全 文 ：书西北植物学报!
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!
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"
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#$
#$&(#)*
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!!
文章编号$
#"""+$"!)
"
!"#$
#
"&+#$&+",
!!!!!!!!!!!!!!!
!"#
$
#"-*"*
%
.
-/001-#"""+$"!)-!"#$-"&-#$&
收稿日期$
!"#$+"$+"&
&修改稿收到日期$
!"#$+"+"&
基金项目$国家自然科学基金"
%"&"!$)
#
作者简介$李小平"
#&!(
#!男!博士!副教授!主要从事植物分子生物学研究
2+34/5
$
#!$$!%!"$
!66
-783
生长素响应因子
12!34$%
正调节
大豆叶片的衰老进程
李小平!曾庆发!张根生!赵
!
娟
"淮北师范大学 生命科学学院!安徽省资源植物重点实验室!安徽淮北
!%)"""
#
摘
!
要$采用实时荧光定量
9:;
"
6
9:;
#分析了
!"#$%#"
表达模式通过挖掘大豆基因组信息并参考拟南芥同
源基因序列!分析了大豆生长素响应因子
!"#$%#"
和小
;<=
分子
!"&"$#*"
作用位点!构建了
>
?3=;@#"
"
3?3=;@#"
"
3?3=;@#"
#抗降解表达载体&利用农杆菌介导法转化大豆!并对转基因植株叶片发育表型进行了分
析结果表明$
!"#$%#"
在大豆(
!(
)
*+,"-.
"
A-
#
BCDD/-
)根*茎*叶*花和果荚中均有一定程度的表达!其中花
内表达量最高!茎内最低!第一复叶表达量低于子叶和第一对真叶
"!"#$%#"
转基因植株复叶形状和大小与对
照组没有明显的差异!但其叶绿素含量和最大光量子效率"
%
E
%
%
3
#明显下降!叶片衰老标记基因
!"/012#
表达显
著增加研究认为!大豆生长素响应因子
?3=;@#"
参与了叶片衰老进程并可能是叶片衰老信号的重要组份
关键词$生长素响应因子&小
;<=
&抗降解表达&叶片衰老
中图分类号$
F,*
&
F,&
文献标志码$
=
&(#)*+,
-
"),+./01"2
!
12!34$%
!
3",#1#4+5
6
*+
7
5/1+,
8+/9:+)+,0+)0+32"0+,,+,#)1*
5
"-/)2$6
AGH/48
>
/1
I
!
J2I
K4
!
JL=I
!
JL=NOP41
"
:85C
I
C8KA/KCQ7/C17C0
!
LP4/RC/<8D345S1/ECD0/T
U
!
=1MP/9D8E/17C9541T0;C08PD7C0VC
U
A4R8D4T8D
U
!
LP4/RC/
!
=1MP/!%)"""
!
:M/14
#
&;,12/01
$
2W
>
DC00/81
>
4TTCD18K!"#$%#"
I
C1CX404145
U
YCZR
U
DC45+T/3C
6
P41T/T4T/EC9:;
"
6
9:;
#
3CTM+
8Z-[MCX8D\/1
I
38ZC5RCTXCC1!"&"$#*"41Z/T0T4D
I
CT0X40/1EC0T/
I
4TCZR
U
3/1/1
I
08
U
RC4141Z#3-4&
56
7
88
I
C183CZ4T4
!
41ZTMCDC0/0T41TECD0/81EC7T8D?3=;@#"
"
3?3=;@#"
"
3?3=;@#"
#
X407810TDP7+
TCZ-[MC"!"#$%#"EC7T8DX40TD410K8D3CZ/1T8X/5ZT
U>
C08
U
RC41R
U
#
9
364-*:;"+3CZ/4TCZ3CTM8Z41Z
TD410
I
C1/7
>
541T0XCDC
>
MC18T
U>
CZ
>
M
U
0/858
I
/745
U
41Z385C7P54D5
U
-[MCDC0P5T00M8XCZTM4TTD4107D/
>
T08K
!"#$%#"CWM/R/TTMCM/
I
MC0T5CEC50/1K58D458D
I
41041ZTMC58XC0T5CEC50/10TC304381
I
TMCTC0TCZ08
U
+
RC418D
I
410-B8DC8ECD
!
/T0TD4107D/
>
T/81455CEC5X40K8P1Z58XCD/1K/D0TTD/K85/854TC5C4EC0TM41C/TMCD/1
78T
U
5CZ8108D/1P1/K85/854TC5C4EC0-[MCDC/018ZD434T/745
U
Z/KKCDC17CRCTXCC1TMCTD410
I
C1/75C4EC041Z
TMC781TD855C4EC0/1DC0
>
C7T8K5C4K0M4
>
C41Z0/YC-L8XCECD
!
TMC5C4EC08KTD410
I
C1/7
>
541T00M8XZC7DC40CZ
5CEC50/17M58D8
>
M
U
5781TC1T41Z34W/3P3
6
P41TP3CKK/7/C17
U
"
%
E
%
%
3
#
41Z/17DC40CZTD4107D/
>
T/818K!"&
/012#
!
40C1C07C17C+40087/4TCZ34D\CD-[4\C1T8
I
CTMCD
!
TMC0CDC0P5T00P
II
C0TTM4TTMC08
U
RC414PW/1DC+
0
>
810CK47T8D?3=;@#"34
U
RC/1E85ECZ/15C4K0C1C07C17C41Z5/\C5
U
47T404
>
80/T/ECDC
I
P54T8D/15C4K0C+
1C07C17C-
<+
6
="2!,
$
4PW/1DC0
>
810CK47T8D
"
=;@
#&
3/7D8;<=
&
DC0/0T41TECD0/81
&
5C4K0C1C07C17C
!!
叶片衰老是植物叶片生长发育的最后阶段!该
过程发生一系列细胞学*生物化学及分子生物学事
件叶片衰老的启动*进行和完成受到细胞内外多
种因素"因子#的影响(#+!)植物激素尤其是细胞分
裂素和乙烯是叶片衰老的重要调节因子!它们通过
其信号转导组份来延缓或促进叶片衰老进程(%+))
生长素及其信号组份在叶片衰老中调节作用目前还
证据不足虽然通过突变体表型分析!发现在拟南
芥
#:#$%#
和
#:#$%!
参与调 控 植 物 叶 片 衰
老(*+)!但具体的调控机制还远未清晰
植物体内!生长素合成部位和功能部位是不完
全重合的!其功能的发挥需要长和%或短距离的极性
运输(,+&)在功能部位!生长素受体
[G;#
*
=PW
%
G==
转录因子*生长素响应因子"
=;@0
#和具有生
长素响应元件"
=PW;20
!
[?[:<:
#的下游靶基因
组成生长素细胞信号转导的主要组份(#")当生长
素含量很低时!
=PW
%
G==
蛋白与
=;@0
结合!阻遏
了下游靶基因的转录&当生长素的含量增加时!生长
素就会起到分子胶的作用!使
=PW
%
G==
蛋白与
[G;#
结合在一起!形成
Q:@
[G;#
+
生长素
+=PW
%
G==
复合体&之后
=PW
%
G==
蛋白被降解!导致
=;@0
脱
离
=PW
%
G==
的抑制并与下游
=PW;2
结合!从而完
成生长素的信号转导进程(##+#))
=;@0
除了受
=PW
%
G==
蛋白的调节外!还受
B/7D8;<=0
"
3/;<=
#的调控
3/;<=
依靠序列
不完全配对方式寻找靶基因
3;<=
并进而抑制靶
基因的活性!即在转录后水平上介导靶基因降解或
抑制翻译来调节基因的功能(#*)在不改变靶基因
编码序列的前提下!增加靶基因与
3/;<=
非配对
位点!可以抵抗
3/;<=
对靶基因的降解!称之为抗
降解表达"
DC0/0T41T+ECD0/81
#抗降解表达是一种
特殊形式的过表达!可以用于靶基因的功能研究
研究发现!抗降解表达
#:#$%#"
%
#*
拟南芥"
#3-4&
56
7
88:<-(-+-
#植株!其
#$%#"
%
#*3;<=
降解受到
抑制!叶片发育和生殖生长都受到一定程度的影
响(#+#,)抗降解表达
#:#$%#
拟南芥植株!幼苗侧
根生长受到抑制!
0=>#
%
!?%@!
*
!?%@%
*
!?%@)
和
=%A#
%
!?%-*
等基因的表达受到调节(#&)
抗降解表达
#:#$%#"
拟南芥叶片发育和生殖
生长 都 受 到 影 响(#,)!而 大 豆 中 的 同 源 基 因
!"#$%#"
"
!(
)
"-#%
9
$""%"
!以下称为
!"#$%#"
#
是否具有相似功能还不是很清楚本试验以大豆生
长素响应因子
!"#$%#"
为研究对象!分析了器官
表达模式!构建了抗降解表达双元载体通过农杆
菌介导法转化大豆!分析了转基因植株"以下称
"!"#$%#"
#叶片发育表型本研究为阐明生长素
响应因子
#$%#"
在植物发育中的功能提供了一定
参考资料
#
!
材料和方法
$-$
!
供试材料
$-$-$
!
菌种和质粒
!
菌种
B@*6(]L)4
&农杆菌
A^ $$"$
&植物表达载体
>
?_^ $%%+B#
!由本实验室
提供
$-$->
!
试剂与酶
!
普通
9:;
试剂和限制性内切酶
购自
[4V4;4
公司&
]<=
标准分子量购自全式金公
司&长片段高保真
VN]
酶购自上海东洋坊公司&
[=+[8
>
87581/1
I
和
A;
重组反应试剂盒购自
G1+
E/TD8
I
C1
公司&
;C45+T/3C9:;
试剂盒购自
G^N+
;=]
高纯质粒小量提取试剂盒!购自威格拉斯生
物技术公司!其它试剂均为上海生工产品
$-$-?
!
引物
!
根据
MTT
>
$%%
Z/414-/3/0-4TMC14+/1+
18E4T/81-
I
D
%提供
!"#$%#"
序列并结合
<:^G
数
据库相应
2Q[
!利用
N5/
I
8*-"
设计
!
组引物
"
?3=;@#"+@#
%
;#
!
?3=;@#"+3@!
%
3;!
#序列
标有下划线的为
!"&"$#*"
靶序列
?3=;@#"+
@#
引物中
)`
端的
:=::
是用于
[8
>
8
克隆用引
物组 合
?3=;@#"+G@#
%
G;#
鉴 定 转 基 因 植 株&
?3=;@#"+G@#
是
"!"#$%#"
上 的 特 定 序 列!
?3=;@#"+G;#
对应双元表达载体上的
!C1
基因
中的特定序列"表
#
#
表
$
!
定量
3@*
!构建载体和鉴定转基因的引物
[4R5C#
!
9D/3CD0K8DDC45+T/3C9:;
!
TMCR/14D
U
7810TDP7T/81
41Z/ZC1T/K/74T/818KTD410
I
C1/7
>
541T0
引物
9D/3CD
序列
QC
6
PC17C
"
)`
#
%`
#
6
?3=;@#"+@# =?=[?:[==[=[?==:[?====[[::
6
?3=;@#"+;# ==?==[=?:===:[:?:[:?[?
?3=;@#"+@# 7477:::[=[[[?=:[=[?=:[=:=[?:=[
?3=;@#"+;# :[[==[::=:=[:=:=[===[=:=:[=[::
?3=;@#"+3@!
[?:=???=[=:==??:?::=??:=[[:[+
:===[[??==[=[:[[[=
?3=;@#"+3;!
?==?::[??:?::[[?[=[:::[[?:=?+
?=?:?[[=[:=?=?=?=
?3=;@#"+G@# ?::?:?[:[=:=:?[:=:[=?
?3=;@#"+G;# =:??[?=[=[:?[::=:::=
?3:aQ9#+@# [:[::[===?=[?==:[[[?==[?:[%
?3:aQ9#+;# [:=:[:===::==:[[?===[=[[[=
=:[!
%
+@# :[[:::[:=?:=::[[::==
=:[!
%
+;# ??[::=?:[[[:=:=:[::=[
")#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
$->
!
方
!
法
$A>A$
!
荧光定量
3@*
!
;<=
提取和反转录按文
献(
#*
)进行!反转录产物通过
/^8+D4Z
定量
9:;
仪
"
B/1/N
>
T/781
[B
#进行分析用引物
6
?3=;@#"+
@#
%
;#
分析
!"#$%#"
器官表达特征"表
#
#!扩增
片段大小为
#*%R
>
!对应
!"#$%#"%`+S[;
部分!
是该基因的特定序列
!"/012#
基因转录受衰老
诱导!编码半光氨酸蛋白水解酶!为衰老标记基因
用引物
?3:aQ9#+@#
%
;#
分析
!"/012#
!扩增片
段为
#*!R
>
定量
9:;
的内标基因是
!"#/D!
%

!用
=:[!
%
+@#
%
;#
引物组合进行扩增!扩增片段
大小为
##&R
>

!"#$%#"
和
!"/012#
表达量相
对于内标基因
!"#/D!
%

器官表达材料$营养生
长期"
b2
#!完全破土的子叶&营养生长期"
b:
#!完
全展开的第
#
对真叶&营养生长期"
b:
#!小苗的全
根&营养生长期"
b:
#!小苗的全茎&营养生长期
"
b#
#!最先出现的完全展开第
#
复叶&营养生长期
"
b!
#!完全展开的第
!
复叶&营养生长期"
b%
#!完全
展开的第
%
复叶&生殖生长期"
;#
#!首次开放的花&
生殖生长期"
;%
#!最顶端长度
)33
左右的幼嫩果
荚&生殖生长期"
;)
#!主茎顶端果荚中
%33
长的
大豆种子衰老基因表达材料$各基因型展开
%Z
*
!"Z
和
$"Z
第
#
复叶试验材料均用液氮速冻保
存!每组重复
%
次
$->->
!
序列分析
!
?3=;@#"
与
=T=;@#"
的蛋
白质序列比对采用
:SQ[=A
在线分析"
MTT
>
$%%
XXX-CR/-47-P%
[8850
%
304
%
75P0T458
%#蛋白质结
构预测基于
<:^G+^A=Q[
在线分析
$->-?
!
克隆和测序
!
按照
G1E/TD8
I
C1
公司的
[8
>
8
7581/1
I
方法进行切胶回收相应片段与
[8
>
8
载
体按
%c#
混合"
#"
"
A
#!用拓扑异构酶在
!!d
反应
)
#
#"3/1
!取反应产物
#
#
!
"
A
"
>
:;!-#+3?+
3=;@#"
#用电击转化法转化感大肠杆菌受态细胞
B@*6(]L)4
"
/^8+;4Z
!
-)\E
%
"
3
%
30
#转化得到
的阳性克隆"卡那霉素抗性!
V41
;
#!经
9:;
和酶切
鉴定后!送上海生工测序!测序正确的克隆用于下游
A;
反应
$->-B
!
表达载体的构建及农杆菌转化
!>
2<[;a+
3?3=;@#"
载体和植物双元载体
>
?_ $^%%+B#
进行体外
A;
反应!获得植物表达载体取鉴定成
功的质粒
#
#
!
"
A
"
>
?3=;@#"
"
3?3=;@#"
#用
电击转化法转化农杆菌感受态细胞
A^ $$"$
"
/^8+
;4Z
!
-)\E
%
"
3
%
30
#转化后的农杆菌重悬于
#
3Aa29
培养基中!以
!,d
%
!""D
+
3/1
(#培养
!
#
%M
!然后取
)"
#
#""
"
A
涂在具有卡那霉素和潮酶
素"
L
UI
;
#双抗
a29
培养基上!
,d
倒置培养
!
#
%
Z
挑选已分散开的单克隆!经菌裂解
9:;
鉴定稳
定表达的阳性克隆!用子叶节法转化大豆"科丰
%$
!
天津农科院提供#
$->-C
!
大豆转化
!
以科丰
%$
品种大豆为材料!采
用子叶节方法!转化过程按文献(
!"
!
!#
)并加以调
整各阶段培养基成分$"
#
#萌发培养基"
I
43R8D
I
^
)
R40C045Te0P7D80C%"3
I
%
A
!
>
L)-,
!
4
I
4D*-)
I
%
A
#&"
!
#共培养培养基"
#
%
#"
I
43R8D
I
^
)
R40C045T
e
I
43R8D
I
^
)
E/T43/1eB2Q%-&
I
%
Ae0P7D80C%"
I
%
Ae =^9#-,3
I
%
Ae?=
%
"-!35
%
Ae=Q"-#
I
%
Ae][[!""3
I
%
Ae:
U
0$""3
I
%
A
>
L)-!
!
4
I
4D80C$-)
I
%
A
#&"
$
#芽诱导培养基"
I
43R8D
I
^
)
R40C045Te
I
43R8D
I
^
)
E/T43/1eB2Q#-!
I
%
Ae
0P7D80C%"
I
%
Ae =^9#-,3
I
%
Ae:CK!""3
I
%
Ae
:4DR)""3
I
%
A
!
>
L)-$
!
>
M
U
T4
I
C5%-"
I
%
A
#&"
*
#生
根培养基"
I
43R8D
I
^
)
R40C045Te
I
43R8D
I
^
)
E/T4+
3/1eB2Q#-!
I
%
Ae0P7D80C%"
I
%
AeG==#3
I
%
A
!
>
L)-,
!
4
I
4D*-)
I
%
A
#
$->-D
!
转基因植株鉴定
!
通过基因组
9:;
并结合
转基因植株表型特征!分别鉴定
[
"
*
[
#
*
[
!
和
[
%
代
转基因大豆从最初
&
个
[
"
代中!最后获得
*
株可
以稳定遗传的株系!试验取
[
%
代植株进行分析
$->-E
!
叶片生理参数测定
!
大豆在具
!%
#
!*d
和
#*M
白天%
,M
黑夜光周期的人工培养室中繁殖生
长用二甲基甲酰胺黑暗浸提叶绿素
$,M
后!分别
测定
**$13
和
*$13
吸光值!计算叶绿素含量!
以叶片鲜重每
I
含有多少
3
I
叶绿素来计量(!!)最
大光量子效率
9Q
$
"
%
E
%
%
3
#用脉冲调制荧光仪进
行测定"
@BQ+!
!
L4104TC7M
!
V/1
I
,
0A
U
11
!
SV
#
(
!%
)

测量材料$各基因型展开
%Z
*
!"Z
和
$"Z
第
#
复
叶!每组重复
%
次
!
!
结果与分析
>A$
!
12!34$%
克隆和序列分析
以
=T=;@#"
氨基酸序列为查询序列!利用
<:^G+^A=Q[9
"
MTT
>
$%%
R540T-17R/-153-1/M-
I
8E
%
5^40T
>
#!
Q8
U
R40C
"
MTT
>
$%%
XXX-08
U
R40C-8D
I
%#和
9M
U
T8Y83C
"
MTT
>
$%%
XXX-
>
M
U
T8Y83C-1CT
%#互联网
在线分析比对!确定
?3=;@#"
"
?5
U
34#%
I
$""%"
#
为
=T=;@#"
同源基因"
2f"
#!氨基酸序列相似性
为
)g
用
?3=;@#"+@#
%
;#
引物组合!以科丰
%$
基因组为模板!
9:;
扩增
!"#$%#"
基因组序列
#)#
&
期
!!!!!!!!!!
李小平!等$生长素响应因子
!"#$%#"
正调节大豆叶片的衰老进程
并克隆到
[8
>
8
载体随机挑选
*
个克隆进行测序!
发现所测序列与
Q8
U
R40C
公布序列完全一致!表明该
段基因组序列在科丰
%$
与
_/5/430,!
品种之间没
有
]<=
多态性
!"#$%#"
转录本的序列也与
Q8
U
+
R40C
公布序列一致"
;[+9:;
引物未列出#!表明内含
子剪切和外现子组成在
!
个品种间是一致的利用
<:^G+^A=Q[
比较
?3=;@#"
和
=T=;@#"
蛋白质结
构!如图
#
所示!它们都具有转录结构域"
%^
-
]<=
#*
生长素响应转录因子保守结构域"
=SHG<
-
;2Q9
#和
生长素快速诱导转录结构域"
=SH
-
G==
#三大结构
而且!三 大 结 构 域 分 布 位 置 在
?3=;@#"
和
=T=;@#"
序列之间非常相似$
=T=;@#"
的
%^
-
]<=
由第
#%&
和
!#$
氨基酸之间 序 列 组 成!
?3=;@#"
的
%^
-
]<=
由第
#%$
和
!"&
氨基酸之
间序列组成&
=T=;@#"
的
=SHG<
-
;2Q9
由第
!)*
和
%)!
氨基酸之间序列组成!
?3=;@#"
的
=SHG<
-
;2Q9
由第
!$
和
%%*
氨基酸之间序列组成&
=T=;@#"
的
=SH
-
G==
由第
)%*
和
*$!
氨基酸之
间序列组成!
?3=;@#"
的
=SH
-
G==
由第
)""
和
*#,
氨基酸之间序列组成
?3=;@#"
和
=T=;@#"
具有相同结构域及相似的布局特征暗示它们可能在
生长素信号转导中发挥相似的功能
>A>
!
12!34$%
器官表达特征
研究基因的时空表达模式有助于分析和了解对
应基因的功能经过序列比对和分析!在
!"#$%#"
的
%`+S[;
区设计
#
对引物"表
#
#!按大豆发育时期
顺序!对各器官进行定量分析结果"图
!
#表明!
!"#$%#"
在大豆不同时期各器官中皆有一定程度的
表达!其中花中表达最强!而在茎中表达最弱!复叶
"第
#
至第
%
#中表达量低于真叶和子叶
!"#$%#"
图
#
!
?3=;@#"
和
=T=;@#"
氨基酸序列比较
@/
I
-#
!
QC
6
PC17C045/
I
13C1TRCTXCC1?3=;@#"41Z=T=;@#"
!)#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
在多个器官表达的这种广谱性特征暗示该基因可能
参与多个器官的生长和发育过程
>A?
!
构建抗降解表达载体和转化
212!34$%
为了探究
!"#$%#"
在叶片等器官中的功能!通
过重叠
9:;
方法构建
!"#$%#"
抗降解表达双元载
体并利用农杆菌介导法转化大豆
!"#$%#"
基因序
图
!
!
!"#$%#"
在大豆各器官或组织中
表达的
6
;[+9:;
分析
=-
子叶&
-^
第
#
对真叶&
:-
根&
]-
径&
2-
第
#
复叶&
@-
第
!
复叶&
?-
第
%
复叶&
L-
花&
A-
果荚&
B-
种子
@/
I
-!
!
=145
U
0/08K!"#$%#"CW
>
DC00/815CEC504T08
U
RC41
Z/KKCDC1T8D
I
41041Z
%
8DT/00PC0P0/1
I6
P41T/T4T/EC;[+9:;
=-:8T
U
5CZ81
&
-^S1/K85/4TC5C4EC0
&
:-;88T
&
]-QTC3
&
2-@/D0TTD/K85/4TC5C4EC0
&
@-QC781ZTD/K85/4TC5C4EC0
&
?-[M/DZ
TD/K585/4TC5C4EC0
&
L-@58XCD
&
A-98Z0
&
B-QCCZ0
列长为
$"&R
>
!包括
)`
端和
%`
非翻译区!
:]Q
序列
长为
!"#%R
>
!
!"-&"$#*"
识别位点在
!"#$%#"
的
:]Q
区!
"#$%#"
与
!"-&"$#*"
识别区只有
#
对碱基不配对在构建抗降解表达时!采用图
%
!
=
所示的策略!使不配对碱基对数提高到
$
对!但保持
编码蛋白质序列不发生改变如图
%
!
^
所示!通过引
物
?3=;@#"+3@!
!
?3=;@#"+3;!
引入不配对的碱
基!以
:[=^
法获得大豆".科丰
%$
,#基因组为模板!
加入 引 物
?3=;@#"+@#
和
?3=;@#"+3;!
通 过
VN]
酶进行扩增!切胶回收扩增片段
=
&同理!用
?3=;@#"+3@!
和
?3=;@#"+;!
进行扩增!得到片
段
^
混合片段
=
和
^
形成重叠
9:;
模板!用引物
?3=;@#"+@#
和
?3=;@#"+;#
和
VN]
酶!进行第三
次
9:;
"
NECD54
>>
/1
I
9:;
#!得到
3?3=;@#"
由于
3?3=;@#"
序列较长!内有多个内切酶位点!直接用
酶切连接进行构建比较困难!所以我们在引物
?3=;@#"+@#
的
)`
端引入
:=::
"表
#
#!切胶纯化后
的
"!"#$%#"
通过
[8
>
8
克隆到
>
2<[;a
载体
上并送上海生工进行测序!序列完全正确的用于下
游重组反应"
A;
反应#
>
2<[;a
载体和植物双元
载体
>
?_ $^%%+B#
具有进行重组反应的侧翼序列
"
4TTA
和
4TT;
#!在重组酶的存在下可以进行体外
A;
反应!这样就很容易构建表达
"!"#$%#"
的双
图
%
!
!"#$%#"
抗降解表达载体的构建和转基因植株
9:;
鉴定
=-"!"#$%#"
和
!"&"$#*"
配对示意图&
-^
重叠
9:;
合成
"!"#$%#"
&
:-
双元表达载体
[+]<=
结构&
]-
农杆菌
9:;
鉴定&
2-
转基因植株
9:;
鉴定
@/
I
-%
!
:810TDP7T/818KDC0/0T41TEC7T8D!"#$%#"41Z/ZC1T/K/74T/818KTD410
I
C1/7
>
541T0P0/1
I
9:;3CTM8Z
=-]/4
I
D438K34T7M/1
I
0TD4TC
IU
RCTXCC1"!"#$%#"41Z!"&"$#*"
&
-^Q
U
1TMC0/08K"!"#$%#"
P0/1
I
8ECD54
>>
/1
I
9:;
&
:-[+]<=0TDP7TPDC8KTMC"!"#$%#"R/14D
U
EC7T8D
&
]-9:;/ZC1T/K/74T/818K
>
PT4T/EC
#
9
364-*:;"78581/C0
&
2-9:;/ZC1T/K/74T/818KTD410
I
C1/7
>
541T0CW
>
DC00/1
I
"!"#$%#"
%)#
&
期
!!!!!!!!!!
李小平!等$生长素响应因子
!"#$%#"
正调节大豆叶片的衰老进程
图
$
!
"!"#$%#"
转基因大豆植株表型
=-
生长
%"Z
野生型&
^
#
]-
生长
%"Z
的抗降解表达转基因株系"
"!"#$%#"+A!
%
A$
%
A)
!
[
%
代#
=
#
]
中镶嵌插图为相应基因型的第
#
复叶
@/
I
-$
!
9MC18T
U>
C08KTD410
I
C1/7
>
541T0CW
>
DC00/1
I
DC0/0TECD0/81"!"#$%#"
=-%"+Z4
U
+85ZX/5ZT
U>
C
>
541T
&
(^]-[MC%"+Z4
U
+85ZTD410
I
C1/7
>
541T0CW
>
DC00/1
I
"!"#$%#"
"
5/1C0+A!
%
A$
%
A)
#"
[
%
I
C1CD4T/81
#
-
G10CDTCZ0C7T/810/1=T8]/1Z/74TCTMC78DDC0
>
81Z/1
I
K/D0TTD/K85/4TC5C4EC08KZ/KKCDC1T
I
C18T
U>
C0
元载体为了使
"!"#$%#"
表达时空性与
!"#$%#"
相似!双元载体"
>
?3=;@#"
"
3?3=;@#"
#中包括
!"#$%#"
的
)`
和
%`
端调控序列"图
%
!
:
#
A;
反应
结束后转化大肠杆菌并涂布在具有双抗"卡那霉素和
潮霉素!
V41
;
%
L
UI
;
#
A^
平板上进行培养!挑选生长
健旺的克隆!提取质粒并酶切鉴定构建成功的表
达载体
>
?3=;@#"
"
3?3=;@#"
利用电转化仪
导入到农杆菌
A^ $$"$
!通过抗性筛选!挑选具有抗
性单 克 隆 进 行 菌 裂 解
9:;
鉴 定!用 引 物
?3=;@#"+G@#
和
?3=;@#"+G;!
!扩增片段
*,#R
>
"图
%
!
]
#鉴定正确的克隆直接用于大豆子叶节转
化!共获得了
&
株抗性大豆植株"
[
"
#!提取基因组
后用引物
?3=;@#"+G@#
和
?3=;@#"+G;#
进行
9:;
分析结果"图
%
!
2
#显示!其中有
*
株"株系
!
*
$
*
)
*

*
,
*
&
#表型稳定!
[
%
转基因
9:;
鉴定结果与
[
"
代一致
>AB
!
12!34$%
参与调控叶片衰老进程
大豆为单次性结实衰老植物!叶片发育明显受
生殖期的影响在大豆开花结实之前!各复叶按时
间先后顺序展开发育成熟在该过程中!叶片组织
的细胞和亚细胞结构发育都趋于完成!尤其是叶绿
体发育完全成熟!光合作用旺盛!光合能力强!为大
豆进入生殖生长提供充分的准备当大豆开始结实
时!处于植株最下面的第
#
复叶开始出现衰老症状
随结实量的增加!第
#
复叶衰老进程随之逐渐加快
人工除去豆荚能够延缓复叶这种衰老过程抗降解
图
)
!
"!"#$%#"
对叶绿素含量*最大光量子效率
和
!"/012#
基因表达的影响
_[-
野生型&
A!-
株系
!
&
A$-
株系
$
&
A)-
株系
)
@/
I
-)
!
2KKC7T08K"!"#$%#"817M58D8
>
M
U
5781TC1T
!
%
E
%
%
3
41Z!"/012#CW
>
DC00/81
_[-_/5Z+T
U>
C
&
A!-A/1C!
&
A$-A/1C$
&
A)-A/1C)
$)#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
表达
!"#$%#"
后!虽然转基因植株高度和叶片形
态与野生型没有显著差异"图
$
#!但展开
%Z
*
!"Z
和
$"Z
第
#
复叶叶绿素含量只有同期对照的
$g
左右"图
)
!
=
#!表明叶片中过多的
!"#$%#"
转录
本抑制叶片叶绿素合成或促进叶绿素降解!导致叶
绿素含量减少叶片衰老的主要特征是叶绿体的崩
溃!叶绿素的降解和相关大分子动员!最大光化学效
率
9Q
$
的显著下降(!$)如图
)
!
^
所示!在
"!&
"#$%#"
第
#
复叶中!无论是展开
%Z
还是
$"Z
!与对
照组相比!最大光量子效率均下降了
%"g
!说明抗降
解表达
!"#$%#"
导致叶片提前进入衰老状态叶
片衰老标记基因表达可以从基因水平探测衰老程序
的启动和进展如图
)
!
:
所示!在展开
%Z
的第
#
复
叶中!对照组叶片衰老标记基因
!"/012#
表达量极
低!而抗降解表达
!"#$%#"
叶片表达量为对照组的
#"
倍!这表明积累过多的
!"#$%#"
足以在叶片展
开早期阶段启动衰老进程
%
!
讨
!
论
大豆"
_/5/430,!
#基因组测序的完成为反向
遗传学方法研究基因功能提供坚实的数据平台(!))
然而!大豆为古多倍体!基因结构和基因组成与拟南
芥和水稻有一定的区别!因此用基因缺失突变方式
研究大豆
!"#$%#"
的功能较为困难而通过修饰
?34+3/;#*"
的配对位点!构建
"!"#$%#"
转基因
植株!可以从获得性功能角度来研究
!"#$%#"
的
功能
=;@#"
是生长素信号转导重要组份!其表达量
在各器官和组织中维持一定水平!转录和转录后水平
的精确调控是完成其功能的重要保证
!"-&"$#*"
通过转录后水平调节
!"#$%#"
的表达并达到一种
平衡!任何干扰和破坏这种平衡都有可能导致发育异
常人工修饰
!"-&"$#*"
的靶位点!使
!"#$%#"
的不配对碱基对数提高到
$
对!干扰了
!"-&"$#*"
对
!"#$%#"
的相互作用!阻碍了
!"-&"$#*"
对
!"#$%#"
的降解作用在
!"#$%#"
降解受阻的植
株中!展开
%Z
的第一复叶!其最大光量子效率下降
了
%"g
!衰老标记基因
!"/012#
表达显著提高较
低的最大光量子效率和衰老基因高水平表达是叶片
衰老 的 典 型 特 征
"!"#$%#"
叶 片 积 累 多 余
!"#$%#"
直接导致叶片提前启动衰老进程!暗示
!"#$%#"
是大豆叶片衰老的正调节子在第
#
复叶
展开
!"Z
至
$"Z
过程中!抗降解表达植株的叶绿素
含量下降程度*最大光量子效率维持和
!"/012#
上
调幅度与对照基本一致!说明抗降解表达
!"#$%#"
没有影响此阶段的发育进程第
#
复叶展开
$"Z
!在
我们的栽培条件下!野生型对照大豆还没有开花结
实!第
#
复叶衰老还没有完全启动!虽然已经观察到
叶绿素含量下降和衰老基因上调表达!但最能反映叶
片发育参数的最大光量子效率基本没有变化可以
推测!抗降解表达大豆
!"#$%#"
后!大豆叶片中
!"#$%#"
转录本稳定性提高!叶片细胞内其编码
的蛋白"
?3=;@#"
#比例增加!从而激活更多的下
游响应基因!这些响应基因直接或间接作用于衰老
相关基因!加速了叶片衰老进程的启动
>
?_^ $%%+B#
骨架具有
%
个细菌抗性基因!分
别为氯霉素*卡那霉素和潮霉素抗性基因!氯霉素抗
性基因是负筛选基因!可以去除
A;
反应中过剩的
>
?_^ $%%+B#
!而卡那霉素和潮霉素抗性基因是正
筛选基因!可以去除
A;
反应中过剩的
[8
>
8
载体
另外!为了使下游转基因筛选过程易于操作!我们对
双元表达载体进行简单改造!增加除草剂抗性基因
标记!可以对将来转基因大豆进行田间复筛整合
[8
>
8
载体和
A;
反应来构建双元载体
>
?3=;@#"
"
3?3=;@#"
!主要是因为
!"#$%#"
基因组序列
较长!用限制性内切酶酶切连接很难获得目标载体
[8
>
8
载体很方便进行
9:;
片段克隆!只要在
9:;
正向引物
)`
端引入
:=::
就可以把片段克隆进去
>
?_^ $%%+B#
是专门开发出来并用
A;
重组反应
来完成双元表达载体的构建!具有多个表达元件组
合!为载体构建提供多种选择
!"#$%#"
表达分析表明该基因在多个器官中
表达!但表达量在各器官间有较大差异!暗示不同器
官或组织通过启动子等相关调控元件来调控该基因
的高低有无如果用组成型表达启动子"烟草花椰
菜病毒!
%)Q
#来驱动
"!"#$%#"
的表达!
"#$%#"
在某些器官组织中大量积累且抑制其生长!这样就
有可能得不到转基因植株我们在筛选拟南芥
%)Q
"
3=T=;@#"
转基因植株时!发现在筛选培养基中
出现有少量抗性苗!移栽到正常培养基或土壤中却
不能成活!而用
#:#$%#"
本身的启动子驱动!可以
得到大量转基因植株!说明应用
%)Q
强启动子不适
合驱动
"!"#$%#"
的表达因此!我们在构建抗
降解表达
!"#$%#"
时!使用该基因本身启动子来
启动
%)1
"
!"#$%#"
转基因大豆"结果未显示#
和
%)1
"
#:#$%#"
转基因拟南芥!皆没有观察到与
野生型之间的显著差异!推测大豆中
!
源
EF$#*"
完全抑制了过多的
!"#$@#"
转录本
"#:#$%#"
))#
&
期
!!!!!!!!!!
李小平!等$生长素响应因子
!"#$%#"
正调节大豆叶片的衰老进程
转基因果荚一定程度转曲(#,)!但
"!"#$%#"
转基
因豆荚没有这种现象!表明虽然
?3=;@#"
和
=T=;@#"
序列结构非常相似!但不同的物种在作用
模式上具有一定的特异性
参考文献"
(
#
)
!
?=!
=B=QGI
0C10C8K0C1C07C17C
$
385C7P54D
I
C1CT/7DC
I
P54T/8141Z341/
>
P54T/818K5C4K0C1C07C17C
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>
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C1CTM4T/0/1E85ECZ
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