全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 41(1): 102-105(2011)
收稿日期: 2010-03-19; 修回日期: 2010-09-20
基金项目: 中央高校基本科研业务费专项资金( 2009-2-06)
通讯作者: 程玉琴,博士,副教授,主要从事植物病毒分子生物学及病毒与寄主的分子互作研究; Tel: 010-62733387, E-mail: chengyuqin
@cau. edu. cn。
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췍研究简报
利用酵母双杂交研究葡萄卷叶伴随病毒
2 号 p24 与寄主互作的初步结果
费 菲1, 刘命华1, 周 涛2, 范在丰2, 程玉琴1*
( 1中国农业大学农学与生物技术学院果树系 /北京市果树逆境生理与分子生物学实验室, 北京 100193;
2中国农业大学农学与生物技术学院植病系, 北京 100193)
Preliminary study on interactions between p24 of Grapevine leafroll-associated vi-
rus 2 and the host by yeast two-hybrid screening　 FEI fei1, LIU Ming-hua1, ZHOU Tao2,
FAN Zai-feng2, CHENG Yu-qin1 　 ( 1Pomology / Lab of Stress Physiology and Molecular Biology for Tree Fruits, A Key
Lab of Beijing Municipality, College of Agronomy and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100193,China;
2Department of Plant Pathology, College of Agronomy and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100193, Chi-
na)
Abstract: In this study, the bait plasmid (pGBK-p24) with the full length of p24 encoded by Grapevine
leafroll-associated virus 2 Liaoning isolate (GLRaV-2-LN), and grapevine cDNA library were constructed,
and then grapevine cDNA library was screened by the bait plasmid to identify protein( s) that interact with
p24. The results showed that the aa sequence and open reading frame of the insert cDNA fragment of p24 were
correct, and the bait plasmid has no self-activating effect on yeast strain AH109 and Y187; The cDNA library
had a titer of 2. 2 ×106 cfu / mL, and most insert fragments were more than 700 bp in size , which indicated
that the cDNA library are qualified for the yeast two-hybrid screening. 19 candidate postive clones displayed
specific interaction with p24 and 16 cDNA sequences of these clones were obtained. BLAST showed that these
cDNAs encode 8 proteins, such as MYC transcription factor, aconitase and type I inositol polyphosphate 5-
phosphatase, etc; other three cDNA sequences encoded the same unnamed protein.
Key words: p24; bait plasmid; grapevine cDNA library; yeast two-hybrid screening
文章编号: 0412-0914(2011)01-0102-04
　 　 葡萄卷叶病 ( Grapevine leafroll disease,
GLRD)是一种世界性病毒病害,严重影响葡萄生
产和葡萄酒产业。 至今已报道 11 种具不同血清学
关系的葡萄卷叶伴随病毒(Grapevine leafroll-asso-
ciated virus,GLRaV)均可引起葡萄卷叶症状,其中
GLRaV-2 为长线形病毒属(Closterovirus)成员[1]。
GLRaV-2 的基因组长度约为 16. 5 kb,具 9 个可读
框,其中的 p24(24-kDa protein)是 GLRaV-2 的基
因沉默抑制子[2]。 本文拟通过酵母双杂交系统,
寻找与 GLRaV-2 p24 互作的寄主因子,可有助于
更好地了解 p24 的功能,并为揭示 GLRaV-2 侵染
的相关分子机制提供参考。
　
　 1 期 费 菲,等:利用酵母双杂交研究葡萄卷叶伴随病毒 2 号 p24 与寄主互作的初步结果
1　 材料与方法
1. 1　 试验材料
mRNA 分离试剂盒和文库构建与筛选试剂盒
分别购自 QIAGEN和 Clontech 公司。 酵母质粒提
取试剂盒为天根生化科技有限公司产品。
1. 2　 诱饵质粒构建和自主激活检测
以含有 p24 基因的 pMD18-T 载体[3]为模板,
扩增 p24(上下游引物序列分别为 5′-ATGGAAT-
TCATGAGGGTTATAGTGTCTCC-3′, 5′-ATCCT-
GCAGTTAACATTCGTCTTGGAGTTC-3′)。 将
PCR产物定向克隆到载体 pGBKT7 后得到重组质
粒(pGBK-p24)。 根据试剂盒说明书将 pGBK-p24
分别转化至酵母菌株 AH109、Y187 中,检测诱饵
蛋白的自主激活能力。
1. 3　 葡萄茎叶 cDNA文库构建和质量鉴定
CTAB 法提取赤霞珠葡萄幼嫩茎叶总 RNA,
之后分离 mRNA。 以 mRNA为模板进行反转录和
ds cDNA扩增(引物 SMART Ⅲ Oligonucleotide和
CDSⅢ Primer 为试剂盒所带)。 将纯化的 ds cD-
NA和文库质粒 pGADT7 -Rec 共转化 AH109 感受
态细胞,转化菌液涂布于亮氨基酸(Leu)合成缺陷
型培养基(SD / -Leu)上,并计算转化效率。 培养
3 ~ 6 d后,收集文库菌落并分装成 1 mL 的小份,
文库构建完成。 在分装菌液的同时,进行滴度分
析,并以试剂盒所带引物 5′ LD primer / 3′ LD pri-
mer进行 PCR检测文库插入片段。
1. 4　 文库筛选与互作分析
将含有 pGBK-p24 的 Y187 和含有葡萄茎叶
cDNA文库的 AH109 在 30℃、30 ~ 50 rpm 的摇床
中配合 24 h。 然后将菌液涂布在缺少 Leu、色氨酸
(Trp)、硫酸腺嘌呤(Ade)和组氨酸(His)的四缺固
体培养基 ( SD / - Leu / - Trp / - Ade / - His)上。
3 ~ 6 d后将出现的菌落重新在四缺平板上进行 2
次划线培养。 然后提取菌落质粒并进行回转验证。
将验证呈阳性的文库质粒送去测序后,进行
BLAST分析。
2　 结果与分析
2. 1　 诱饵质粒构建和自主激活检测
酶切验证和随后的测序结果表明 pGBK-p24
构建正确。 转入诱饵质粒的 Y187 和 AH109 菌株
(图 1)均在 SD / -Trp 培养基上生长旺盛,而在
SD / -Trp-Ade上无菌落生长,表明诱饵质粒没有自
主激活能力。
2. 2　 cDNA文库构建和质量鉴定
总 RNA 电泳结果显示, 28S rRNA 和 18S
rRNA 2 条带清晰,且前者的亮度和浓度约是后者
的 2 倍(图 2-A)。 ds cDNA 呈弥散型,大小位于
200 ~ 5 000 bp,最亮处位于 500 ~ 2 000 bp(图 2-
B),表明其质量可用于文库构建。
Fig. 1　 Self-activating ability analysis of bait vector to Y187(1,2) and AH109 (3,4)
301
　
植物病理学报 41 卷
Fig. 2　 Total RNA extraction (A) and ds cDNA amplification(B)
M: DNA marker; Lane 1: Total RNA; Lane 2: ds cDNA.
　 　 文库质量鉴定表明,插入片段大多数在 700 bp
以上,且大小不一(图 3);同时转化效率约为 1. 5
×106 / 3 μg pGADT7 -Rec,滴度为 2. 2 × 106 cfu /
mL,这些结果表明所构建的文库容量符合筛选
要求。
2. 3　 与 p24 互作的阳性克隆筛选和分析
经过酵母配合、两轮四缺培养基筛选和共转化
回转验证,初步获得 19 个阳性克隆,测出 16 个
cDNA序列。 在 NCBI上的比对分析结果表明,这
些阳性克隆编码如 MYC 转录因子 (MYC tran-
scription factor)、多磷酸肌醇-5-磷酸酶 I(type I ino-
sitol polyphosphate 5-phosphatase)、乌头酸酶 ( ac-
onitase)等 8 种蛋白,其他 3 个 cDNA 序列编码的
是同一种未命名蛋白。
3　 讨论
本文利用 GLRaV-2 编码的基因沉默抑制子
p24 为诱饵筛选葡萄茎叶 cDNA文库,初步筛选到
如乌头酸酶、MYC 转录因子、多磷酸肌醇-5-磷酸
酶等 8 种寄主因子与 GLRaV-2 p24 互作,且这些
寄主因子的大多数在植物对逆境胁迫的反应中起
着重要作用[4,5]。 下一步的工作是选取其中 2 ~ 3
个互作因子作为重点研究对象,用其他研究方法验
证互作,并进一步探讨该互作因子在 GLRaV-2 侵
染过程中的功能。
Fig. 3　 PCR amplification of the insert fragments of cDNA library.
M: DNA marker; Lane 1-13: PCR productions.
401
　
　 1 期 费 菲,等:利用酵母双杂交研究葡萄卷叶伴随病毒 2 号 p24 与寄主互作的初步结果
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责任编辑:
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曾晓葳
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