder;
Lane1: Untransformed GUY11 strain; Lane 2, 3: Transformants with AvrPiz-tC23A;
Lane 4, 5: Transformants with AvrPiz-tC62A; Lane 6, 7: Transformants with AvrPiz-tC70A;
Lane 8, 9:Transformants with AvrPiz-tC75A .
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植物病理学报 42 卷
Fig. 4　 Pathogenicity tests of GUY11 transformants with different AvrPiz-t mutants
Three rice cultivars including Nipponbare (a), Toride 1 (b) and Nipponbare with
Piz-t transgene (c) were used for the assays.
3　 讨论和结论
目前已克隆的 9 个稻瘟病菌菌株的无毒基因
大部分都为分泌蛋白,除了属于 PWL 家族的
PWL1 和 PWL2 有 78%的同源度外[5],其他的无毒
基因之间并没有明显的同源性。 其中 PWL2 编码
145 个富含甘氨酸的亲水蛋白[6],AvrPi-ta 编码
223 个氨基酸的金属蛋白酶[7],ACE1 是一个含有
4 035 个氨基酸的聚酮化合物酶和非核糖体多肽合
成酶的复合体[9],其他的无毒基因均编码一个小
分子的分泌蛋白。 由于无毒基因之间没有明显的
同源性,因此对无毒基因间可能存在的进化和功能
上的相关性研究很难开展,而且对于单个无毒基因
的结构与功能关系方面的研究也很少,大部分停留
在激发相应的抗性品种发生特异性免疫反应上。
本研究中的无毒基因 AvrPiz-t 不仅能够激发含
Piz-t 抗性基因的水稻发生抗性反应,而且能够在
烟草中抑制 BAX介导的细胞程序化死亡[10],这个
结果在水稻的原生质体中也得到了很好的验证
(未发表)。
为了更好地了解 AvrPiz-t 的相关功能,对
AvrPiz-t的序列进行了相关分析。 同源检索发现
AvrPiz-t 在稻瘟病菌菌株的基因组中是以单拷贝
形式存在,在其他物种中均未发现与其同源的蛋白
序列[10],因此很难利用比较建模法预测其蛋白质
结构。 进一步分析发现,除去分泌信号肽的 18 个
氨基酸,AvrPiz-t90中包含 4 个半胱氨酸残基。 半
胱氨酸残基中的巯基是比较活泼的基团,它们之间
很容易形成二硫键,二硫键在维持蛋白质的结构和
功能上起着非常重要的作用。 以此为依据,构建了
4 个半胱氨酸位点的突变体,致病性分析发现,每
个半胱氨酸位点的突变都导致了 AvrPiz-t 无毒功
能的丧失。 因此推测,这 4 个半胱氨酸残基之间可
能形成了 2 个二硫键,决定了 AvrPiz-t 的蛋白结
构,从而直接影响着 AvrPiz-t蛋白的功能。 但对于
这 4 个半胱氨酸残基是如何形成二硫键,怎样来决
定 AvrPiz-t的结构,还不能加以说明。 进一步的分
子生物学和其他结构化学试验正在进行中。
在构建载体的过程中加入了 eGFP 融合蛋白
作为报告基因,目的是为了检测目的片段是否在突
变菌株中表达。 遗憾的是, AvrPiz-t:eGFP 转化子
在不同发育阶段,包括菌丝、分生孢子、附着胞和侵
染阶段都没有检测到明显的荧光,利用 RT-PCR也
没有检测到 AvrPiz-t 的明显表达,这些结果表明
AvrPiz-t在稻瘟病菌整个侵染过程中的表达量可
能比较低,少量的 AvrPiz-t足以为 Piz-t 所识别,从
而激发水稻的特异性免疫反应。 通过 PCR 方法证
明了目的片段已经插入到了稻瘟病菌菌株 GUY11
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　 5 期 　 　 李 萍,等:稻瘟病菌无毒蛋白 AvrPiz-t半胱氨酸残基的功能分析
的基因组中;同时,从每个转化系筛选的转化子中
随机挑选了 3 个转化子进行接种试验,每个转化子
的致病性表型均一致。 AvrPiz-t 在菌株 GUY11 中
获得了表达,并发挥了其功能。
本文的研究结果验证了稻瘟病菌无毒基因功
能位点的改变将使其无毒功能丧失,为无毒蛋白的
结构和功能研究奠定了基础;同时,对抗病育种及
抗病品种的合理布局具有很好的指导意义。
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