全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(1): 93-96(2012)
收稿日期: 2011-01-21; 修回日期: 2011-10-17
基金项目: 国家自然科学基金(30871610;30971949); 国家博士点专项基金(20090073110048); 现代农业产业技术体系专项资金资助
(CARS-02)
通讯作者: 陈 捷,教授、博士生导师,主要从事分子植物病理学研究; Email: jiechen59@sjtu. edu. cn。
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췍研究简报
玉米弯孢叶斑病菌酵母双杂交
cDNA文库的构建及评价
荆 晶1, 刘 铜2, 陈 捷1*
( 1上海交通大学农业与生物学院 农业部都市农业(南方)重点开放实验室, 上海 200240;
2黑龙江八一农垦大学农学院, 大庆 163319)
Construction and characterization of yeast two hybrid cDNA library of Curvularia
lunata　 JING Jing1, LIU Tong2, CHEN Jie1 　 ( 1School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiaotong University,
Key Laboratory of Urban Agriculture(South), Ministry of Agriculture, Shanghai 200240, China; 2School of Agriculture, Hei-
longjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China)
Abstract: BD SMART technique and LD-PCR were applied to synthesize double strand cDNA(ds cDNA) .
The ds cDNA and pGADT7-Rec were transfered into competent yeast cell to construct yeast two-hybrid cDNA
library of Curvularia lunata by homologous recombination method. The results showed that library capacitance
was 2. 46 ×105 and transformation rate was 2. 13 × 105 / μg pGADT7-Rec. The plaque titer of the library was
2. 5 ×108 pfu / mL and the recombination frequency was 88. 24% . The length of inserted cDNA fragment was
ranged from 0. 4 kb to 3 kb in average. This is the first time to use BD SMART technique to construct yeast
two-hybrid cDNA library of C. lunata by homologous recombination.
Key word: Curvularia lunata; yeast two-hybrid; cDNA library
文章编号: 0412-0914(2012)01-0093-04
　 　 由新月弯孢 [ Curvularia lunata (Wakker)
Boed]引起的玉米弯孢叶斑病是我国玉米生产区
的一种重要性叶斑病,曾在 20 世纪 90 年代给我
国玉米生产造成较大损失。 目前对该病原菌致
病类型鉴定与致病相关基因、病害发生规律、综
合防治等方面均有较好的研究基础[1] ,并且在前
期的研究中发现该病菌调控毒素形成的相关基
因与色素合成相关基因在表达上存在某种关联
性[2] ,由于这 2 个基因均为致病相关基因,因此
研究两基因表达的蛋白的关联性对于全面揭示
病菌致病机理和调控网络具有重要意义。 随着
基因组学、蛋白质组学和代谢组学理论与技术的
应用,人们已经意识到植物病原菌的致病因子往
往不是由少数基因控制的,而是通过几个基因之
间相互作用甚至是基因网络或代谢网络控制的,
不同基因网络之间又存在一定程度的交叉。 酵
母双杂交技术已成为研究病原菌致病相关基因
表达的蛋白质之间互作的重要技术,利用该技术
的重要前提是建立酵母双杂交 cDNA 文库。 本
研究利用同源重组原理及 SMARTTM cDNA li-
brary construction 技术和 LD-PCR,以玉米弯孢叶
斑病菌菌丝为试验材料,首次构建了玉米弯孢叶
斑病菌酵母双杂交 cDNA 文库,为研究基因互作
网络奠定了基础。
　
植物病理学报 42 卷
1　 材料与方法
1. 1　 材料与试剂
玉米弯孢叶斑病菌野生菌株 CX-3,保存于上
海交通大学农业与生物学院分子植物病理学实验
室。 Trizol Reagent 购自 Invitrogen 公司;Match-
makerTM Library Construction & Screening Kits Us-
er Manual 及 BD Advantage 2 PCR Kit 均购自
Clontech公司;培养基所用琼脂粉购自 BD 公司;
YNB购自 SIGMA公司。
1. 2　 试验方法
1. 2. 1　 菌丝总 RNA的提取　 取用 PD摇菌(28℃
140 rpm) 3 d 的菌丝,按照 Trizol 操作说明书进
行,提取的总 RNA 用 RNase-free H2O 溶解并检测
质量。
1. 2. 2 　 全长 ds cDNA 的合成 　 cDNA 第一链及
ds cDNA 的合成按照 BD SMARTTM PCR cDNA
Synthesis Kit User Manual cDNA 合成试剂盒中的
说明书进行。 进行 PCR 时,设置以下程序:95℃
30 s; 95℃ 10 s,68℃ 6 min(每个循环递增 5 s),循
环数 25;68℃ 5 min。
1. 2. 3　 纯化 ds cDNA　 纯化方法依照 CHROMA
SPINTM TE-400 Columns(Clontech 公司)说明书
进行。 纯化产物用 25 μL去离子水重悬沉淀,吸取
3 μL 产物进行 1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测。
1. 2. 4 　 转化酵母细胞构建酵母双杂交 cDNA
文库　 用 BD MatchmakerTMLibrary Construction &
Screening Kit(BD 公司)进行 cDNA 文库的构建。
用 LiAc 方法制备酵母 AH109 感受态细胞。 将 ds
cDNA、线性化 pGADT7-Rec、变性的 Herring Testes
Carrier DNA 与 600 μL 感受态细胞混合,并加入
PEG / LiAc溶液;30℃培养 45 min,每 15 min 混合
细胞 1 次;再加入 160 μL DMSO,42℃水浴 20
min,每 10 min 混合 1 次;700 g离心 5 min,用 YPD
Plus medium(来自试剂盒)悬浮细胞;30℃ 振荡培
养 90 min,700 g离心 5 min,用 0. 9% NaCl悬浮细
胞;将细胞液涂布于 SD / -Leu 平板上(共 100 个),
30℃倒置培养 3 ~ 6 d,收集转化子,将细胞悬浮于
含 25%甘油的 YPD 培养基中,调整其浓度至≥2
×107 细胞 / mL,分装 1 mL /管,保存于 - 80℃。 剩
下部分菌液按 1 ∶ 100、1 ∶ 1 000、1 ∶ 10 000 和 1 ∶
100 000 的倍数稀释后涂布 SD / -Leu 平板。 30℃
倒置培养 2 ~ 3 d,收集转化子,计算文库滴度。
1. 2. 5　 文库多态性的计算　 取 3 μL 酵母质粒作
模板,用 pGADT7-Rec 载体通用引物 MATCH-
MAKER ADLD-Insert primer进行 PCR 扩增,根据
PCR扩增的结果,分析插入的 cDNA 片段大小并
统计有 cDNA 插入片段的重组子数和空载体数,
计算文库的重组率。
2　 结果与分析
2. 1　 菌丝总 RNA的提取
经测定,提取的玉米弯孢霉叶斑病菌菌丝总
RNA其 A260 / A280 = 1. 94,浓度为 728. 6 μg / μL,
表明所提取的总 RNA 质量较好,基本上无蛋白
质、DNA及小分子的污染。 提取的 RNA 降解较
少,mRNA 弥散条带比较清楚,28s 与 18s 条带较
亮,比值约为 2. 0,以上结果表明总 RNA提取质量
符合建库要求。
2. 2　 双链 cDNA的合成、纯化与质量检测
经反转录、LD-PCR 及 CHROMASPINTMTE-
400 Column纯化后,所生成的 ds cDNA条带比较
明亮,弥散成明显的瀑布状,说明 mRNA 得到充
分的反转录。 片段长度分布于 200 ~ 4 000 bp 且
主要集中在 700 ~ 3 000 bp 之间。 这表明 mRNA
成分复杂,其中高丰度表达的基因也集中在这一
区域。
2. 3　 酵母双杂交 cDNA文库质量评估
根据在 SD / -Leu不同稀释平板上重组子的数
目(图 1),测得文库容量为 2. 46 × 105,转化率为
6. 39 ×105 转化子 / 3μg pGADT7-Rec,文库滴度为
2. 5 ×108 pfu / mL。 随机挑取的 34 个单菌落进行
PCR后,发现重组到 pGADT7-Rec载体上的 cDNA
片段大小在 0. 4 ~ 3 kb 之间,重组率为 88． 24% 。
这一结果说明文库中 cDNA 片段大小适合做后续
的双杂交筛选。
49
　
　 1 期 　 　 荆 晶,等:玉米弯孢叶斑病菌酵母双杂交 cDNA文库的构建及评价
Fig. 1　 Determination of the plaque titer of the library
A: The dilution ladder was 1∶ 100; B: The dilution ladder was 1∶ 1 000;
C: The dilution ladder was 1∶ 10 000; D: The dilution ladder was 1∶ 100 000.
3　 讨论
首先,RNA的质量是决定文库质量的关键因
素,合成的 ds cDNA 序列的完整性、cDNA 文库的
完整性及多态性都依赖于起始 RNA 的质量。 笔
者认为菌丝的新鲜程度决定着 RNA 的质量,因为
在菌丝生长的后期,由于生理活动的减缓,RNA含
量会有所降低。 总 RNA 的浓度高,在合成 ds cD-
NA时可以减少循环次数,从而降低非特异性条带
的产生。 mRNA 在细胞内含量较少,但是在反转
录过程中却起到模板的作用,在利用 SMART
(Switching mechanism at 5′ End of the RNA tran-
script)技术合成 ds cDNA 时,不需对总 RNA 中的
mRNA进行分离纯化,从而避免因 mRNA 在分离
纯化时的过多步骤造成 mRNA 的降解。 cDNA 片
段长度在 0. 4 ~ 3 kb 之间,多态性较好,适合与线
性 pGADT7-Rec载体进行连接,在后续的文库多
态性检测中也证实了这一点。
酵母感受态的制备是建库过程中另一个关键
因素,高质量的感受态细胞可以最大效率地吸收
ds cDNA,保证文库的丰度。 要得到比较理想的感
受态细胞,需要挑取较大的酵母菌落,严格控制摇
菌时间,并保证每一个阶段的 OD600值不要超过
0． 3,大于这一比值将使 ds cDNA 的转化效率降
低。 酵母转化后要在缺陷培养基上生长,所以器皿
一定要洗刷干净以降低背景的产生,并且不能有表
面活性剂的成分黏在器皿表面。
在前期研究中发现,玉米弯孢叶斑病菌可以产
生 DHN黑色素,并具有致病作用,该毒素在很多
病原真菌中均有发现[3]。 同时弯孢叶斑病菌也可
以产生毒素,参与致病性[4]。 已有研究表明,病原
菌的黑色素与毒素代谢具有一定的相关性[5]。 但
毒素与黑色素在玉米弯孢叶斑病菌中各自或者共
同参与哪些途径来发挥致病因子的作用尚不清楚,
且二者之间具体的调控关系也有待进一步证实。
该文库的构建,为寻找玉米弯孢叶斑病菌中与毒素
及黑色素互作的蛋白质以及为探索毒素与黑色素
代谢途径调控过程的相互关系提供依据,进而为全
面揭示致病相关基因调控网络和致病机理奠定坚
实的基础。
59
　
植物病理学报 42 卷
参考文献
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责任编辑:
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