全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(4): 352鄄360(2011)
收稿日期: 2010鄄06鄄13; 修回日期: 2011鄄04鄄28
基金项目: 辽宁省教育厅项目(2008S135); 国家质检总局项目(2006IK218)
通讯作者: 姜 华,博士,教授,主要从事植物病理学研究; Tel: 0411鄄84258306, E鄄mail: jianghua1225@163. com
赵 衍,博士,研究员,主要从事分子生物学及植物病理学研究; Tel: 01鄄301鄄504鄄6202, E鄄mail: yan. zhao@ars. usda. gov
共同第一作者: 王有福,硕士,高级农艺师,主要从事植原体病理学研究; E鄄mail: wyfcnal@sina. com。
3 种检疫性葡萄黄化植原体的快速检测
姜 华1*, 王有福2#, 姜 一3, 魏 薇3, Rasa Jomantiene3,
Robert E. Davis3, 赵 衍3*
( 1辽宁师范大学生命科学学院, 大连 116029; 2辽宁出入境检验检疫局, 大连 116001;
3美国农业部植物分子病理研究室, 美国马里兰州 20705)
摘要: 葡萄上的植原体病害由于引起叶片黄化而被称为葡萄黄化病。 由于这一病害极为严重,葡萄黄化植原体被列为我
国的植物检疫对象。 其中,葡萄金黄化植原体(16SrV)、维吉尼亚葡萄黄化植原体(16Sr芋) 和澳大利亚葡萄黄化植原体
(16Sr狱) 是引起葡萄黄化病的主要 3 个株系,它们导致的病害症状相似,难以区分。 本文进行了 3 个株系 16S rRNA基因
DNA序列比对,而后根据同源性相对低的序列设计了 43 条特异性引物、103 对引物对组合,对葡萄黄化植原体 3 个株系各
自的 DNA及混合 DNA进行 PCR扩增,从中筛选出来特异性较强的 8 个引物对组合。 这些引物对组合,能够同步、特异、
快速地检测 3 种葡萄黄化植原体。
关键词: 葡萄;植原体;PCR检测
A PCR鄄based assay for rapid detection and precise differentiation of three quaran鄄
tine phytoplasmas responsible for yellows diseases in grapevine摇 JIANG Hua1, WANG
You鄄fu2, JIANG Yi3, WEIWei3, Rasa JOMANTIENE3, Robert E. DAVIS3, ZHAOYan3 摇 ( 1Life science col鄄
lege of Liaoning normal university, Dalian 116029, China; 2Liaoning Entry鄄Exit Inspection and Quarantine Bureau, Dalian
116001,China; 3Molecular Plant Pathology Laboratory, ARS鄄USDA, Beltsville MD 20705, USA)
Abstract: Grapevine yellows (GY) is a destructive disease complex that affects a wide variety of grapevine
cultivars in almost all major wine production countries. The causative agents of GY are phloem鄄restricted cell
wall鄄less bacteria termed phytoplasmas. Thus far, diverse strains belonging to five distinct ‘Candidatus Phyto鄄
plasma爷 species and four 16S rDNA RFLP groups have been identified to be responsible for various GY epi鄄
demics around the world and some have been listed as quarantine pests in many countries. The disease symp鄄
toms induced by different GY phytoplasmas are very similar, making accurate visual diagnosis / quarantine in鄄
spection difficult. In the present study, 16S rRNA gene sequences from three major GY phytoplasma strains,
Flavescence doree phytoplasma (16SrV), Virginia grapevine yellows phytoplasma (16Sr芋), and Australian
grapevine yellows phytoplasma (16Sr狱), were analyzed and several variable regions were identified. Based
on the analysis, 43 primers were designed and 103 primer combinations were tested in PCR reactions aimed at
precise differentiation of the three GY phytoplasma strains. The study identified reliable molecular markers and
primer pairs that enable rapid and specific detection and differentiation of the three GY phytoplasma strains.
Key words: grapevine; phytoplasma; PCR detection
中图分类号: Q939;S41摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 0412鄄0914(2011)04鄄0352鄄09
摇
摇 4 期 摇 摇 姜 华,等:3 种检疫性葡萄黄化植原体的快速检测
摇 摇 植原体(Phytoplasma)是农业上重要的病原微
生物,可侵染粮食、蔬菜、花卉、林木、药材、牧草等
各类植物,导致感病植株黄化、丛枝、 花变叶、矮缩
等症状。 世界各地先后报道的植原体病害达 700
多种[1]。 近年,随着生产和生活需要,我国每年都
要从国外引进大量水果及苗木,在新修订的《进境
植物检疫危险性病虫杂草名录》中,葡萄金黄化
病、澳大利亚葡萄黄化病等植原体病害,已被列入
检疫对象。 迄今所知,葡萄金黄化植原体(Grape鄄
vine flavescence doree phytoplasma,16SrV)、澳大
利亚葡萄黄化植原体(Australian grapevine yellows
phytoplasma, 16Sr芋)和维吉尼亚葡萄黄化植原体
(Virginia grapevine yellows phytoplasma, 16Sr狱)3
个株系是引起葡萄黄化病的主要植原体[2 ~ 4]。 它
们侵染葡萄后,导致的病害症状相似很难区分。 为
此,本文采用巢式 PCR 法,基于植原体 16S rRNA
基因设计引物,对葡萄进行了 3 种检疫性植原体的
同步特异性检测研究,旨为筛选出特异性较强的引
物对组合,实现我国进口葡萄苗木的快速、同步、专
化性检测,防患于未然。
1摇 材料与方法
1. 1摇 材料
1. 1. 1摇 植原体 DNA 标样 摇 3 个葡萄植原体株系
的 16S rRNA基因的质粒 DNA由美国农业部农业
研究中心植物病理实验室提供。 株系 A:葡萄金黄
化植原体 (Grapevine flavescence doree phytoplas鄄
ma),原始样本采自意大利;株系 B:维吉尼亚葡萄
黄化植原体(Virginia grapevine yellows phytoplas鄄
ma),原始样本采自美国维吉尼亚;株系 C:澳大利
亚葡萄黄化植原体 (Australian grapevine yellows
phytoplasma),原始样本采自澳大利亚。
由于没有原始的感染植物材料,我们把 1 ng
健康葡萄的总 DNA 和 10 -6 ng 的 16S rRNA 基因
片段进行混合,人为模仿植原体感染体系,因为每
1ng植物总 DNA中约有 100 ~ 10 000 个 phytoplas鄄
ma genomic units[5]。 健康葡萄 DNA提取参照 Liu
等的方法[6]。
1. 1. 2摇 仪器摇 PCR扩增仪 (美国 MJ Research 公
司,型号 PTC鄄200 Thermo Cycler) 、电泳仪(Cosmo
Bio USA)。
1. 1. 3摇 试剂摇 PCR试剂盒、1 kb plus Marker 购于
Invitrogen(美国)公司,引物由 Invitrogen 公司 (美
国) 合成。
1. 2摇 方法
1. 2. 1摇 3 个葡萄黄化植原体株系的 16S rRNA 基
因序列比对及 PCR 引物设计 摇 根据 16S ~ 23S
rRNA Space序列,针对区分几个特定群的植原体
而设计的引物已被报道[7]。 本研究使用的是 3 个
葡萄黄化植原体(葡萄金黄化植原体、维吉尼亚葡
萄黄化植原体及澳大利亚葡萄黄化植原体) 的
16S rRNA基因片段的质粒 DNA(Accession num鄄
ber分别为 AF176319、AF060875 及 L76865),3 个
质粒 DNA比对结果显示,三者的同源序列在 16S
~ 23S rRNA Spacer 区间之外。 因此,本研究依据
上述的比对结果,设计特异引物,供 Nested鄄PCR扩
增使用。
以葡萄金黄化植原体(AF176319)为 A 株系、
维吉尼亚葡萄黄化植原体(AF060875)为 B 株系、
澳大利亚葡萄黄化植原体(L76865)为 C株系。 通
过 Megalign program of the LaserGene software
suite 软件将 3 个株系的 16S rRNA 基因序列进行
比对,找出三者间差异较大的区域(图 1),考虑
rRNA中(G + C)的含量、退火温度及相关序列等
因素,共设计 43 条引物,其中,A 序列引物 16 条,
B序列引物 10 条,C序列引物 17 条。 其引物序列
见表 1。 合成的引物溶解于适量灭菌水中至终浓
度为 5 滋mol / L。
1. 2. 2摇 PCR扩增摇 直接 PCR(Direct鄄PCR): 以样
品总 DNA为模板,以 R16F2n / R16R2 为扩增引物
( R16F2n: 5忆鄄GAAACGACTGCTAAGACTGG鄄3忆;
R16R2: 5忆鄄TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG鄄
3忆) [8]。
PCR 反应体系:2. 5 滋L 10 倍 buffer,2 滋L
2. 5 mmol / L dNTP,1. 25 滋L 引物 (5 滋mol / L),
0. 2 滋L 2U Taq DNA 聚合酶,2 滋L 模板 DNA,加
双蒸水至终体积为 25 滋L。
PCR反应条件:94益预变性 6 min,94益变性
45 s,52益退火 45 s,72益延伸 1 min,35 个循环后
于 72益保温 10 min。 Nested鄄PCR:直接 PCR 产物
稀释 20 倍后,取 1 滋L 作为模板,以设计的各株系
特异引物为扩增引物。 PCR 反应体系及条件与直
接 PCR相同。
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摇
植物病理学报 41 卷
Fig. 1摇 Alignment of partial 16S rRNA gene sequences from
three grapevine yellows phytoplasma strains
A: Grapevine flavescence doree phytoplasma (GenBank accession number: AF176319);
B: Virginia grapevine yellows phytoplasma (GenBank accession number: AF060875);
C: Australian grapevine yellows phytoplasma (GenBank accession number: L76865) .
2摇 结果与分析
葡萄植原体 3 个株系侵染葡萄后,导致的病害
症状相似,田间很难区分。 为了能够准确、特异性
地将这 3 个株系区分开来,本研究将设计的 43 条
引物进行了排列组合,形成了 103 个引物对组合。
其中为鉴定株系 A设定 42 个、株系 B设定 18 个、
株系 C设定 43 个引物对组合(本文未列出引物对
组合表)。 从植原体感染植株提取的总 DNA 中,
植原体 DNA浓度往往很低,因此对植原体的检测
普遍采用巢式 PCR法。 本文首先使用植原体通用
引物(R16F2n / R16R2)进行直接 PCR 扩增,在此
基础上,应用本文所设计的特异引物进行了巢式
PCR扩增,电泳结果得到了清晰可见的特异谱带。
PCR扩增结果电泳图谱见图 2。
初筛试验:首先使用特异引物对组合分别对葡
萄黄化植原体 3 个株系各自单独的 DNA 进行
PCR扩增,从中筛选出阳性信号强的引物对组合。
PCR扩增结果见图 2 和表 2。
复筛试验:以初筛出来的引物对组合,对葡萄
黄化植原体 3 个株系的混合 DNA进行 PCR扩增,
即分别将 ABC、AB、BC、AC 株系的 DNA 进行混
合,再分别进行 PCR扩增,从中筛选出阳性信号强
的引物对组合。 当鉴定 A 株系时,即假设样本中
有 A株系存在,则将 ABC、BC 株系的 DNA 进行
混合,分别进行 PCR扩增,结果选择 ABC为阳性、
而 BC为阴性的引物对组合;假设样本中有 B株系
存在,则将 ABC、AC 株系的 DNA 进行混合,PCR
扩增结果选择 ABC 为阳性、而 AC 为阴性的引物
组合;假设样本中有 C株系存在,将 ABC、AB株系
的 DNA进行混合,PCR结果选择 ABC 为阳性、而
AB为阴性的引物组合。 PCR扩增结果见表 3。
依据初筛和复筛结果,从中选出了阳性信号
较强的8个引物对组合,作为检测葡萄黄化植原体的
特异引物组合。 鉴定 A株系,可使用 A4F / A7R引物
组合;鉴定B株系,可使用B2鄄1F / B6R、B2鄄2F / B3R、
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摇
摇 4 期 摇 摇 姜 华,等:3 种检疫性葡萄黄化植原体的快速检测
Table 1摇 Primers designed based on variable regions of 16S rRNA genes from three grapevine
yellows phytoplasma strains, Grapevine flavescence doree phytoplasma, Virginia grapevine
yellows phytoplasma and Australian grapevine yellows phytoplasma
Number Primer Primer sequence (5忆鄄3忆) Number Primer Primer sequence (5忆鄄3忆)
1 A1F GGAAACAGAAAGGCATCTTTTTG鄄 23 A5F GTAACTCGGTACTGAAGTTAACT
2 B1F GGAAAAGTAAAGGCATCTTTACT 24 C5F ACATTGGGTAAAACTAGTGTTG
3 C1F GAGATAAGAAGGCATCTTTTTATC 25 A5R GAGTTACCCCGACACTTAG
4 A2鄄1F CGGAGGGTATGCTTAAAGAG 26 C5R ACACTAGTTTTACCCAATGT
5 A2鄄2F CCACATTAGTT AGTTGGTGA 27 B6F TTTCTTGCGAAGTTATAGAAATATAA
6 B2鄄1F TCTTCTTTGAAGGTATGCTTAAG 28 C6F CCTTTTGCAAAGCGGTAGAAATATC
7 B2鄄2F ACACATTAGTTAGTTGGCAG 29 B6R TTATATTTCTATAACTTCGCAAGAAA
8 C2F GCAAGAGGTATGCTTAGGGAA 30 C6R GATATTTCTACCGCTTTGCAAAAGG
9 A3F CTTGACGTTATTCAATGAATAAGC 31 A7F GGGTTAAGTCCCGCAACG
10 B3F GAGTGGAAAAACTCCCTTGAC 32 A7R GCGGGACTTAACCCAAC
11 C3F GATGGTGGAAAAACCATTATG 33 A8F CTGTCGCTAGTTGCCAGCAC
12 A3R GAATAACGTCAAGATAGTTTTTC 34 C8F TGTTAATTGCCATCATTAAGTTGG
13 B3R GGAGTTTTTCCACTCTTTTTC 35 A8R GTGCTGGCAACTAGCGACAG
14 C3R TAATGGTTTTTCCACCATCTTTTC 36 C8R TGCTAAAGTCCCCAACTTAATGA
15 A4F GTCTTGTTATAGAAACTGTCTTG 37 A9F TAAACATTGGAGGAAGGTGGGGATA
16 B4F GTTGTGCTATAGAAACTGTTTTAC 38 C9F GTGATAAATTGGAGGAAGGTG
17 C4鄄1F GGTCTAAGTGCAATGCTTAACGT 39 A9R TATCCCCACCTTCCTCCAATGTTTA
18 C4鄄2F TTGTGATGCTATAAAAACTGTTTAG 40 C9R CGTCCCCACCTTCCTCCA
19 A4R CAAGACAGTTTCTATAACAAG 41 A10R TACTGAGACTACCTTTTTGAG
20 B4R CAACAGCGTTAAGCACTG 42 B10R TTCATTTTTTGAGATTGGCTAAG
21 C4鄄1R ACGTTAAGCATTGCACTTAGACC 43 C10R CGCCAAAAGCTTACGCTTT
22 C4鄄2R CTAAACAGTTTTTATAGCATCACAA
B2鄄2F / B6R和 B3F / B6R 引物组合;鉴定 C 株系,
可使用 C5F / C10R、C6F / C10R 和 C9F / C10R 引物
组合。 以这些引物对组合,进行 3 个株系样本的单
独及混合 DNA的 PCR扩增,其阳性信号均明显且
特异性强。
3摇 结论与讨论
3. 1摇 结论
依据对葡萄黄化植原体 3 个株系各自单独
DNA及混合 DNA 进行的 PCR 扩增结果,从中筛
选出来的特异性较强的 8 个引物对组合是:鉴定 A
株系(葡萄金黄化植原体),可使用 A4F / A7R 引物
组合,鉴定 B株系(维吉尼亚葡萄黄化植原体),可
使 用 B2鄄1F / B6R、 B2鄄2F / B3R、 B2鄄2F / B6R 和
B3F / B6R引物组合,鉴定 C 株系(澳大利亚葡萄
黄化植原体),可使用 C5F / C10R、C6F / C10R 和
C9F / C10R引物组合(引物序列见表 1)。 这些引
物对组合,能够同步、特异、快速地检测葡萄金黄化
植原体、澳大利亚葡萄黄化植原体和维吉尼亚葡萄
黄化植原体。
3. 2摇 讨论
葡萄黄化病是一种典型的流行性植原体病害,
病原菌主要通过带病繁殖材料和媒介昆虫(主要
是叶蝉)传播。 远距离传播主要靠苗木的调运,此
病在世界许多国家都有发生,所有的栽培葡萄均可
不同程度的感病[3,4,9 ~ 11]。 葡萄是大众水果,我国
南北方种植面积都很大,昆虫的迁飞和带菌苗木的
运输,很容易将病原物带到各地。 由于植原体病害
能潜伏侵染及人们对该病害的认识还不够,容易使
一些危险性植原体在进口检疫时蒙混过关,因此
说,随农产品传入我国的风险性很大,我们应该给
与足够的重视[2,12]。
葡萄黄化植原体 3 个株系同为软壁菌门
(Tenericutes) 、软球菌纲(Mollicutes) 、菌原体目
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摇
植物病理学报 41 卷
Fig. 2 摇 PCR amplification based on different
primer combinations using template
DNAs from three grapevine yellows
strains
A: PCR results with 42 primer combination targeted strain A.
Lanes 1鄄42: Template DNA from Strain A; Lanes 43鄄84:
Template DNA from Strain B; Lanes 85鄄126: Template DNA
from Strain C.
B: PCR results with 18 primer combination targeted strain B.
Lanes 1鄄18: Template DNA from Strain A; Lanes 19鄄36:
Template DNA from Strain B; Lanes 37鄄54: Template DNA
from Strain C.
C: PCR results with 43 primer combination targeted strain C.
Lanes 1鄄43: Template DNA from Strain A; Lanes 44鄄86:
Template DNA from Strain B; Lanes 87鄄129: Template DNA
from Strain C.
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摇 4 期 摇 摇 姜 华,等:3 种检疫性葡萄黄化植原体的快速检测
Table 3摇 Differentiation of three grapevine yellows phytoplasma strains
with specific primer combinations
Primer ABC BC Primer ABC AC Primer ABC AB
A1F / A9R + + + B2鄄1F / B3R + - C1F / C6R + -
A2鄄1F / A9R + + + B2鄄1F / B6R* + + - C2F / C10R + + +
A3F / A9R + + ( + ) B2鄄2F / B3R* + + - C3F / C10R + + +
A4F / A7R* + - B2鄄2F / B6R* + + - C4鄄1F / C10R + + +
A8F / A9R + + + B3F / B6R* + + - C4鄄2F / C10R + + +
B6F / B10R + - C5F / C10R* + + -
C6F / C10R* + + -
C9F / C10R* + + -
Note: ABC: Mixed DNA from phytoplasma strains A, B, and C. AB: Mixed DNA from strain A and B. BC: Mixed
DNA from strain B and C. AC: Mixed DNA from strain A and C. Strain A: Grapevine flavescence doree phytoplasma;
Strain B: Virginia grapevine yellows phytoplasma; Strain C: Australian grapevine yellows phytoplasma.
+ + : Positive with a band of high intensity; + : Positive with a band of medium intensity; ( + ): Positive with a band
of low intensity; - : Negative;*: Specific primer combinations for differentiation of individual grapevine yellows phyto鄄
plasma strains.
(Mycoplasmatales)、菌原体科(Mycoplasataceles)、
植原体属(Phytoplasma)成员,但它们不同组。 葡
萄金黄化植原体属于榆黄化组 Elm Yellews group
(16SrV鄄C)成员,维吉尼亚葡萄黄化植原体属于
X鄄病组 X鄄disease group ( 16Sr 芋) 成员,澳大利
亚葡萄金黄化植原体属于僵顶病组 Stolbur group
(16Sr狱鄄B)成员[13]。 3 个株系侵染葡萄后,导致
的病害症状相似,田间很难区分。 主要为叶片褪绿
黄化、朝下反卷,叶片向阳部分黄化,使叶片表面具
金属光泽;花序枯死,浆果凋萎;被侵染的藤条极度
下垂,生长严重不良;树势衰退迅速,枝梢变脆,顶
芽和侧芽坏死;感病植株产量下降,果实含糖低、品
质差[2 ~ 4]。 近些年,PCR技术使植原体等多种病原
物的检测与分类取得了令人瞩目的进展,对植原体
16S rRNA 的分析使人们从遗传本质上认识到了
植原体与其他原核微生物间的差异,同时也使人们
对植原体的检测达到了单拷贝基因检测水平
(phytoplasmas have two copies of 16S rRNA
genes) [14,15]。 一项好的诊断鉴定技术,应该具有
准确、快速、简便三要素,其中,最重要的是准确。
本研究筛选出来的 8 个引物对组合,是依据葡萄黄
化植原体 3 个株系 16S rRNA基因序列设计的,研
究证明:此 8 个引物对组合,能够同步、特异、快速
地检测葡萄金黄化植原体、澳大利亚葡萄黄化植原
体和维吉尼亚葡萄黄化植原体等 3 种葡萄检疫性
植原体。 这一方法的实效性尚需在实际应用中进
一步验证。
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责任编辑:曾晓葳
063