全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４４(３): ２８７￣２９４(２０１４)
收稿日期: ２０１３￣０４￣２７ꎻ 修回日期: ２０１３￣１１￣０８
基金项目: 国家自然科学基金项目(３１１７１７９９)ꎻ转基因重大专项(２０１１ＺＸ０８００５￣００２)
通讯作者: 戴小枫ꎬ研究员ꎬ主要从事植物病理学研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｄａｉｘｉａｏｆｅｎｇ＠ｃａａｓ.ｃｎ
第一作者: 肖红利ꎬ女ꎬ陕西汉中人ꎬ博士研究生ꎬ主要从事棉花真菌病害研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｈｌｘｉａｏ２００２＠１６３.ｃｏｍꎮ
大丽轮枝菌侵染抗感棉种的组织学过程观察
肖红利ꎬ 孔志强ꎬ 包郁明ꎬ 赵凤轩ꎬ 柳少燕ꎬ 李 蕾ꎬ 陈捷胤ꎬ 戴小枫∗
(中国农业科学院农产品加工研究所ꎬ北京 １００１９３)
摘要:棉花黄萎病是一种极难防治的土传性真菌病害ꎬ研究病原菌侵染棉花的组织学过程对致病机理解析和抗病资源利用具
有重要意义ꎮ 本研究利用绿色荧光蛋白标记的大丽轮枝菌系统研究了其对抗病棉种海岛棉 ７１２４和三裂棉、感病棉种军棉
１号和戴维逊棉的侵染过程ꎮ 结果表明ꎬ大丽轮枝菌对抗 /感棉种的初始侵染没有明显差异ꎬ接菌 ５ ｈ后ꎬ分生孢子均能吸附在
感病和抗病棉种的根表面ꎮ 但侵染过程存在显著差异ꎬ侵染感病棉种中病原菌 ３~５ ｄ到达皮层ꎬ５~７ ｄ达到维管束ꎬ随后迅速
扩展繁殖ꎬ侵染 １４ ｄ后即完成系统侵染ꎬ并开始产生黄萎病症状ꎻ而病原菌侵染抗病棉种ꎬ５~７ ｄ才侵入皮层ꎬ７~１０ ｄ到达维
管束ꎬ１４ ｄ后仍无法扩展ꎬ病原菌的定殖与发展受到限制ꎬ无法形成系统侵染ꎬ较少形成黄萎病症状ꎮ 本研究通过绿色荧光蛋
白标记大丽轮枝菌对抗 /感棉种的侵染过程研究ꎬ为大丽轮枝菌致病机理研究和抗性资源利用提供了强有力的理论依据ꎮ
关键词:黄萎病ꎻ 大丽轮枝菌ꎻ 绿色荧光蛋白ꎻ 抗 /感棉花ꎻ 侵染过程
Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｔｔｏｎ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ 　 ＸＩＡＯ Ｈｏｎｇ￣ｌｉꎬ
ＫＯＮＧ Ｚｈｉ￣ｑｉａｎｇꎬ ＢＡＯ Ｙｕ￣ｍｉｎｇꎬ ＺＨＡＯ Ｆｅｎｇ￣ｘｕａｎꎬ ＬＩＵ Ｓｈａｏ￣ｙａｎꎬ Ｌｉ Ｌｅｉꎬ ＣＨＥＮ Ｊｉｅ￣ｙｉｎꎬ ＤＡＩ Ｘｉａｏ￣ｆｅｎｇ
( Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｇｒｏ￣Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９３ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｃｏｔｔｏｎ ｗｉｌｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｏｉｌ￣ｂｏｒｎｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｗｉｌｔ ｆｕｎｇｕｓ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ａｎｄ
ｄａｍａｇｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ. Ｉｔ ｉｓ ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｔｏ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｚｅ ｔｈｅ ｈｏｓｔ
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ. Ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ￣ｔａｇｇｅｄ ｉｓｏｌａｔｅ ｏｆ
Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｔｔｏｎ ｓｐｅｃｉｅｓ. Ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｏｔｔｏｎ
ｇｒｏｕｐ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ ｃｖ. Ｈａｉ７１２４ ａｎｄ Ｇ. ｔｒｉｌｏｂｕｍ ａｎｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｏｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｇ. ｈｉｒｓｕ￣
ｔｕｍ ｃｖ. Ｊｕｎｍｉａｎ１ ａｎｄ Ｇ. ｄａｖｉｄｓｏｎｉｉ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｏｂｖｉｏｕｓ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｃｏｎｉｄｉａ ａｄｓｏｒｂｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｒｏｏｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ａｌｌ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｃｏｔ￣
ｔｏｎ ５ ｈｏｕｒｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ. Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｓｈｏｗｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ
ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｏｔｔｏｎ. Ｉｎ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｃｏｔｔｏｎꎬ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｏｒｔｅｘ ３ ｔｏ ５ ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎꎬ
ａｎｄ ｃｏｌｏｎｉｚｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ５ ｔｏ ７ ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎꎬ ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｗａｓ ｓｐｒｅａｄ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｅｄ ｑｕｉｃｋ￣
ｌｙ. Ｔｈｅ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｃｈｉｅｖｅｄ １４ ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｒｍｅｄ ｔｈｅ ｓｙｍｐｔｏｍ ｏｆ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｗｉｌｔ. Ｔｈｅ
ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｔｏ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｏｔｔｏｎ ｉｓ ａ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｓｌｏｗ ｐｒｏｃｅｓｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｏ ｃｏｒｔｅｘ ５ ｔｏ ７
ｄａｙｓ ａｎｄ ｔｏ ｖａｓｃｕｌａｒ ｔｉｓｓｕｅ ７ ｔｏ １０ ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ. Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｃａｎｎｏｔ ｓｐｒｅａｄ １４ ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ ｔｏ ｆｉｎｉｓｈ ｔｈｅ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ. Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎬ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏ￣
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｏｔｔｏｎ ｄｅｌａｙｅｄ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｃｏｔｔｏｎ. Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅꎬ ｔｈｅ ｒｅ￣
ｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｔｏ ｃｏｔｔｏｎ ｉｓ ｍｅａｎｉｎｇｆｕｌ ｔｏ ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｒｅｓｏｕｒｃｅ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｗｉｌｔꎻ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅꎻ ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎꎻ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｏｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ
ｃｏｔｔｏｎꎻ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ
　
植物病理学报 ４４卷
中图分类号: Ｓ４３２.４４　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０３￣０２８７￣０８
　 　 棉花黄萎病主要病原菌是大丽轮枝菌(Ｖｅｒｔｉ￣
ｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ Ｋｌｅｂ.)ꎬ隶属于轮枝菌属ꎬ在世界各
植棉区均有危害ꎬ可导致棉花叶片变黄萎蔫甚至枯
死ꎬ严重影响棉花的产量和品质ꎬ给棉花生产带来
了巨大的经济损失ꎮ 同时还为害蕃茄、茄子、辣椒、
黄瓜、莴苣等 ２００ 种主要经济作物ꎬ是世界性的重
大植物病害[１~２]ꎮ 我国棉花黄萎病尤为严重ꎬ已经
成为棉花生产上第一大病害ꎬ１９９３ 年该病在全国
大爆发ꎬ发病面积达当年植棉面积的 ５０％、流行面
积 ２６７万 ｈａ、绝收的重病田 １３.８万 ｈａꎬ损失皮棉超
过 １亿多 ｋｇꎬ占全年产量的 ２０％ꎻ１９９５、１９９６、２００２
和 ２００３年以来连年爆发ꎬ常年给棉花生产平均造
成 １０％~１５％的产量损失ꎬ给棉花生产造成沉重打
击[３~５]ꎮ
　 　 棉花黄萎病发病初期叶片边缘或主脉之间呈
现淡黄色不规则斑块ꎬ随后病斑边缘至中心的颜色
逐渐加深ꎬ呈褐色掌状斑驳ꎬ顶叶向下卷曲褪绿、叶
片突然萎蔫ꎬ最后变色部位的叶缘和斑驳组织逐渐
枯焦ꎬ呈现“花西瓜皮”症状ꎬ并变成褐色干枯ꎬ严
重时表现出急性萎蔫落叶症状ꎬ直至植株枯死[６]ꎮ
但不同棉种对黄萎病菌的抗性(组织结构抗性、诱
导抗性等)不同ꎬ表现出的症状也存在差异ꎬ如抗
病品种(冀 ３２８￣１)的导管细胞排列比感病品种(泗
棉 ２号)紧凑ꎬ细胞数量的增加导致细胞间隙的减
小ꎬ能够提高棉花机械抗病性能ꎬ大丽轮枝菌表现
为在感病品种中快速繁殖ꎬ而抗病品种发病程度较
轻[７]ꎮ 因此ꎬ大丽轮枝菌侵染植物是一个复杂的
过程ꎬ其对不同寄主或者同一寄主不同抗性的侵染
过程存在差异ꎮ
　 　 侵染前ꎬ存在于土壤中的微菌核经萌发并与根
部表面相互接触后开始生长蔓延ꎬ这些菌丝起初在
根表面是随机分布的ꎬ但是后来菌丝开始聚集在一
起ꎬ萌发受土壤的温度、ｐＨ 值、有机质以及植物根
系分泌物等条件影响[８ ~ １０]ꎮ 侵入过程中ꎬ根尖的
根冠、分生区、伸长区和成熟区均能够成为侵入位
点ꎬ应用绿色荧光蛋白基因标记大丽轮枝菌研究其
在莴苣整个生长期侵染的情况发现ꎬ接菌 ５ ｄ 后ꎬ
在根尖伸长区能观察到大量病原菌ꎬ这些病原菌在
表皮细胞间隙内生长并形成了复杂的菌丝网络ꎬ２
周后菌丝开始在皮层中定殖[１１]ꎻ大丽轮枝菌对甘
蓝型油菜的侵染仅局限于植株的根毛区ꎬ在接菌
２４ ｈ后ꎬ菌丝在根毛表面相互交织ꎬ并且沿着根毛
向根表面方向生长[１２]ꎻ长孢轮枝菌 (Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ
ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍ)和大丽轮枝菌侵染油菜根部时主要
从植物的侧根和根毛区侵染[１３]ꎮ 侵入维管束后ꎬ
菌丝会通过纹孔侵染邻近的导管ꎬ有时在缘纹孔处
能观察到附着胞ꎮ 当病原菌到达导管细胞的端壁
或缘纹孔时ꎬ侵染的菌丝会受到一定的限制ꎬ这时
病原菌会形成芽管ꎬ使其沿着彼此相邻的导管分子
向植株的顶端生长或者沿着导管壁上的纹孔向邻
近的导管扩展[１４]ꎮ 随后病原菌不断繁殖并阻塞导
管ꎬ影响寄主水分的运输ꎬ造成植株缺水ꎬ从而产生
萎蔫症状[１]ꎮ 然而ꎬ关于大丽轮枝菌是如何侵入
棉花根系ꎬ在根系维管束内如何扩展以及在抗 /感
品种之间侵染的差异仍不清楚ꎮ
　 　 栽培棉种陆地棉缺乏抗性资源ꎬ部分海岛棉和
野生棉种虽然对黄萎病表现出抗性ꎬ但对其与病原
菌互作的过程不清楚ꎬ缺乏筛选抗性材料的依据ꎮ
本研究通过绿色荧光蛋白标记的大丽轮枝菌接种
抗病棉种三裂棉 (Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｔｒｉｌｏｂｕｍ)和海岛棉
７１２４(Ｇ. ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ ｃｖ. Ｈａｉ７１２４)ꎬ感病棉种戴维
逊棉(Ｇ. ｄａｖｉｄｓｏｎｉｉ)和军棉 １ 号(Ｇ. ｈｉｒｓｕｔｕｍ ｃｖ.
Ｊｕｎｍｉａｎ１)幼苗的根系ꎬ观察其在抗 /感棉种中侵
入、定殖和扩展过程的差异ꎬ为最终棉花抗黄萎病
材料的筛选提供理论依据ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 材料
　 　 供试棉种是三裂棉、戴维逊棉、海岛棉 ７１２４ 和
军棉 １号ꎬ为中国农业科学院棉花研究所王坤波研
究员馈赠ꎮ 高致病性大丽轮枝菌Ｖｄ９９１为中国农业
科学院植物保护研究所简桂良研究员馈赠ꎮ 携带有
绿色荧光蛋白基因 ｓＧＦＰ(ｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓ￣
ｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ)标记的大丽轮枝菌 Ｖｄ￣ｇｆｐ７７为本
实验室构建ꎬ通过农杆菌介导法转化大丽轮枝菌
Ｖｄ９９１获得ꎬ随机插入转化子 Ｖｄ￣ｇｆｐ７７可发强烈的
荧光ꎬ生长表型和致病力与野生型 Ｖｄ９９１类似ꎮ
１.２　 棉花材料和病原菌的培养与抗病性鉴定
　 　 棉花种子于 ５％ ＮａＣｌＯ溶液中浸泡 ２０ ｍｉｎ 后
８８２
　
　 ３期 肖红利ꎬ等:大丽轮枝菌侵染抗感棉种的组织学过程观察
用无菌水反复漂洗 ５次ꎬ再将种子转移到盛有适量
无菌水的三角瓶中ꎬ２５℃恒温培养 ２ ｄꎬ萌发的种子
转移到经高压灭菌 ２ ｈ的蛭石中继续培养(光周期
１４ ｈꎬ白天 ２５℃ꎬ晚上 ２１℃ꎬ相对湿度 ８５％)ꎮ
　 　 带有绿色荧光蛋白基因标记的大丽轮枝菌接
种于查比克培养基中(硝酸钠ꎬ２.０ ｇ / Ｌꎻ氯化钾ꎬ
０.５ ｇ / Ｌꎻ七水合硫酸亚铁ꎬ０.０１８ ｇ / Ｌꎻ磷酸二氢钾ꎬ
１.０ ｇ / Ｌꎻ硫酸镁ꎬ０.５ ｇ / Ｌꎻ蔗糖ꎬ３０.０ ｇ / Ｌ)ꎬ２５℃振
荡培养 ７ ｄꎬ双层纱布过滤后ꎬ制备 ５×１０６ ＣＦＵ / ｍＬ
的孢子悬浮液备用ꎮ 抗病性鉴定方法参照 Ｒａｍｓａｙ
等[１５]方法进行ꎬ待棉花幼苗子叶平展后ꎬ在无菌的
条件下拔出棉苗ꎬ根系用无菌水冲洗后置于孢子悬
浮液中 ２ ｍｉｎꎬ每个棉种接种 １５ 株ꎬ３ 个重复ꎬ以无
菌水为对照ꎮ 将接菌的幼苗转移到新灭菌的蛭石
中ꎬ在上述培养条件下培养ꎬ期间保持培养基质的
湿度ꎬ在接菌后的第 ２、３、４、５和 ６周调查病情ꎮ
１.３　 大丽轮枝菌接种棉花的组织切片和显微观察
　 　 同样的方法接种棉花ꎬ每个棉种接种 ４５株ꎬ以
无菌水作对照ꎮ 接菌的幼苗转移到新灭菌的蛭石
中继续培养ꎬ接菌后 ５ ｈ、０.５ ｄ、１ ｄ、３ ｄ、５ ｄ、７ ｄ、１０
ｄ和 １４ ｄ取样ꎬ每次取 ３~５株ꎮ
　 　 取出的幼苗用无菌水冲洗后ꎬ对棉苗的根部和
茎部组织进行徒手切片或冷冻切片ꎬ徒手切片切片
厚度约 １００ μｍꎬ冷冻切片厚度为 ７０ μｍꎬ荧光染料
碘化丙啶的使用浓度为 １０ μｍｏｌ / ｍＬꎮ 借助激光
共聚焦扫描显微镜观察大丽轮枝菌的侵染过程ꎬ绿
色荧光蛋白和碘化丙啶的激发光波长均为 ４８８
ｎｍꎬ发射光波长分别为 ５４０ ｎｍ 和 ５６０ ~ ６７０ ｎｍꎮ
观测指标包括孢子萌发的时间、初始侵入点的发生
部位、是否产生附着胞、菌丝形态变化、病原菌在寄
主体内定殖和扩展、病原菌的系统侵染ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 四个棉种对大丽轮枝菌的抗病性鉴定
　 　 大丽轮枝菌接种 ４ 个棉种(三裂棉、戴维逊
棉、海岛棉 ７１２４和军棉 １号)表现出抗病和感病 ２
种症状ꎮ 军棉 １ 号和戴维逊棉对大丽轮枝菌表现
为高敏感性ꎬ接菌 ４ 周后ꎬ病情指数分别为 ７８.３３±
８.８４和 ６８.３３±６.２１ꎬ侵染 ６ 周后植株几乎全部死
亡ꎬ属于高感大丽轮枝菌品种ꎮ 而海岛棉 ７１２４ 和
三裂棉则对大丽轮枝菌表现出抗性ꎬ接种 ６周后三
裂棉的病情指数仅为 １３.３３±１.９８ꎬ无植株死亡ꎬ属
于高抗 /免疫棉种ꎻ尽管大丽轮枝菌侵染海岛棉
７１２４在 ２ 周后病指达到了 ３１.６６±４.２１ꎬ但后期病
症发展缓慢ꎬ４周后为 ４０.５６±４.８３ꎬ６周后为 ５８.３３±
５.９３ꎬ植株死亡率仅为 ６.６７％ꎬ属于抗病棉种(图
１)ꎮ 说明大丽轮枝菌侵染不同抗性棉种的能力存
在差异ꎬ即其侵染过程不同ꎮ
Ｆｉｇ. １　 Ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎｄｅｘ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｃｏｔｔｏｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ
９８２
　
植物病理学报 ４４卷
２.２　 大丽轮枝菌侵入棉花根系前的组织学观察
　 　 感病棉种(军棉 １ 号和戴维逊棉)和抗病棉种
(海岛棉 ７１２４和三裂棉)接种于浓度为 ５×１０６ ＣＦＵ /
ｍＬ 的大丽轮枝菌 Ｖｄ￣ｇｆｐ７７孢子悬浮液 ５ ｈ后ꎬ４个
棉种的根部组织均吸附了分生孢子ꎬ这些孢子随机
分布ꎬ但尚未萌发(图 ２)ꎮ 由于野生棉的根系较为
脆弱ꎬ在拔出幼苗接种时ꎬ根系组织受到较强的机械
损伤ꎬ因此ꎬ相对于陆地棉和海岛棉ꎬ野生棉种根部
组织吸附孢子的数量较多(图 ２￣Ｂ、Ｄ)ꎮ
２.３　 大丽轮枝菌侵染感病棉花过程的组织学观察
　 　 大丽轮枝菌侵染棉花的过程从表皮开始ꎬ通过
皮层ꎬ最后到达维管束组织ꎬ定殖并扩展繁殖ꎮ 组
织切片观察发现ꎬ接菌 ０.５ ｄ后ꎬ感病棉种军棉 １号
根表面的孢子开始萌发ꎬ戴维逊棉根表面的孢子萌
发略晚ꎬ约 １ ｄꎬ孢子萌发后形成短小的菌丝ꎬ在细
胞间扩展或者直接侵入表皮细胞ꎬ侵入过程未观察
到附着胞(图 ３￣Ａ、Ｂ)ꎮ 接菌 ３ ｄ 后菌丝扩展到军
棉 １号根部组织的皮层ꎬ根表面的孢子大量萌发ꎬ
菌丝聚集在根冠区ꎬ形成复杂的菌丝网络(图 ３￣
Ｃ)ꎬ大丽轮枝菌侵染戴维逊棉根部组织 ５ ｄ后菌丝
扩展到皮层ꎬ菌丝随机扩散(图 ３￣Ｄ)ꎮ 接菌 ５ ｄ
后ꎬ菌丝侵入到军棉 １ 号的维管束组织ꎬ在维管束
内可以观察到菌丝释放的绿色荧光(图 ３￣Ｅ)ꎻ在戴
维逊棉中ꎬ接菌 ７ ｄ后ꎬ菌丝侵入到维管组织ꎬ但仅
限于个别导管(图 ３￣Ｆ)ꎮ 接菌 １４ ｄ后ꎬ大丽轮枝菌
已经侵染到军棉 １号茎部的维管组织ꎬ并向植株顶
端方向扩展ꎬ菌丝向导管四周扩展并侵染邻近的导
管(图 ３￣Ｇ、Ｈ)ꎻ戴维逊棉则出现了萎蔫和褪绿症
状ꎬ根尖顶端存在大量菌丝ꎬ并已经深入到根部组
织内部(图 ３￣Ｉ)ꎬ木质部内能检测到释放绿色荧光
的菌丝(图 ３￣Ｊ)ꎮ 结果表明ꎬ大丽轮枝菌侵入感病
棉种的表皮组织约在 ０.５~１ ｄꎬ３~５ ｄ后到达皮层ꎬ
５~７ ｄ侵入维管束ꎬ１４ ｄ后大丽轮枝菌在维管束组
织成功定殖并大量繁殖ꎬ完成了对棉花系统侵染ꎮ
Ｆｉｇ. ２　 Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｓｐｏｒｅ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｔｏ ｔｈｅ ｒｏｏｔ
ｏｆ ４ ｃｏｔｔｏｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ５ ｈｏｕｒｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
Ａ: ｃｖ. Ｊｕｎｍｉａｎ１ꎻ Ｂ: Ｇ. ｔｒｉｌｏｂｕｍꎻ Ｃ: ｃｖ. Ｈａｉ７１２４ꎻ Ｄ: Ｇ. ｄａｖｉｄｓｏｎｉｉ.
２.４　 大丽轮枝菌侵染抗病棉花过程的组织学观察
　 　 海岛棉 ７１２４ 根表面的孢子在接菌 ３ ｄ 后才开
始萌发(图 ４￣Ａ)ꎬ而高抗棉种三裂棉则要 ５ ｄꎬ孢子
萌发后形成的菌丝主要从根冠区或者根部受损伤
的区域侵入ꎬ侵入过程同样未观察到附着胞(图 ４￣
Ｂ ) ꎮ接菌第５ ｄ和第 ７ ｄ后 ꎬ大丽轮枝菌分别侵
０９２
　
　 ３期 肖红利ꎬ等:大丽轮枝菌侵染抗感棉种的组织学过程观察
Ｆｉｇ. ３　 Ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ ｉｎ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｃｏｔｔｏｎｓ
Ａ / Ｂ: ｔｈｅ ｃｏｎｉｄｉａ ｇｅｍｉｎａｔｅｄ ｔｏ ｈｙｐｈａｅ ｏｎｅ ｄａｉ (ｄａｙ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ) ｉｎ Ｇ. ｄａｖｉｄｓｏｎｉｉꎻ Ｃ: ｔｈｅ ｈｙｐｈａｅ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ
ｒｏｏｔ ｃａｐ ｏｆ ｃｖ. Ｊｕｎｍｉａｎ１ ｔｈｒｅｅ ｄａｉꎻ Ｄ: ｔｈｅ ｈｙｐｈａｅ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｒｔｅｘ ｏｆ Ｇ. ｄａｖｉｄｓｏｎｉｉ ｆｉｖｅ ｄａｉꎻ
Ｅ: Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｉｎ ｔｈｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｃｖ. Ｊｕｎｍｉａｎ１ ｆｉｖｅ ｄａｉꎻ Ｆ: Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｉｎ ｔｈｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｏｆ Ｇ. ｄａｖｉｄｓｏｎｉｉ ｓｅｖｅｎ ｄａｉꎻ
Ｇ / Ｈ: Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｏｆ ｃｖ. Ｊｕｎｍｉａｎ１ １４ ｄａｉꎻ Ｉ: ｔｈｅ ｈｙｐａｅ ｐｅｎｅｔｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｒｏｏｔ ｓｙｓｔｅｍｓ
ｏｆ Ｇ. ｄａｖｉｄｓｏｎｉｉ １４ ｄａｉꎻ Ｊ: Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｒｅａｃｈｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｘｙｌｅｍ ｏｆ Ｇ. ｄａｖｉｄｓｏｎｉｉ.
Ｆｉｇ. ４　 Ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ ｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｏｔｔｏｎｓ
Ａ: ｔｈｅ ｃｏｎｉｄｉａ ｇｅｍｉｎａｔｅｄ ｔｏ ｈｙｐｈａｅ ｔｈｒｅｅ ｄａｉ ｉｎ ｃｖ. Ｈａｉ７１２４ꎻ Ｂ: ｔｈｅ ｃｏｎｉｄｉａ ｇｅｍｉｎａｔｅｄ ｔｏ ｈｙｐｈａｅ ｆｉｖｅ ｄａｉ ｉｎ Ｇ. ｔｒｉｌｏｂｕｍꎻ
Ｃ: Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｓｐｒｅａｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｏｒｔｅｘ ｏｆ ｃｖ. Ｈａｉ７１２４ ｆｉｖｅ ｄａｉꎻ Ｄ: Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｓｐｒｅａｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｏｒｔｅｘ ｏｆ Ｇ. ｔｒｉｌｏｂｕｍ ｓｅｖｅｎ ｄａｉꎻ
Ｅ: Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｒｅａｃｈｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｏｆ ｃｖ. Ｈａｉ７１２４ ｓｅｖｅｎ ｄａｉꎻ Ｆ: Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｒｅａｃｈｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｏｆ Ｇ. ｔｒｉｌｏｂｕｍ １０ ｄａｉꎻ
Ｇ / Ｈ: ｔｈｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｖ. Ｈａｉ７１２４ １４ ｄａｉꎻ Ｉ: ｔｈｅ ｈｙｐｈａｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒｏｏｔ ｔｉｐ ｏｆ Ｇ. ｔｒｉｌｏｂｕｍ ｏｆ １４ ｄａｉꎻ
Ｊ: ｔｈｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇ. ｔｒｉｌｏｂｕｍ １４ ｄａｉ.
入海岛棉 ７１２４和三裂棉的皮层组织(图 ４￣Ｃ、Ｄ)ꎮ
侵染 ７ ｄ 后ꎬ大丽轮枝菌侵入到海岛棉 ７１２４ 的维
管束组织(图 ４￣Ｅ)ꎬ而侵入三裂棉的维管束组织则
需 １０ ｄꎬ侵入维管组织后的菌丝相互交织并沿着根
１９２
　
植物病理学报 ４４卷
纵轴方向生长(图 ４￣Ｆ)ꎮ 接菌 １４ ｄ 后ꎬ在海岛棉
７１２４的维管组织中能观察到零散分布的菌丝(图
４￣Ｇ)ꎬ茎基部组织连续纵切实验表明仅少数的导
管被大丽轮枝菌侵染ꎬ大部分导管没有观察到菌丝
(图 ４￣Ｈ)ꎻ类似地ꎬ抗病棉种三裂棉接菌 １４ ｄ 后ꎬ
尽管根尖顶端处仍能观察到大量的菌丝(图 ４￣Ｉ)ꎬ
但均未能侵入维管束ꎬ仅能观察到少数的菌丝存在
于维管组织(图 ４￣Ｊ)ꎮ 结果说明ꎬ大丽轮枝菌侵染
抗病棉种海岛棉 ７１２４ 和三裂棉的过程则相对缓
慢ꎬ３~５ ｄ孢子萌发ꎬ５~７ ｄ侵入皮层ꎬ７~１０ ｄ扩展
到维管束组织ꎬ但无法完成系统侵染ꎬ１４ ｄ 后只有
少数菌丝在维管束中得到定殖ꎮ
２.５　 大丽轮枝菌对抗病和感病棉花侵染过程的差异
　 　 通过大丽轮枝菌对抗病和感病棉种侵染过程
的比较分析表明ꎬ病原菌侵染感病棉种的过程显著
快于抗病棉种ꎬ３~ ５ ｄ 到达皮层ꎬ５ ~ ７ ｄ 达到维管
束ꎬ随后迅速扩展繁殖ꎬ侵染 １４ ｄ 后即完成系统侵
染ꎬ并开始产生黄萎病症状ꎻ而侵入抗病棉种的皮
层相对较晚ꎬ需要 ５ ~ ７ ｄꎬ７ ~ １０ ｄ 到达维管束ꎬ但
病原菌的定殖与扩展受到限制ꎬ１４ ｄ 后仍无法扩
展ꎬ较少形成黄萎病症状(表 １)ꎬ结果说明ꎬ相对于
感病棉种ꎬ抗病棉种的组织结构抗性和生理生化抗
性延缓了大丽轮枝菌的侵染ꎮ
３　 讨论
　 　 大丽轮枝菌是引起棉花黄萎病的毁灭性病原
真菌ꎬ其致病机理复杂ꎬ潜伏期和侵染周期长ꎬ侵染
途径不清楚ꎮ 本研究利用携带绿色荧光蛋白标记
的大丽轮枝菌 Ｖｄ￣ｇｆｐ７７鉴定了其对抗病和感病棉
种(２个栽培种和 ２个野生种)的侵染过程ꎬ发现了
大丽轮枝菌对棉花的侵染过程与棉种的抗性显著
相关ꎬ即无论是栽培种还是野生种ꎬ大丽轮枝菌侵
染感病棉种的过程显著快于抗病棉种ꎮ
　 　 研究发现ꎬ大丽轮枝菌对抗 /感棉种的初始侵
染没有明显差异ꎬ在接菌 ５ ｈ 内ꎬ分生孢子均能吸
附在感病和抗病棉种的根表面(图 ２)ꎮ 这与前人
的研究结果类似ꎬ即无论寄主对大丽轮枝菌表现为
抗病还是感病ꎬ病原菌均能定殖在其根表面[１６]ꎮ
一般认为ꎬ大丽轮枝菌侵染寄主的位点为根毛区、
根尖伸长区、根冠区或者侧根萌发处ꎬ如大丽轮枝
菌侵染油菜 ２４ ｈ后ꎬ大丽轮枝菌局限于根毛区ꎬ其
菌丝沿着根毛朝主根方向生长[１２]ꎬ对红豆草根部
的侵染是从根冠区开始[１７]ꎬ同为维管束病原菌的
黑白轮枝菌对棉花和苜蓿的侵染也从在根冠区开
始[１８~１９]ꎮ 本研究发现大丽轮枝菌无论对抗病或者
感病棉种的初始侵染位置均为根冠区ꎬ接菌 ７ ｄ
后ꎬ根冠区均能检测到大量的菌丝ꎬ并且菌丝连有
孢子ꎬ这些菌丝相互交织在一起ꎬ匍匐在根表面或
者深入到组织内部朝根基方向生长(图 ３ 和图 ４)ꎮ
此外ꎬ侵染前根部组织的损伤也有利于病原菌的侵
染ꎬ损伤的根部维管组织产生明显的褐化现象ꎻ尖
孢镰刀菌侵染番茄中也有类似的结果ꎬ受损的番茄
根部有利于病原菌的侵入[２０]ꎮ 推测寄主受损的区
域能够泄露多种营养物质ꎬ促进分生孢子萌发ꎬ利
于病原菌从损伤区域侵入ꎮ
　 　 尽管大丽轮枝菌对抗病或者感病的寄主均能
够侵染ꎬ但它们的侵染过程存在显著差异ꎬ侵染抗
病棉种的速度显著慢于感病棉种ꎬ这种差异和侵染
结构、寄主防卫反应和侵染位点等密切相关ꎮ 一般
认为ꎬ病原真菌在侵染寄主细胞过程中ꎬ通常产生
附着胞以提高其侵染的能力ꎬ如大丽轮枝菌侵染感
病莴苣后其细胞连接处可以观察到附着胞结
构[１１]ꎮ 然而ꎬ在大丽轮枝菌侵染感病和抗病棉种
根部的过程中ꎬ孢子首先萌发形成芽管ꎬ芽管延伸
产生菌丝ꎬ随后在细胞间隙或者细胞内扩展ꎬ未检
Ｔａｂｌｅ １　 Ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ ｉｎ ４ ｃｏｔｔｏｎ ｓｐｅｃｉｅｓ
Ｍａｔｅｒｉａｌ
Ｔｉｍｅ / ｄ
０.５ １ ３ ５ ７ １０ １４
ｃｖ. Ｊｕｎｍｉａｎ１ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ ｃｏｒｔｅｘ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｐｒｅａｄ
Ｇ. ｔｒｉｌｏｂｕｍ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ ｃｏｒｔｅｘ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｐｒｅａｄ
ｃｖ. Ｈａｉ７１２４ ｃｏｒｔｅｘ ｃｏｒｔｅｘ ｖａｓｃｕｌａｒ ｕｎｓｐｒｅａｄ
Ｇ. ｄａｖｉｄｓｏｎｉｉ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ ｃｏｒｔｅｘ ｖａｓｃｕｌａｒ ｕｎｓｐｒｅａｄ
２９２
　
　 ３期 肖红利ꎬ等:大丽轮枝菌侵染抗感棉种的组织学过程观察
　
测到附着胞(图 ３ 和图 ４)ꎮ 附着胞形成与否和侵
染寄主的类型有关ꎬ即大丽轮枝菌并不能在所有寄
主植物根部表面检测到附着胞ꎬ如大丽轮枝菌能够
直接侵入寄主植物根部皮层而未形成附着胞[２１]ꎬ
这可能是大丽轮枝菌和寄主相互作用的结果ꎮ 这
种与寄主相互作用直接影响了大丽轮枝菌对寄主
的侵染过程ꎬ抗病寄主在应答大丽轮枝菌侵染时与
抗性相关的信号通路和防卫反应被大量激活ꎬ胶状
物质、胼胝质和木质素等抗性物质大量沉积在表皮
细胞壁上ꎬ限制了病原菌的扩展和繁殖[２２ ~ ２３]ꎮ 本
研究发现抗病棉种三裂棉和海岛棉 ７１２４具有较强
的抑制病原菌侵染的能力ꎬ病原菌需要 ７ ~ １０ ｄ 才
能侵入维管束ꎬ而感病棉种则在 ５ ｄ 左右ꎬ而且相
对于病原菌在感病棉种的大量扩展和繁殖ꎬ接菌
１４ ｄ后抗病棉种的茎基部维管组织仅观察到少量
的菌丝ꎬ大丽轮枝菌的定殖和扩展受到强烈抑制
(图 ３和图 ４ꎬ表 １)ꎮ 类似于黑白轮枝菌侵染番茄ꎬ
携带有抗黄萎病 Ｖｅ 基因的番茄根部能够限制绝
大多数病原菌的侵染ꎬ在木质部内仅发现少量菌丝
的扩展[２４ ~ ２５]ꎮ 因此ꎬ大丽轮枝菌对棉花的侵染过
程和寄主的抗性显著相关ꎬ抗病棉种的生理生化抗
性和组织抗性限制了病原菌的侵染速度ꎬ显著慢于
病原菌侵染感病棉种ꎮ
　 　 本研究利用绿色荧光蛋白标记的大丽轮枝菌
Ｖｄ￣ｇｆｐ７７研究了其对抗病 /感病的野生棉 /栽培棉
的侵染过程ꎬ发现了病原菌均能够侵染抗 /感的棉
种ꎬ但病原菌侵染抗病棉种的过程显著慢于感病棉
种ꎬ病原菌在抗病棉种中的繁殖和扩展受到明显的
抑制ꎮ 该研究结果初步阐明了海岛棉和野生棉抗
黄萎病的组织学过程ꎬ即抗黄萎病材料通过组织结
构抗性或者生理生化抗性来限制病原菌的侵染和
扩展速度ꎬ这为大丽轮枝菌对棉花的致病机理研究
和抗病品种选育提供了方法和理论依据ꎮ
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植物病理学报 ４４卷
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责任编辑:张宗英
４９２