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Isolation, identification and biological characterization of Burkholderia gladioli in Cymbidium imported from Korea

进境韩国大花蕙兰上唐菖蒲伯克氏菌的分离鉴定及生物学研究



全 文 :植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA  44(3): 313 ̄317(2014)
收稿日期: 2013 ̄04 ̄19ꎻ 修回日期: 2013 ̄11 ̄09
基金项目: 国家质检总局项目(2010IK270)
通讯作者: 厉艳ꎬ高级农艺师ꎬ主要从事植物检疫学研究ꎻE ̄mail:standciq@163􀆰 comꎮ
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研究简报
进境韩国大花蕙兰上唐菖蒲伯克氏菌的
分离鉴定及生物学研究
厉 艳∗ꎬ 甘琴华ꎬ 封立平ꎬ 邵秀岭
(山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心ꎬ青岛 266002)
Isolationꎬ identification and biological characterization of Burkholderia gladioli in
Cymbidium imported from Korea   LI YanꎬGAN Qin ̄huaꎬFENG Li ̄pingꎬSHAO Xiu ̄ling   ( In ̄
spection and Quarantine Technology Center of Shandong Entry ̄Exit Inspection and Quarantine BureauꎬQingdao 266002ꎬChina)
Abstract: Three pathogenic bacterial strains were isolated from leaves of Cymbidium imported from Korea
using flat ̄panel method􀆰 The strains were identified and their biological characteristics were studied􀆰 Studies on
morphologicalꎬ culturalꎬ physiological and biochemical characteristics showed that all strains formed whiteꎬ
glossyꎬ convexꎬ opaque and round single colony on nutrient agar (NA) and secreted a significant amount of
yellowish greenꎬ non ̄fluorescent diffusible pigment􀆰 All of these bacteria are Gram ̄negative􀆰 Bacterial cells are
straight or slightly curved rod ̄shapedꎬ with 1 to 2 polar flagella under the microscope􀆰 According to Biologꎬ 16S
rDNA gene sequences analysisꎬ PCR and pathogenicity testꎬ the three strains were identified as Burkholderia
gladiol􀆰 This is the first report of B􀆰 gladiol infecting Cymbidium􀆰
Key words: Cymbidiumꎻ Burkholderia gladiolꎻ identificationꎻ biology
文章编号: 0412 ̄0914(2014)03 ̄0313 ̄05
    大花蕙兰 (Cymbidium hybridum)ꎬ又名虎头
兰、喜姆比兰ꎬ兰科、兰属多年生草本植物ꎬ是近几年
我国花卉市场上流行的高档室内盆栽花卉ꎮ 大花蕙
兰的杂交育种已有一百多年的历史ꎬ每年新增加的
品种有几十种之多ꎮ 近年来ꎬ我国检验检疫部门分
别从各入境口岸的进境大花蕙兰中多次发现携带有
菊基腐病菌(Erwinia chrysanthemi)、兰花细菌性褐
腐病菌(Erwinia cypripedii)、建兰花叶病毒(Cym ̄
bidium mosaic virus)等多种病原生物ꎬ均有潜伏期
长、发病率高等特点ꎮ 入境大花蕙兰种苗携带植物
病原细菌、病毒等有害生物隐蔽性强、风险较高ꎮ
    2013年 2月ꎬ山东青岛口岸在韩国进境的大花蕙
兰植株中ꎬ发现叶片上有成片的黑褐色斑点ꎬ进而叶
片局部失绿、整片枯黄ꎮ 为确定导致叶片黑斑、褐变
的病原ꎬ实验室采样分离病菌ꎬ通过形态特征、培养特
性、生理生化鉴定、16S rDNA序列分析、PCR和致病
性测定ꎬ对引起大花蕙兰叶片黑斑的病原菌进行了分
离、鉴定和生物学研究ꎬ以期对该病害的防控提供理
论依据ꎮ 鉴于我国没有发生过该病害ꎬ应对其进行深
入研究ꎬ同时加强口岸检疫ꎬ严防该病害传入ꎮ
1􀆰 材料与方法
1􀆰 1  供试材料
    从韩国进口的大花蕙兰鲜活叶片ꎮ
1􀆰 2  病菌的分离和纯培养
    采用平板划线分离法[1]分离病菌ꎬNA 平板上
28℃培养 72 hꎬ将平板上大多数表现为同一形态的
 
植物病理学报 44卷
菌落ꎬ挑取其中 3 个菌株ꎬ编号为 LHB1、LHB2、
LHB3ꎬ进行多次纯化ꎮ
1􀆰 3  致病性测定
    取健康大花蕙兰、蝴蝶兰(Phalaenopsis)为回
接植物ꎮ 新鲜培养的浓度为 106cfu􀅰mL-1的菌悬
液ꎬ分别针刺接种到大花蕙兰、蝴蝶兰叶片中部ꎬ以
无菌水作对照ꎬ28℃保湿培养ꎮ
    取发病明显的大花蕙兰叶片ꎬ按照 1􀆰 2重新分
离病原菌ꎮ 用柯赫法则验证 3个菌株的致病性ꎮ
1􀆰 4  分离菌株培养特征观察
    将菌株在 NA 和 KBA 培养基上培养ꎬ观察菌
落形态及色素产生等情况[ 1 ]ꎮ
1􀆰 5  形态特征及生理生化指标测定
    参照 Ren 等[ 1 ]方法进行菌株的形态特征观
察、革兰氏染色及常规生理生化指标测定(北京路
桥公司)ꎮ 采用美国 BIOLOG 公司的 Biolog 全自
动微生物鉴定仪进一步测定菌株对 95种不同碳源
利用情况ꎮ
1􀆰 6  16S rDNA基因序列分析
    采用细菌基因组 DNA 提取试剂盒(天根生化
科技有限公司)提取菌株基因组 DNAꎬ用细菌 16S
通用引物 PF: 5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-
3′和 5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′ 进行
PCR扩增ꎮ PCR反应体系为 25 μL:10×PCR 缓冲
液(含 Mg2+ ) 2􀆰 5 μLꎬ dNTP ( 2􀆰 5 mmol 􀅰 L-1 )
1 μLꎬTaq DNA 酶(5 U􀅰μL-1)0􀆰 2 μLꎬ正向引物
和反向引物(5 mmol􀅰L-1 )各 1 μLꎬDNA 模板
1 μLꎬ双蒸水补足至 25 μLꎮ PCR 扩增程序为:
94℃ 2 minꎻ 94℃ 45 sꎬ57℃ 45 sꎬ72℃ 2 minꎬ30个
循环ꎻ72℃ 10 minꎮ 扩增产物经纯化后ꎬ由生物公
司测序ꎬ将测得的基因序列与 GenBank 中核酸数
据库进行序列比对分析ꎮ
1􀆰 7  PCR检测
    参照 Lee等[ 2 ]合成 B􀆰 gladioli 的特异性引物
(上游引物 5′ - TAACACATGCAAGTCGAACG -
3′ꎬ下游引物 5′ -GGTGTGACGGGCGGTGTGTA ̄
CAAG-3′)ꎬ对菌株 LHB1 基因组进行 PCR 扩增ꎮ
反应体系为 50 μLꎬ反应条件为 94℃ 4 minꎻ94℃
30 sꎬ62℃ 30 sꎬ72℃ 30 sꎬ循环 35 次ꎻ72℃ 5 minꎮ
PCR产物经 2􀆰 0%琼脂糖电泳ꎬEB 染色后通过凝
胶成像仪观察ꎮ
2  结果与分析
2􀆰 1  致病性测定
    分离得到的 3 个菌株对大花蕙兰均有较强的
致病性ꎮ 以 LHB2 为例ꎬ针刺接种叶片 48 h 后接
种点出现黑褐色斑点ꎬ随着病情的进一步扩展ꎬ黑
褐色斑点向周围扩展ꎬ病斑周围偶有黄晕存在ꎬ进
而整片叶片枯黄(图 1Bꎬ1C)ꎬ而对照叶片未见症
状ꎮ 从大花蕙兰接种病变叶片中又分离到与接种
病菌形态一致的病原菌ꎬ经柯赫法则验证ꎬ确认分
离的菌株 LHB1、LHB2、LHB3 为导致大花蕙兰植
株病变的病原细菌ꎮ
Fig. 1  Symptoms of Cymbidium and Phalaenopsis inoculated with the isolated strain LHB2
AꎬD: Negative controlꎻ BꎬCꎬE: Symptoms produced by inoculation with LHB2(AꎬBꎬC: Cymbidium leavesꎻ DꎬE: Phalaenopsis leaves)􀆰
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  3期 厉 艳ꎬ等:进境韩国大花蕙兰上唐菖蒲伯克氏菌的分离鉴定及生物学研究
Fig. 2  Morphological and cultural characters of the isolated strain LHB2 on NA medium
A: Single colony after 72 h incubationꎻ B: Diffusible yellow pigment secreted into the media􀆰
    蝴蝶兰叶片在接种部位处出现明显的水浸状
软腐症状(图 1E)ꎬ对照叶片未见症状ꎮ
2􀆰 2  培养特征
    病原菌在NA培养基上培养 24 h出现肉眼可见的
单菌落ꎬ 72 h后单菌落最大可达 2 mmꎬ表现为白色、圆
形ꎬ隆起、边缘整齐ꎬ光滑不透明ꎮ 在NA培养基上划线
培养后可产生明显的淡黄绿色的非荧光扩散色素(图
2)ꎬ在KBA培养基上紫外灯下观察不产生荧光ꎮ
2􀆰 3  形态特征、生理生化特征及 Biolog鉴定
    显微镜下菌体呈直或微弯曲杆状ꎬ大小为 1􀆰 5
~3􀆰 0 μm×0􀆰 3~0􀆰 5 μmꎬ具 1~2根极生鞭毛ꎬ革兰
氏阴性菌ꎬ其主要细菌学鉴定特征见表 1ꎮ
Table 1  Major bacteriological characteristics of three isolated strains
Bacteriological test
Three isolated strains
LHB1 LHB2 LHB3
Gram staining - - -
Polar flagellum + + +
Endosporum production - - -
Oxidase + + +
Catalase + + +
Arginine dihydrolase - - -
Starch hydrolysis - - -
Levan from sucrose + + +
Tween 80 lipolysis + + +
Gelatin liquefaction + + +
Denitrification - - -
Growth at 42°C - - -
Hypersensitivity of tobacco + + +
Bacterial rot on potato + + +
Bacterial rot on tomato + + +
Utilization of
D-arabinose + + +
D-xylose + + +
Cellobiose + + +
D-ribose + + +
D-fucose + + +
L-Rhamnose - - -
Tryptamide - - -
  “+”: Positive reactionꎻ“-”: Negative reaction􀆰
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植物病理学报 44卷
    经 Biolog全自动鉴定仪碳源分析后ꎬ3 个菌株
与标准菌株的相似值(SIM)分別为 0􀆰 894、0􀆰 754、
0􀆰 872ꎬ可能性值(PROB)分别为 98、99、99ꎬ仪器分
析鉴定 3株菌株为 Burkholderia gladioliꎮ
2􀆰 4  16S序列测定及 BLAST比对结果
    分别以 3 个菌株的基因组 DNA 为模板进行
PCR扩增ꎬ均获得一条 1􀆰 4 kb左右的特异性片段ꎮ
扩增产物经过纯化后进行测序ꎬ将序列与 GenBank
中序列进行 BLAST 比对分析ꎬ结果表明ꎬ该序列
与 B􀆰 gladioli pv􀆰 alliicola (GenBank:GU936679􀆰 1)
相似性最高ꎬ达到 99%ꎮ
2􀆰 5  PCR检测
    应用 B􀆰 gladioli 特异性引物对菌株 LHB1 的
PCR 扩增结果显示ꎬ菌株 LHB1 与 B􀆰 gladioli
ATCC19302T都扩增出同一条带(约 1 kb)ꎬ阴性对
照没有条带被扩增出来 (图 3)ꎬ判定分离菌株
LHB1为 B􀆰 gladioli PCR检测阳性ꎮ
Fig. 3   Agarose gel electrophoresis of PCR
amplification products
M: DL2000 Markerꎻ 1: Burkholderia gladiol ATCC19302Tꎻ
2: The isolated strain LHB1ꎻ 3: Negative control􀆰
3  结论与讨论
    唐菖蒲伯克氏菌(B􀆰 gladioli)是重要的植物病
原细菌和人类致病菌ꎮ 该病菌属于肠杆菌科、伯克
氏菌属(Burkholderia)ꎮ 最早于 1913 年发现唐菖
蒲伯克氏菌能够侵染唐菖蒲属植物ꎬ可以从植物伤
口、气孔或皮孔侵入ꎬ深入其内部组织引起发病ꎮ
B􀆰 gladioli寄主范围广泛ꎬ已报道的寄主包括唐菖
蒲、洋葱、蘑菇、鸢尾花、郁金香、水稻、玉米等ꎮ 该
病菌也是一种人类致病菌ꎬ与人类的肺部感染有
关ꎬ如慢性肉芽肿和胆囊纤维化[ 3 ꎬ 4 ]ꎮ
    目前 B􀆰 gladioli 主要分布在以色列、巴西、澳
大利亚、日本、美国、韩国等国家和地区ꎬ我国大陆
境内尚没有其分布危害的报道ꎮ 2002 ~ 2004 年期
间ꎬ美国夏威夷有 18 个农场的兰花大面积的出现
根腐、叶斑、花枯等病症ꎬ研究后发现病原是
B􀆰 gladioliꎬ感病兰花的品种涉及蝴蝶兰(Phalae ̄
nopsis)、嘉德利亚兰(Cattleya)、石斛兰(Dendrobi ̄
um)、堇花兰(Miltonia)和文心兰(Oncidium)ꎬ造成
了极大的经济损失ꎬ引起了人们的高度重视[ 5 ]ꎮ
印度等国家已将唐菖蒲伯克氏菌列为禁止入境的
检疫性植物有害生物ꎮ 此次携带病原菌的韩国大
花蕙兰植株为成花苗ꎬ叶片上有黑褐色叶斑ꎬ随着
病程的发展ꎬ叶斑扩展成黄褐色斑块ꎬ进而整株枯
死ꎬ本文是唐菖蒲伯克氏菌侵染大花蕙兰的首次报
道ꎮ
    韩国大花蕙兰输华是中韩重要的农产品传统
贸易ꎬ目前每年约 100 万株进口兰花输入国内ꎬ新
品种多、种类繁、来源广ꎬ特别是每年春节前后均出
现进口热潮ꎬ进口量大、货值高ꎬ入境后又会迅速分
销ꎬ病害传播蔓延的风险较高ꎬ一旦有害病原生物
传入ꎬ极易扩撒ꎬ不易防控ꎬ随着兰花贸易需求量的
增大ꎬ我国各口岸进境的兰花品种、数量还会剧增ꎬ
因此及时关注国外兰花新品种上不断出现的新病
害ꎬ加强病害检测新方法的研究以及入境后的隔离
检疫监管ꎬ对保护国内农业生态环境有极大的经济
效益和社会效益ꎮ
    致谢:浙江大学生物技术研究所谢关林教授提
供菌株的复核鉴定工作ꎻ中国检验检疫科学院赵文
军研究员提供技术支持ꎮ 一并感谢!
参考文献
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责任编辑:李晖
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