全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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#"*+&"&
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,
*-../*#""")$"!*!"#$*"$*"&$
收稿日期$
!"#%)#!)#&
&修改稿收到日期$
!"#$)"%)!"
基金项目$国家自然科学基金"
%##+#0!$
#
作者简介$王
!
欢"
#01+(
#!女!在读硕士研究生!主要从事果树育种及生物技术研究
2)34-5
$
64/
7
894/
(
1+0#
!
#&%*:;3
"
通信作者$王跃进!博士!教授!博士生导师!主要从事葡萄种质资源与生物技术育种研究工作
2)34-5
$
64/
7<,!
/6.94=*>?9*:/
野生华东葡萄脂类相关质体蛋白基因
1
2
3!3$
的克隆与表达
王
!
欢!史江莉!李瑞民!姚文孔!焦韵桐!王跃进"
"西北农林科技大学 园艺学院!旱区作物逆境生物学国家重点实验室%农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室!
陕西杨陵
+#!#""
#
摘
!
要$该研究以前期获得的葡萄
:@AB
全长文库为基础!采用
CD)EFC
技术克隆了中国野生华东葡萄)白河
)%)
#
*"
!"#"$
%
$&()*&#"+,-#-
)
G4-8>)%)#
*#相关质体蛋白基因!命名为
!
%
./.#
"
H>/G4/I
登录号
JA&!$1#+
#序列分
析表明!
%
./.#
基因
:@AB
编码区全长为
#"%$K
L
!其中
M)NDC
和
%M)NDC
区域分别为
!&K
L
和
&%K
L
!开放阅
读框为
0$K
L
!编码
%#$
个氨基酸!分子量为
%$#&0*%+@4
!等电点为
+*+&
葡萄叶片接种白粉菌+
01+"1,-1&+-2
#)*
"
O:86*
#
G9PP*
,后!运用实时定量
EFC
技术分析
!
%
./.#
基因的表达模式!结果表明
!
%
./.#
基因受白粉菌
诱导表达!在接种后
!$8
达到峰值该研究为进一步研究中国野生葡萄脂类相关质体蛋白基因的表达及其在葡萄
白粉病互作中的功能分析提供了依据
关键词$葡萄&野生华东葡萄&脂类相关质体蛋白&白粉病&表达模式
中图分类号$
Q+1
&
Q+10
文献标志码$
B
%"&()&*+,&"-#-
.
*-!/0
1
+22#"-"3*4&*25#!6#
1
#!7*22"(#*5!
4+"5#-1
2
3!3$8&*5!5"4/"-/5*$/)"$#&(
9-3(5#"-#-1-#-6
2
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7
5-
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7
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7
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7
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L
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L
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<
;=B
7
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7
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L
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CD)EFC
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7
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7
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L
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7
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7
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L
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L
P>..-;/
L
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%
2
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7
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L
54.X-?5-
L
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7
P4
L
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<
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7
P4
L
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54.X-?5-
L
-?)4..;:-4X>?
L
P;X>-/
&
01+"1,-1&+-#)*
&
>^
L
P>..-;/
L
4XX>P/
!!
葡萄"
!"#"$U*
#是世界重要经济类果树作物之
一!在世界各地广泛种植并加工利用!为人类创造了
巨大的经济-生态和社会效益+#)!,但是!生产中用
于鲜食和酿酒的葡萄!大多属于欧洲葡萄"
!"#"$
4"1"
5
&*-U*
#!且不抗白粉病中国是葡萄属植物
重要的原产地之一!研究发现野生葡萄中蕴藏了丰
富的抗病种质资源尤其是中国野生华东葡萄)白
河
)%)#
*为高抗白粉病的野生葡萄资源+%)$,!从中克
隆的泛素连接酶基因-转录因子基因和芪合成酶基
因等!其抗病性和抗逆性的功能已经被验证+)1,因
此!研究中国野生葡萄抗病基因并利用这些宝贵的
抗病基因是科学研究的主要课题之一
脂类相关质体蛋白"
E54.X-?5-
L
-?)4..;:-4X>?
L
P;)
X>-/.
!简称
EBE.
#又称植物原纤维蛋白"
E54/X=-KP-5-)
/.
!简称
ZTG.
%
ZGA
#-叶绿体干旱胁迫蛋白"
F85;P;)
L
54.X?P;9
7
8X.XP>..
L
P;X>-/.
!简称
F@OE%$
#或类胡萝
卜素相关蛋白"
F4P;X>/;-?)4..;:-4X>?
L
P;X>-/.
!简称
F8PF
#!是一类与有色体原纤维-叶绿体中的类囊体-
光合作用天线复合物及基质形成有关的核编码蛋
白+0)#",!广泛存在于低等植物蓝藻到高等植物中
脂类相关质体蛋白基因为一个多基因家族!包含
#!
个亚家族!其中只有
%
个亚家族为功能基因+##,
EBE.
蛋白的亚细胞器结构首次在狗蔷薇"
6)$-+-2
1"1-
#和甜椒"
7-
%
$"+8-118
#果实有色体中被
鉴定后!这类蛋白又被称为原纤维蛋白+#!,这一大
类古老而保守的蛋白质!其功能迄今尚未得到确切
的阐述!但是已有研究表明植物脂类相关质体蛋白
参与质体球蛋白的形成-质体色素的积累以及激素
的应答反应-并具有保护光合器官免受强光损伤的
作用!也可以提高植物对生物和非生物胁迫的抗
性+##,已有研究发现
EBE.
蛋白参与植物的抗病
反应
O-/
7
8
等+#%,敲除苹果中
./.
基因后发现苹
果对梨火疫病表现出较强的感病性
U>-X/>P
等+0,
敲除番茄中
9&7:*7
基因后降低了番茄对死体营养
型病原菌灰霉病的抗性!过量表达该基因后则提高
了对此病原菌的抗性
目前在拟南芥-番茄-甜椒-马铃薯等植物中已
有
./.$
基因的相关报道!葡萄
./.$
基因的研究
目前仅报道了酿酒葡萄在感染葡萄金黄色植原体
后!
EBE
蛋白表达上调+#$,本研究以中国野生华东
葡萄)白河
)%)#
*为材料!在前期本课题组构建的白
粉菌诱导的中国野生葡萄华东葡萄
:@AB
全长文
库的基础上+#,!利用在线序列拼接程序
FBE%
!将基
因序列相似性较高的欧洲葡萄
!4./.#%
"
H>/G4/I
登录号
a]
(
""!!+0%0$
#与)白河
)%)#
*抗白粉病相
关
2OD
序列进行拼接依据得到的拼接序列设计
特异引物!获得
!
%
./.#
基因
:@AB
全长并对
抗白粉病和感白粉病葡萄中脂类相关质体蛋白基因
在白粉菌诱导不同时期的表达特性进行比较分析!
以期确定该基因在葡萄抗病防御机制中的作用
#
!
材料和方法
$*$
!
材
!
料
中国野生华东葡萄"
!"#"$
%
$&()*&#"+,-#-
#
)白河
)%)#
*和欧洲葡萄"
!"#"$4"1"
5
&*-
#)黑比诺*
叶片取自西北农林科技大学葡萄种质资源圃
$*?
!
方
!
法
$*?*$
!
材料处理
!
选取感染白粉菌"
01+"1,-1&2
+-#)*
#的欧洲葡萄)赤霞珠*叶片!采用压片法+%,接
种该病原菌于正常生长的抗病材料)白河
)%)#
*及
感病材料)黑比诺*接种后
"
-
&
-
#!
-
!$
-
%&
-
$1
-
+!
-
0&
和
#!"8
共
0
个时间段分别采样!将采集的叶片
立刻置于液氮中冷冻!并于
(1"b
保存
$@?@?
!
总
8A:
提取及
(BA:
第一链的合成
!
参照
张今今等改良的
O@O
%酚法+#&,提取)白河
)%)#
*和
)黑比诺*叶片总
CAB
!总
CAB
的纯化参照王西平
的方法+#+,进行分别用琼脂糖凝胶电泳和紫外分
光光度计检测总
CAB
的质量和浓度按照
EP-3>)
O:P-
L
X
D]
CDP>4
7
>/X\-X
试剂盒说明进行反转录!
合成
:@AB
第一链
$@?@C
!
野生华东葡萄脂类相关质体蛋白基因
1
2
+
3!3$(BA:
全长的克隆
!
在本课题组构建的白粉
菌诱导的中国野葡萄华东葡萄
:@AB
全长文库的
基础上!采用生物信息学方法利用在线序列拼接程
序
FBE%
将基因序列拼接依据得到的拼接序列设
计上游引物
!
%
./.#)Z
"
M)HHDHDFDDFDDBH)
BBFFDFFFFDDFB)%M
#和下游引物
!
%
./.#)C
"
M)DDDDDHHBFDBDHDHDDHDDDBBFDDHH)%M
#!
以)白河
)%)#
*叶片
:@AB
为模板!以高保真
;-
<
酶
"
D4\4C4
!大连#进行
EFC
扩增!反应体系为
#"c
EFCG9==>P!*
"
U
!
?ADE!
"
U
!模板
#
"
U
!引物各
#
"
U
!
;-
<
酶
#
"
U
!加水补齐至
!
"
U

EFC
扩增
条件为
0$b
预变性
3-/
&
0$b
变性
%".
!
+b
退
火
$.
!
+!b
延伸
!3-/
!
%$
循环&
+!b
延伸
3-/
!
$b
保存
EFC
产物在
#d
琼脂糖凝胶中进行电泳
检测!用琼脂糖凝胶
@AB
回收试剂盒"天根公司#
回收目的条带将回收的产物连接至克隆载体
L
H2])D>4.
<
!采用热激转化法将其导入感受态
&$&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
D;
L
#"
细胞中!在
#""3
7
.
U
(#
B3
L
平板上进行蓝
白斑筛选阳性克隆将鉴定结果为阳性的重组菌送
北京奥科鼎盛测序部测序
$@?@D
!
野生华东葡萄脂类相关质体蛋白基因
1
2
+
3!3$
及其蛋白质生物信息学分析
!
在
AFGT
数据
库中进行核苷酸与蛋白质的序列比对!通过
]2HB
*"
软件构建系统进化树&核酸及其编码的蛋白质
的组成成分及理化性质利用
2^ EBO
<
工具包中的
EP;XE4P43
程序进行分析&运用
EP;XO:45>
在线工具
预测
e
L
EBE#
蛋白的亲水性及疏水性&
e
L
EBE#
蛋
白的跨膜结构域由
D]
L
P>?
在线工具进行分析&采
用
O-
7
/45E$*#O>P[>
分析
e
L
EBE#
蛋白有无信号
肽&
!
%
./.#
基因编码的蛋白二级结构由
OWE]B
在线工具进行预测
$@?@E
!
实时荧光定量
4,8
分析
!
分别取
0
个不同
处理时间点的叶片组织总
CAB
各
#
"
U
!按照
EP-)
3>O:P-
L
X
D]
CDC>4
7
>/X\-X
的说明书反转录成
:@)
AB
!作为模板根据
!
%
./.#
基因
:@AB
序列设
计特异引物
!
%
./.#)CD)Z
"
M)HDDFDDDHFDF)
DBDDFDFFDFBDDF)%M
#和
!
%
./.#)CD)C
"
M)
DFDFFHHHFFBDDFDFFB)%M
#根据
!4./.#%
基因序列设计特异引物
!4./.#%)CD)Z
"
M)HDDFD)
DDHFDFDBDDFDFFDFBDDF)%M
#和
!4./.#%)
CD)C
"
M)DFDFHHFFBDDFFDFFBFFHHFFBD)
DFDFFB)%M
#以葡萄
#1OPCAB
作为内参基因!
上游引物为
#1OPCAB)Z
"
M)HDBBFHHHDH)
BFHHBHBBDDBH)%M
#!下游引物为
#1OPCAB)C
"
M)FFHDHDFBHHBDDHHHDBBD)%M
#参照荧
光定量试剂盒
OVGC
#
EP>3-^ 2^ ;-
<
D]
$
说明书
进行实时荧光定量
EFC

EFC
反应体系为
!c
OVGC#"
"
U
!引物各"
#"
"
3;5
.
U
(#
#
"*1
"
U
!
:@)
AB#
"
U
!
??S
!
W+*$
"
U
反应程序为$
0b
预变
性
%3-/
&
0b
变性
%".
!
+b
退火
%".
!
+!b
延伸
&".
进行
%"
个循环每个反应
%
次重复反应在
GTW)CB@F
<
:5>PTQ
荧光定量
EFC
仪上进行!扩
增曲线-溶解曲线-标准曲线由定量
EFC
仪软件自
动生成用内参基因
#1OPCAB
表达校准后计算处
理后不同时间点
!
%
./.#
基因相对表达量数据
用
WP-
7
-/1*"
软件处理
!
!
结果与分析
?@$
!
野生华东葡萄脂类相关质体蛋白基因
1
2
+
3!3$
克隆及序列分析
采用
O@O
%酚法提取)白河
)%)#
*叶片总
CAB
"图
#
!
B
#!可以明显区分
!1O
和
#1O
!符合后续实验
要求通过反转录和
EFC
扩增!该基因全长为
#"%$K
L
"图
#
!
G
#!命名为
!
%
./.#
"
H>/G4/I
登录
号
JA&!$1#+
#!与欧洲葡萄预测的
!4./.#%
基因
"
H>/G4/I
登录号
a]
(
""!!+0%0$
#相似性达到
00d

@AB]BA
分析结果表明!
!
%
./.#
基因
:@AB
包括
!&K
L
的
M)NDC
和
&%K
L
的
%M)NDC
及
#
个长
0$K
L
的完整开放阅读框!编码
%#$
个氨
基酸"图
!
#!预测的理论蛋白分子量为
%$#&0*%+
@4
!等电点为
+*+&

?@?
!
1
2
3!3$
基因编码蛋白同源性及其进化分析
在
AFGT
数据库中将
!
%
./.#
基因编码的氨
基酸序列与其它
1
种植物的
#%
个
EBE.
蛋白序列
进行同源比对分析!结果表明!
e
L
EBE#
蛋白与欧
洲葡萄预测的
e[EBE#%
蛋白相似性最高!达到
00d
!亲缘关系最近&与拟南芥"
/*-="()
%
$"$#:-,"2
-1-
#及黄瓜"
7+8"$$-#"4$
#相似性在
&"d
%
+"d
之间&与蜜柑"
7"#*$1$:"
#-豌豆"
."$8$-2
#"48
#-油菜"
>*-$$"+-*-
%
-
#-甜椒"
7-
%
$"+8-112
8
#和马铃薯"
?),-18(&8"$$8
#相似性较低!
在
!d
%
!0d
之间"图
%
-
$
#!故推测
!
%
./.#
与
!4./.#%
基因的功能可能相似
?@C
!
F
1
4:4$
蛋白的生物信息学分析
EP;XO:45>
对
!
%
./.#
基因编码蛋白的疏水性
分析表明!分别位于第
%!
和
%%
位的
.>P
和
5>9
具有
最高的分值"
!*!##
#和最强的疏水性!位于第
#!+
位
的
B./
具有最低的分值"
(#*0&+
#和最强的亲水
性!平均疏水性为
("*"&0
!故推测该蛋白为亲水性
蛋白"图

#
利用
OWE]B
预测
!
%
./.#
基因编码蛋白的
图
#
!
华东葡萄)白河
)%)#
*叶片总
CAB
"
B
#
及
!
%
./.#
基因
EFC
扩增"
G
#
]*DP4/.!L
59.@AB34PI>P
&
#
%
%*
)白河
)%)#
*
叶片总
CAB
&
$
-
*EFC
扩增
!
%
./.#
基因
Z-
7
*#
!
D;X45CAB=P;35>4[>.
"
B
#
4/?EFCP>.95X;=
!
%
./.#
7
>/>
"
G
#
=P;3!3
%
$&()*&#"+,-#-
)
G4-8>)%)#
*
]*DP4/.!L
59.@AB34PI>P
&
#
%
%*D;X45CAB=P;35>4[>.
;=
)
G4-8>)%)#
*&
$
!
*B3
L
5-=-:4X-;/;=!
%
./.#
7
>/>
+$&
$
期
!!!!!!!!!
王
!
欢!等$野生华东葡萄脂类相关质体蛋白基因
!
%
./.#
的克隆与表达
图
!
!
华东葡萄)白河
)%)#
*
!
%
./.#
基因
:@AB
序列及其推导的氨基酸序列
Z-
7
*!
!
Z955>/
7
X84/??>?9:>?43-/;4:-?;=!
%
./.#=P;3!3
%
$&()*&#"+,-#-
)
G4-8>)%)#
*
图
%
!
e
L
EBE#
蛋白与其他植物脂类相关质体蛋白序列的多重比对
氨基酸序列相同和相近的部分分别用黑色和灰色阴影表示!颜色的深浅代表氨基酸一致性的高低
Z-
7
*%
!
]95X-
L
5>45-
7
/3>/X;=?>?9:>?43-/;4:-?.>
_
9>/:>.;=e
L
EBE#4/?X8;.>=P;3;X8>P
L
54/X.
L
>:->.
D8>.43>4/?.-3-54P43-/;4:-?P>.-?9>.4P>8-
7
85-
7
8X>?-/K54:I4/?
7
P4
<
P>.
L
>:X-[>5
<
!
X8>
7
P4?4X-;/;=5>XX>P..X4/?=;PX8>?-==>P>/X-?>/X-X
<
;=43-/;4:-?.>
_
9>/:>.
1$&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
$
!
不同植物脂类相关质体蛋白基因
氨基酸序列的系统进化树
分支上的数值表示
#"""
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延伸链-
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具有信号肽!说明该蛋白可能不是一个分泌蛋白
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葡萄白粉菌诱导后
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2
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及
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基因
的表达分析
经葡萄白粉病接种诱导本研究中的
!
个不同葡
萄品种!通过定量
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分析了叶片组织中两个
脂类相关质体蛋白基因的表达结果表明!)白河
)
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*在接种白粉病后
!
%
./.#
基因在感病初期上
调表达!在接种
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表达量达到最高!比未接种"
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倍!之后表达量迅速下降!在
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%
2
./.#
基因表达量又缓慢上升"图
+
#感病欧洲葡
萄)黑比诺*在接种白粉病后!其表达变化模式"图
+
#与接种白粉病后)白河
)%)#
*
./.
基因的表达模
式存在一定的差异!
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基因在接菌
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表
达量达到最高!比未接种仅增加了
!
倍&随后表达量
图
+
!
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分析接种白粉病后野生华东葡萄
)白河
)%)#
*
!
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和欧洲葡萄)黑比诺*
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基因分别在叶片中的表达
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论
在植物不同的生长发育阶段-不同的环境条件
或生物因素的作用下!脂类相关质体蛋白基因的表
达受到转录水平和蛋白水平的调控已有研究表
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$
期
!!!!!!!!!
王
!
欢!等$野生华东葡萄脂类相关质体蛋白基因
!
%
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的克隆与表达
明!
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基因在植物中的表达具有组织特异性!并
且与生长发育-激素水平-生物及非生物胁迫有关
目前!
./.$
基因的研究主要侧重于与植物抗病的
关系有研究发现感染黄瓜白粉菌的黄瓜叶片和感
染番茄灰霉菌的番茄中
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基因均受到诱导表
达+0,
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蛋白也
在病原菌侵染过程中得到积累
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7
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等+#$,发
现在酿酒葡萄叶片感染葡萄金黄色植原体后!脂类
相关质体蛋白基因大量表达!这与本研究结果一致
在前期本课题组构建的白粉菌诱导的中国野生
葡萄华东葡萄
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全长文库的基础上!以高抗白
粉病的中国野生华东葡萄)白河
)%)#
*为研究对象!
运用生物信息学技术手段筛选出与欧洲葡萄
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相似性较高的脂类相关质体蛋白基因
!
%
2
./.#
研究发现脂类相关质体蛋白基因
./.$
在
抗病野生华东葡萄和感病欧洲葡萄均受白粉菌诱导
表达!并且表达模式和表达水平存在一定的差异!即
抗病葡萄中国野生华东葡萄)白河
)%)#
*脂类相关
质体蛋白基因
!
%
./.#
表达量明显高于感病葡萄
黑比诺的
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基因因此!从中国野生华东
葡萄)白河
)%)#
*脂类相关质体蛋白基因
!
%
./.#
表达推测该基因参与葡萄抗白粉病反应"图
+
#然
而!中国野生华东葡萄)白河
)%)#
*脂类相关质体蛋
白基因
!
%
./.#
的抗病机制还需进一步通过过量
表达该基因及
CAB
干扰等手段进行深入研究
本研究通过生物信息学技术克隆并获得了)白
河
)%)#
*脂类相关质体蛋白基因
!
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全长!并通过葡萄白粉菌诱导发现
!
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基因明
显受白粉菌诱导表达!为进一步研究
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基因
的表达和功能提供了依据
参考文献!
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葡萄学+
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