全 文 :植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 44(3): 313 ̄317(2014)
收稿日期: 2013 ̄04 ̄19ꎻ 修回日期: 2013 ̄11 ̄09
基金项目: 国家质检总局项目(2010IK270)
通讯作者: 厉艳ꎬ高级农艺师ꎬ主要从事植物检疫学研究ꎻE ̄mail:standciq@163 comꎮ
研究简报
进境韩国大花蕙兰上唐菖蒲伯克氏菌的
分离鉴定及生物学研究
厉 艳∗ꎬ 甘琴华ꎬ 封立平ꎬ 邵秀岭
(山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心ꎬ青岛 266002)
Isolationꎬ identification and biological characterization of Burkholderia gladioli in
Cymbidium imported from Korea LI YanꎬGAN Qin ̄huaꎬFENG Li ̄pingꎬSHAO Xiu ̄ling ( In ̄
spection and Quarantine Technology Center of Shandong Entry ̄Exit Inspection and Quarantine BureauꎬQingdao 266002ꎬChina)
Abstract: Three pathogenic bacterial strains were isolated from leaves of Cymbidium imported from Korea
using flat ̄panel method The strains were identified and their biological characteristics were studied Studies on
morphologicalꎬ culturalꎬ physiological and biochemical characteristics showed that all strains formed whiteꎬ
glossyꎬ convexꎬ opaque and round single colony on nutrient agar (NA) and secreted a significant amount of
yellowish greenꎬ non ̄fluorescent diffusible pigment All of these bacteria are Gram ̄negative Bacterial cells are
straight or slightly curved rod ̄shapedꎬ with 1 to 2 polar flagella under the microscope According to Biologꎬ 16S
rDNA gene sequences analysisꎬ PCR and pathogenicity testꎬ the three strains were identified as Burkholderia
gladiol This is the first report of B gladiol infecting Cymbidium
Key words: Cymbidiumꎻ Burkholderia gladiolꎻ identificationꎻ biology
文章编号: 0412 ̄0914(2014)03 ̄0313 ̄05
大花蕙兰 (Cymbidium hybridum)ꎬ又名虎头
兰、喜姆比兰ꎬ兰科、兰属多年生草本植物ꎬ是近几年
我国花卉市场上流行的高档室内盆栽花卉ꎮ 大花蕙
兰的杂交育种已有一百多年的历史ꎬ每年新增加的
品种有几十种之多ꎮ 近年来ꎬ我国检验检疫部门分
别从各入境口岸的进境大花蕙兰中多次发现携带有
菊基腐病菌(Erwinia chrysanthemi)、兰花细菌性褐
腐病菌(Erwinia cypripedii)、建兰花叶病毒(Cym ̄
bidium mosaic virus)等多种病原生物ꎬ均有潜伏期
长、发病率高等特点ꎮ 入境大花蕙兰种苗携带植物
病原细菌、病毒等有害生物隐蔽性强、风险较高ꎮ
2013年 2月ꎬ山东青岛口岸在韩国进境的大花蕙
兰植株中ꎬ发现叶片上有成片的黑褐色斑点ꎬ进而叶
片局部失绿、整片枯黄ꎮ 为确定导致叶片黑斑、褐变
的病原ꎬ实验室采样分离病菌ꎬ通过形态特征、培养特
性、生理生化鉴定、16S rDNA序列分析、PCR和致病
性测定ꎬ对引起大花蕙兰叶片黑斑的病原菌进行了分
离、鉴定和生物学研究ꎬ以期对该病害的防控提供理
论依据ꎮ 鉴于我国没有发生过该病害ꎬ应对其进行深
入研究ꎬ同时加强口岸检疫ꎬ严防该病害传入ꎮ
1 材料与方法
1 1 供试材料
从韩国进口的大花蕙兰鲜活叶片ꎮ
1 2 病菌的分离和纯培养
采用平板划线分离法[1]分离病菌ꎬNA 平板上
28℃培养 72 hꎬ将平板上大多数表现为同一形态的
植物病理学报 44卷
菌落ꎬ挑取其中 3 个菌株ꎬ编号为 LHB1、LHB2、
LHB3ꎬ进行多次纯化ꎮ
1 3 致病性测定
取健康大花蕙兰、蝴蝶兰(Phalaenopsis)为回
接植物ꎮ 新鲜培养的浓度为 106cfumL-1的菌悬
液ꎬ分别针刺接种到大花蕙兰、蝴蝶兰叶片中部ꎬ以
无菌水作对照ꎬ28℃保湿培养ꎮ
取发病明显的大花蕙兰叶片ꎬ按照 1 2重新分
离病原菌ꎮ 用柯赫法则验证 3个菌株的致病性ꎮ
1 4 分离菌株培养特征观察
将菌株在 NA 和 KBA 培养基上培养ꎬ观察菌
落形态及色素产生等情况[ 1 ]ꎮ
1 5 形态特征及生理生化指标测定
参照 Ren 等[ 1 ]方法进行菌株的形态特征观
察、革兰氏染色及常规生理生化指标测定(北京路
桥公司)ꎮ 采用美国 BIOLOG 公司的 Biolog 全自
动微生物鉴定仪进一步测定菌株对 95种不同碳源
利用情况ꎮ
1 6 16S rDNA基因序列分析
采用细菌基因组 DNA 提取试剂盒(天根生化
科技有限公司)提取菌株基因组 DNAꎬ用细菌 16S
通用引物 PF: 5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-
3′和 5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′ 进行
PCR扩增ꎮ PCR反应体系为 25 μL:10×PCR 缓冲
液(含 Mg2+ ) 2 5 μLꎬ dNTP ( 2 5 mmol L-1 )
1 μLꎬTaq DNA 酶(5 UμL-1)0 2 μLꎬ正向引物
和反向引物(5 mmolL-1 )各 1 μLꎬDNA 模板
1 μLꎬ双蒸水补足至 25 μLꎮ PCR 扩增程序为:
94℃ 2 minꎻ 94℃ 45 sꎬ57℃ 45 sꎬ72℃ 2 minꎬ30个
循环ꎻ72℃ 10 minꎮ 扩增产物经纯化后ꎬ由生物公
司测序ꎬ将测得的基因序列与 GenBank 中核酸数
据库进行序列比对分析ꎮ
1 7 PCR检测
参照 Lee等[ 2 ]合成 B gladioli 的特异性引物
(上游引物 5′ - TAACACATGCAAGTCGAACG -
3′ꎬ下游引物 5′ -GGTGTGACGGGCGGTGTGTA ̄
CAAG-3′)ꎬ对菌株 LHB1 基因组进行 PCR 扩增ꎮ
反应体系为 50 μLꎬ反应条件为 94℃ 4 minꎻ94℃
30 sꎬ62℃ 30 sꎬ72℃ 30 sꎬ循环 35 次ꎻ72℃ 5 minꎮ
PCR产物经 2 0%琼脂糖电泳ꎬEB 染色后通过凝
胶成像仪观察ꎮ
2 结果与分析
2 1 致病性测定
分离得到的 3 个菌株对大花蕙兰均有较强的
致病性ꎮ 以 LHB2 为例ꎬ针刺接种叶片 48 h 后接
种点出现黑褐色斑点ꎬ随着病情的进一步扩展ꎬ黑
褐色斑点向周围扩展ꎬ病斑周围偶有黄晕存在ꎬ进
而整片叶片枯黄(图 1Bꎬ1C)ꎬ而对照叶片未见症
状ꎮ 从大花蕙兰接种病变叶片中又分离到与接种
病菌形态一致的病原菌ꎬ经柯赫法则验证ꎬ确认分
离的菌株 LHB1、LHB2、LHB3 为导致大花蕙兰植
株病变的病原细菌ꎮ
Fig. 1 Symptoms of Cymbidium and Phalaenopsis inoculated with the isolated strain LHB2
AꎬD: Negative controlꎻ BꎬCꎬE: Symptoms produced by inoculation with LHB2(AꎬBꎬC: Cymbidium leavesꎻ DꎬE: Phalaenopsis leaves)
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3期 厉 艳ꎬ等:进境韩国大花蕙兰上唐菖蒲伯克氏菌的分离鉴定及生物学研究
Fig. 2 Morphological and cultural characters of the isolated strain LHB2 on NA medium
A: Single colony after 72 h incubationꎻ B: Diffusible yellow pigment secreted into the media
蝴蝶兰叶片在接种部位处出现明显的水浸状
软腐症状(图 1E)ꎬ对照叶片未见症状ꎮ
2 2 培养特征
病原菌在NA培养基上培养 24 h出现肉眼可见的
单菌落ꎬ 72 h后单菌落最大可达 2 mmꎬ表现为白色、圆
形ꎬ隆起、边缘整齐ꎬ光滑不透明ꎮ 在NA培养基上划线
培养后可产生明显的淡黄绿色的非荧光扩散色素(图
2)ꎬ在KBA培养基上紫外灯下观察不产生荧光ꎮ
2 3 形态特征、生理生化特征及 Biolog鉴定
显微镜下菌体呈直或微弯曲杆状ꎬ大小为 1 5
~3 0 μm×0 3~0 5 μmꎬ具 1~2根极生鞭毛ꎬ革兰
氏阴性菌ꎬ其主要细菌学鉴定特征见表 1ꎮ
Table 1 Major bacteriological characteristics of three isolated strains
Bacteriological test
Three isolated strains
LHB1 LHB2 LHB3
Gram staining - - -
Polar flagellum + + +
Endosporum production - - -
Oxidase + + +
Catalase + + +
Arginine dihydrolase - - -
Starch hydrolysis - - -
Levan from sucrose + + +
Tween 80 lipolysis + + +
Gelatin liquefaction + + +
Denitrification - - -
Growth at 42°C - - -
Hypersensitivity of tobacco + + +
Bacterial rot on potato + + +
Bacterial rot on tomato + + +
Utilization of
D-arabinose + + +
D-xylose + + +
Cellobiose + + +
D-ribose + + +
D-fucose + + +
L-Rhamnose - - -
Tryptamide - - -
“+”: Positive reactionꎻ“-”: Negative reaction
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植物病理学报 44卷
经 Biolog全自动鉴定仪碳源分析后ꎬ3 个菌株
与标准菌株的相似值(SIM)分別为 0 894、0 754、
0 872ꎬ可能性值(PROB)分别为 98、99、99ꎬ仪器分
析鉴定 3株菌株为 Burkholderia gladioliꎮ
2 4 16S序列测定及 BLAST比对结果
分别以 3 个菌株的基因组 DNA 为模板进行
PCR扩增ꎬ均获得一条 1 4 kb左右的特异性片段ꎮ
扩增产物经过纯化后进行测序ꎬ将序列与 GenBank
中序列进行 BLAST 比对分析ꎬ结果表明ꎬ该序列
与 B gladioli pv alliicola (GenBank:GU936679 1)
相似性最高ꎬ达到 99%ꎮ
2 5 PCR检测
应用 B gladioli 特异性引物对菌株 LHB1 的
PCR 扩增结果显示ꎬ菌株 LHB1 与 B gladioli
ATCC19302T都扩增出同一条带(约 1 kb)ꎬ阴性对
照没有条带被扩增出来 (图 3)ꎬ判定分离菌株
LHB1为 B gladioli PCR检测阳性ꎮ
Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of PCR
amplification products
M: DL2000 Markerꎻ 1: Burkholderia gladiol ATCC19302Tꎻ
2: The isolated strain LHB1ꎻ 3: Negative control
3 结论与讨论
唐菖蒲伯克氏菌(B gladioli)是重要的植物病
原细菌和人类致病菌ꎮ 该病菌属于肠杆菌科、伯克
氏菌属(Burkholderia)ꎮ 最早于 1913 年发现唐菖
蒲伯克氏菌能够侵染唐菖蒲属植物ꎬ可以从植物伤
口、气孔或皮孔侵入ꎬ深入其内部组织引起发病ꎮ
B gladioli寄主范围广泛ꎬ已报道的寄主包括唐菖
蒲、洋葱、蘑菇、鸢尾花、郁金香、水稻、玉米等ꎮ 该
病菌也是一种人类致病菌ꎬ与人类的肺部感染有
关ꎬ如慢性肉芽肿和胆囊纤维化[ 3 ꎬ 4 ]ꎮ
目前 B gladioli 主要分布在以色列、巴西、澳
大利亚、日本、美国、韩国等国家和地区ꎬ我国大陆
境内尚没有其分布危害的报道ꎮ 2002 ~ 2004 年期
间ꎬ美国夏威夷有 18 个农场的兰花大面积的出现
根腐、叶斑、花枯等病症ꎬ研究后发现病原是
B gladioliꎬ感病兰花的品种涉及蝴蝶兰(Phalae ̄
nopsis)、嘉德利亚兰(Cattleya)、石斛兰(Dendrobi ̄
um)、堇花兰(Miltonia)和文心兰(Oncidium)ꎬ造成
了极大的经济损失ꎬ引起了人们的高度重视[ 5 ]ꎮ
印度等国家已将唐菖蒲伯克氏菌列为禁止入境的
检疫性植物有害生物ꎮ 此次携带病原菌的韩国大
花蕙兰植株为成花苗ꎬ叶片上有黑褐色叶斑ꎬ随着
病程的发展ꎬ叶斑扩展成黄褐色斑块ꎬ进而整株枯
死ꎬ本文是唐菖蒲伯克氏菌侵染大花蕙兰的首次报
道ꎮ
韩国大花蕙兰输华是中韩重要的农产品传统
贸易ꎬ目前每年约 100 万株进口兰花输入国内ꎬ新
品种多、种类繁、来源广ꎬ特别是每年春节前后均出
现进口热潮ꎬ进口量大、货值高ꎬ入境后又会迅速分
销ꎬ病害传播蔓延的风险较高ꎬ一旦有害病原生物
传入ꎬ极易扩撒ꎬ不易防控ꎬ随着兰花贸易需求量的
增大ꎬ我国各口岸进境的兰花品种、数量还会剧增ꎬ
因此及时关注国外兰花新品种上不断出现的新病
害ꎬ加强病害检测新方法的研究以及入境后的隔离
检疫监管ꎬ对保护国内农业生态环境有极大的经济
效益和社会效益ꎮ
致谢:浙江大学生物技术研究所谢关林教授提
供菌株的复核鉴定工作ꎻ中国检验检疫科学院赵文
军研究员提供技术支持ꎮ 一并感谢!
参考文献
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pathogenic bacteria ( in Chinese) [M] Beijing: Chi ̄
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3期 厉 艳ꎬ等:进境韩国大花蕙兰上唐菖蒲伯克氏菌的分离鉴定及生物学研究
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责任编辑:李晖
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