全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
!"#$)"%)"!
&修改稿收到日期$
!"#$)"$)#$
基金项目$北京市自然科学基金"
&#!!""$
#&北京市教委科技创新平台项目"
123!"#%)"#$!",)""""*#
#&北京市教委科技提升计划项目
"
123!"#%)"#$!",)"""",
!
123!"#$)"#$!",)""""4#
#
作者简介$邵
!
杨"
#"(
#!女!硕士!主要从事花卉栽培与育种研究
5)67.8
$
#*!#"%",*$
!
#&%+9:6
"
通信作者$张克中!博士!教授!主要从事花卉育种与产业化研究
5)67.8
$
;<;;=>
!
?.
@
+/.07+9:6
东方百合系内杂交授粉技术
与胚抢救技术研究
邵
!
杨#!温韦华#!崔金腾#!贾月慧!!张克中#"
"
#
北京农学院 园林学院!北京
#"!!"&
&
!
北京农学院 植物科技学院!北京
#"!!"&
#
摘
!
要$研究了东方百合系内杂交授粉技术及胚抢救技术结果表明$"
#
#在组合(
AB/C.07
)
D
(
EFG87
)中!采用柱头
直接授粉!花粉管在花柱中向下定向生长!在子房中向胚珠定向生长&采用切花柱授粉!花粉管在花柱切口及子房
中发生不同程度无向性生长&残留花柱越长!进行胚珠定向的花粉管数量越多!获得的饱满种子越少!采用柱头直
接授粉获得的饱满种子最多"
!
#采用柱头直接授粉对东方百合系内
*&
个组合进行杂交实验!仅
#
个组合未获得
饱满胚珠*
%
个组合获得胚珠少于
#"
个!其余
*!
个组合获得大量饱满胚珠!初步表明此法可作为东方百合系内杂
交通用授粉技术不同胚抢救技术试验结果显示!授粉约
,">
后采用切胚珠接种比胚珠直接接种的杂种胚萌动
快*萌发率高!而且前者的胚抢救效率也明显高于授粉
$">
后的+剥胚式接种,研究认为!授粉约
,">
后采用+切
胚珠接种,可作为东方百合系内杂交通用胚抢救技术
关键词$东方百合系内杂交&授粉技术&花粉管定向&胚抢救
中图分类号$
H$$+$%
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H4#%+#
I
!
文献标志码$
J
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AB/C.07
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Y:_0:Y678
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67
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8B6
@
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67
@
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Z
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67
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!!
目前国内市场上东方百合品种较为单调!主要
为(
E:Y]:00G
)*(
E.]GY.7
)*(
J97
@
B89:
)*(
\.]GY
)等几
个品种!满足不了消费者对于东方百合多样化的需
求北京农学院从国外种球公司获赠
#$
个新颖的
东方百合品种"每个品种各
*
"
#"
个种球#!拟利用
其提供花粉!与国内常见东方百合进行杂交!以期增
加国内东方百合品种的多样性
东方百合品系"
!"#"$%:Y.G0C78F
Z
]Y.>/
#主要
血统来源于百合属"
!"#"$%
#具叶柄组"
JY9FG8.Y.:0
/G9C.:0
#野生百合其育成有如下
$
种情形$"
#
#具
叶柄组不同野生百合之间杂交&"
!
#已育成东方百合
与具叶柄组野生百合杂交&"
%
#东方百合与卷瓣组
"
E.0:67YC7
N
:0EG9C.:0
#的湖北百合"
!&()**
+
#或
与喇叭花组"
WGB9:8.Y.:0/G9C.:0
#的王百合"
!&*(,
-
.#(
#杂交&"
$
#不同东方百合品种之间进行杂交-#.
前
%
种情形中!主要用到了传统的切花柱授粉和剥
胚式胚抢救!以克服受精前障碍和受精后障碍对
于第
$
种情形!使用何种育种技术并不明确
百合杂交障碍分为受精前障碍和受精后障碍
切花柱授粉曾被认为是克服百合受精前障碍的最有
效技术-!)*.百合杂交育种中!母本柱头或花柱中可
能存在抑制花粉管伸长的物质!切短花柱会减少这
种抑制!促进花粉管进入子房!有利于克服受精前障
碍剥胚式胚抢救技术曾被认为是克服百合受精后
障碍最有效措施-&),.!因为杂种胚乳可能在百合授粉
后
#"
"
$">
败育!无法继续提供营养支撑杂种胚的
发育人们常在授粉后
#"
"
$">
!在体视显微镜下
从胚珠中剥出杂种胚!置于培养基!使杂种胚获得营
养而继续发育或萌发由于授粉
#"
"
$">
后的胚
珠和杂种胚体积较小!剥胚操作复杂而艰辛
在上述+东方百合
D
东方百合,第
$
种情形杂交
育种中!人们仍习惯性用到切花柱授粉和剥胚式胚
抢救!用于克服杂交障碍!却发现切花柱授粉致使种
子形成率低多年育种实践中也经常发现!东方百
合品种之间杂交!不切花柱的柱头直接授粉反而比
切花柱授粉更易获得种子胚抢救技术中!授粉后
,">
切胚珠接种比授粉后
$">
剥胚式接种操作更
简便*萌发率更高
本研究的目的在于!在东方百合系内杂交育种
中!研究不同授粉技术对于克服受精前障碍的细胞
学机制!调查不同授粉技术和胚抢救技术效果!从而
确定东方百合系内杂交最适宜的授粉技术和胚抢救
技术!简化育种程序!提高育种效率同时!利用国
外公司赠送的珍贵东方百合种质!在国内培育出观
赏性状更新颖的东方百合品种
#
!
材料和方法
@+@
!
试验材料
品种(
AB/C.07
)*(
EFG87
)*(
E:Y]:00G
)*(
E.]GY.7
)
从北京山谷园艺有限公司"种球代理公司#购进!前
!
个品种用于研究授粉技术及相关细胞学机理!后
!
个品种用作杂交母本(
Q7//.0.
)*(
XBY8/G97
)*(
X7Y)
Y7
N
G
)*(
WG]7Y:0
)*(
a:].0?70
N
78G0
)*(
\G/:Y:
)*
(
LC7?78:
)*(
5670.
)*(
Q:0/C707
)*(
V7
N
B
Z
7
)*
(
3978GG/G
)*(
JY8.0
N
C:0
)*(
X797Y>.
)*(
OF.CGG=)
@
YG//
)等
#$
个品种为国外种球公司赠送!每个品种
*
"
4
个种球!种植开花后收集花粉用作父本国外
赠送的新品种也相互之间进行杂交
@+A
!
试验方法
@+A+@
!
荧光观察的材料处理
!
以东方百合(
AB/C.)
07
)为母本*(
EFG87
)为父本!于开花前
#>
对母本去
雄*套袋!待母本柱头呈现分泌液时进行授粉!分别
设置
*
个处理$
#
将柱头及大部分花柱切掉!仅留
!
66
(残桩)花柱!往切口处授予父本花粉&
$
将柱头
及大部分花柱切掉!仅留
#96
(残桩)花柱!用刀片
从(残桩)花柱切口处向下纵切
"+*96
!往切口中授
入父本花粉&
%
将柱头及花柱上部
#
%
!
切掉!在剩余
的
#
%
!
+残桩,花柱切口处授粉&
&
将柱头及花柱上
部
#
%
$
切掉!在剩余的
%
%
$
+残桩,花柱切口处授粉&

将父本花粉直接授予母本柱头上
每个处理授粉
%"
"
%*
朵!授粉后套袋!挂标签
随机选取
!"
个雌蕊用于荧光显微观察!
#"
"
#*
朵
花用于结果及形成种子!授粉后
,"
"
4">
后采摘果
实!统计坐果率!剖开果实统计有胚种子数
@+A+A
!
荧光显微观察
!
授粉
#
*
%
和
*>
后!每个组
合每个处理分别取
*
个材料用于固定及荧光显微观
察将雌蕊置于加有
bJJ
固定液"甲醛
c
冰乙酸
c*"d
酒精
e#c#c#4
体积比#的长试管中!抽气!
置于
$f
冰箱中保存备用从冰箱中取出材料!依
次置于
%"d
酒精*去离子水中各处理
#"6.0
后!置
"!##
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
于
46:8
/
W
(#
P7LK
溶液*
&"f
水浴下软化
#F

再将材料用自来水冲过夜后放入
"+#d
水溶性苯胺
蓝"
+#6:8
/
W
(#
V
%
1L
$
#溶液中染色
!$F
压片
后置于
LWM31REKX)!
型荧光显微镜下!观察父
本花粉管的在雌蕊中的行为!并照相
@+A+B
!
东方百合系内杂交
!
实施不同授粉技术!通
过花粉管行为观察及种子数统计!发现柱头直接授
粉比切花柱授粉可能更适合于东方百合系内杂交
本实验主要运用柱头直接授粉进行如下杂交工作$
"
#
#(
E:Y]:00G
)*(
E.]GY.7
)为国内常见的
!
个东
方百合品种!以(
E:Y]:00G
)*(
E.]GY.7
)为母本!以新
引进的
#$
个东方百合为父本!进行杂交每个组合
杂交
4
"
#"
朵花&"
!
#新引进品种互为亲本进行杂
交以
#$
种新引进东方百合互为父母本!采用柱头
直接授粉进行杂交
授粉后套袋!系上标签授粉
&">
后统计结果
率解剖授粉
&"
*
&*
*
,"
*
,*
和
4">
后的果实!统计
果实中饱满胚珠数"种子数#
@+A+C
!
离体胚抢救
!
!
#
"授粉约
,">
后的胚抢救
!
将上述饱满胚珠进行短暂表面消毒"
+#d K
N
Q8
消毒
%"/
!无菌水冲洗
*
次#以胚珠直接接种和切
胚珠接种
!
种方式进行胚抢救各组合
!
种方法各
接种
4"
"
$""
粒胚珠不等
胚珠直接接种法$将上述消毒过的饱满胚珠直
接平躺着!接种到胚抢救培养基上
切胚珠接种法$沿着胚珠直边"非弧形边#!用解
剖刀切下
"+*66
细长条!将其弃掉!剩余部分平躺
着接种到胚抢救培养基上
上述
!
种接种方法用到的胚抢救培养基为$
3E
I#6
N
%
WXJI"+*6
N
%
WPJJI%"
N
%
W
蔗糖"低
糖培养基#!培养基
@
K*+4

!"授粉
$">
后的胚抢救
!
在
AB/C.07DEFG87
*
E:Y]:00GD5670.
*
E.]GY.7DJY8.0
N
C:0
*
E.]GY.7D
Q7//.0.
等
$
个组合中!采用剥胚式接种"在授粉
$"
>
后实施胚抢救#
剥胚式接种法$取授粉
$">
后的幼果!经过表
面消毒后!在超净工作上用解剖刀沿腹缝线和背缝
线划开!挑出胚珠在体视显微镜下!用解剖针划开
种皮!轻轻挤出棒胚幼胚!接种于下面
!
种胚抢救培
养基中$
#
3EI#6
N
%
WXJI"+*6
N
%
WPJJI%"
N
%
W
蔗糖"低糖培养基#&
$
3EI"+#6
N
%
WXJI
"+#6
N
%
WPJJI&"
N
%
W
蔗糖"中糖培养基#培
养基
@
K*+4
各组合在
!
种培养基上各接种幼胚
4"
"
!#"
粒不等
!
!
结果与分析
A+@
!
采用不同授粉技术授粉后花粉管行为观察和
结籽数统计
授粉后
*>
!采用+
!66
残桩花柱授粉法,!大
量花粉管仍在切口处呈现无向性缠绕!少量花粉管
进入到子房!花粉管纵向最远到达了第
#%
胚珠处!
但是进入子房的花粉管+打圈,*顶端极度膨大*失去
定向生长能力"图
#
!
J
#采用+
#96
残桩花柱授粉
法,!仍观察到大量花粉管在切口处呈现无向性缠
绕!少量花粉管进入到子房!花粉管纵向最远到达了
第
!!
胚珠处!少量花粉管向珠孔处定向!部分花粉
管在最先接触的几个胚珠处漫游*缠绕*打圈!表现
一定程度的无向性"图
#
!
X
#采用+切割
#
%
!
花柱
授粉,时!部分花粉管已向珠孔端定向!但许多花粉
管在胎座附近缠绕*折返!表现出一定的无向性"图
图
#
!
(
AB/C.07
)
D
(
EFG87
)授粉后
*>
花粉管荧光显微观察
7+
残留
!66
花柱授粉&
]+#96
残桩花柱授粉&
9+
切割
#
%
!
花柱授粉&
>+
切割
#
%
$
花柱授粉&
G+
柱头直接授粉
b.
N
+#
!
1:8G0CB]G/:]/GY?7C.:0.0CFG
@
./C.8/:[
CFGAB/C.07
)
D
(
EFG87
)
:0*>7
Z
/7[CGY
@
:8.07C.:0
]
Z
[8B:YG/9G09G6.9Y:/9:
@Z
CG9F0.
^
BG
7+\FG!66/C
Z
8G
@
:8.07C.:0
&
]+\FG#96/C
Z
8G
@
:8.07C.:0
&
9+\FG9BCC.0
N
#
%
!/C
Z
8G
@
:8.07C.:0
&
>+\FG9BCC.0
N
#
%
$
/C
Z
8G
@
:8.07C.:0
&
G+\FG0:Y678/C.
N
67
@
:8.07C.:0
#!##
&
期
!!!!!!!!!!!!
邵
!
杨!等$东方百合系内杂交授粉技术与胚抢救技术研究
#!
Q
#采用+切割
#
%
$
花柱授粉,时!部分靠近子房
上部的胚珠已吸引到
#
条花粉管向其珠孔端定向!
但仍有部分花粉管折返*成圈"图
#
!
`
#采用+柱头
直接授粉时,!子房中上部!观察到大量花粉管精确
指向珠孔端!发生珠孔定向"图
#
!
5
#
授粉后
,">
!对于杂交组合采用不同授粉技术
获得的饱满种子数"表
#
#可见$随着残留的花柱越
长!获得的饱满种子数越高
!66
残桩花柱授粉
法获得的饱满种子数最低!柱头直接授粉法获得的
饱满种子数最高
A+A
!
东方百合系内柱头直接授粉法杂交育种
由上述研究结果可见!东方百合系内杂交!柱头
直接授粉获得的饱满种子数显著高于其他处理于
是以柱头直接授粉对下述
*&
个东方百合系内杂交
组合进行杂交授粉
由表
!
可见!在所试验的组合中!采用柱头直接
授粉!以(
E:Y]:00G
)*(
E.]GY.7
)为母本的
!#
个东方
百合系内杂交均获得果实及饱满胚珠不同杂交组
合的结果率与饱满胚珠数有所不同从总体上看!
(
E:Y]:00G
)比(
E.]GY.7
)更适合于做母本!表现为前
者对应的结果率和饱满胚珠数大多数高于后者
由表
%
可见!在引进品种相互之间
%*
个杂交试
验中!除(
XBY8/G97
)
D
(
V7
N
B
Z
7
)未获得饱满胚珠!以
及(
XBY8/G97
)
D
(
\G/:Y:
)*(
V7
N
B
Z
7
)
D
(
WG]7Y:0
)*
(
\G/:Y:
)
D
(
a:].0?70
N
78G0
)等
%
个组合获得的饱
满胚珠数较少外!其它
%#
个组合均获得果实及较多
饱满胚珠上述研究结果可见!柱头直接授粉适合
于东方百合系内不同品种之间的杂交
A+B
!
采用不同胚抢救技术的胚抢救效果
采用不同胚抢救技术进行胚抢救接种
%">
表
@
!
不同授粉技术下
D&/%#(-E$)*,-
获得的饱满种子数
\7]8G#
!
\FG0B6]GY:[
@
8B6
@
/GG>/.0AB/C.07D
EFG87?.7>.[[GYG0C
@
:8.07C.:0CG9F0.
^
BG/
授粉技术
1:8.07C.:0CG9F0.
^
BG/
种子数
P:+:[
@
8B6
@
/GG>/
!66
残桩花柱授粉法
\FG!66/C
Z
8G
@
:8.07C.:0
#"g*>
#96
残桩花柱授粉法
\FG#96/C
Z
8G
@
:8.07C.:0
!#g&>
切割
#
%
!
花柱授粉
\FG9BCC.0
N
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柱头直接授粉法
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水平差异显著
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$*
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!对于部分组合胚珠"或杂种胚#萌芽数据进行了统
计!结果见表
$

由表
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的统计可见!在所试验的
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个杂交组合
中!在授粉
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后!使用+
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6
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W
蔗糖,胚抢救培养基"低糖#!
采用胚珠直接接种和切胚珠接种!均是切胚珠接种
的 萌芽率较高接种后
$*>
!采用切胚珠接种!有
!#
个杂交组合的胚珠萌发率超过
*"d
&而采用胚珠
直接接种!仅
#
个杂交组合的胚珠萌发率超过
*"d

在上述
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个杂交组合中!在授粉后
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!有
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W
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采用剥胚式接种!发现萌发率均显著低于授粉
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后的切胚珠接种采用剥胚式接种!中糖培养基中
的萌发率略高于低糖培养基
表
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)和(
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讨
!
论
切花柱授粉法能通过切短花柱!使花粉管规避
在花柱中可能遭遇到的不亲和性障碍因此该方法
被广泛应用于克服百合杂交受精前障碍-!)*.但有
人发现!切花柱授粉法造成结籽率较低!并认为是未
成熟花粉管提前到达引起-4.本试验中东方百合系
内品种之间杂交!使用切花柱授粉!也造成较低的结
籽率荧光显微观察发现!采用切花柱授粉!花粉管
大多在花柱切口处+迷向,!其进入子房并发生珠孔
端定向的数量较少&而采用柱头直接授粉"不切花
柱#!百合花粉管穿越正常的柱头*花柱后!其进入子
房*并发生正常珠孔端定向的花粉管数量大大增多
17870.?G8B
研究发现!拟南芥花粉管如果不经过柱
%!##
&
期
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邵
!
杨!等$东方百合系内杂交授粉技术与胚抢救技术研究
头*花柱!其珠孔定向的百分率明显减少!结籽率明
显降低!表明花粉管从柱头和花柱中穿越时增加了
其在子房中感知珠孔诱导信号的能力-.近年来生
殖生物学的研究成果表明!在亲和性杂交中!花粉管
从柱头到花柱*从花柱到子房胎座*从胎座到珠柄*
从珠柄到珠孔!从珠孔进入胚囊!最后发生双受精!
是一个定向生长过程!该过程如此精确和有层次!是
与各阶段雌蕊组织中特异表达基因形成的多肽或蛋
白质信号分层调控有关-#")##.
东方百合杂种系内不同品种之间进行杂交!属
亲缘关系较近的杂交!花粉管在柱头和花柱中遭遇
的不亲和性障碍可能较少!因而没有必要切花柱&相
反!较长的花柱!给花粉管提供了营养和信号!为其
下一步功能的正常发挥提供保障在后续的实验中
采用柱头直接授粉!
*&
个组合中有
*!
个组合获得
了较多饱满胚珠!证实了上述假说的正确性
杂交育种中!三倍体胚乳往往比二倍体杂种胚
提前败育!杂种胚因缺乏后续营养供应而逐渐败育
人们常常在杂种胚败育之前将其剥出!置于培养基
中进行离体胚抢救-#!.&百合胚抢救的时间常常在授
粉后
$">
左右-*.亲缘关系愈远!杂种胚乳败育越
早!胚抢救时间须越早!但剥胚亦更加困难在本试
验中!
$
个组合试验了在授粉
$">
后进行剥胚式接
种!比在
,">
后进行切胚珠接种的萌芽率低*效率
差一方面可能过早剥胚造成了胚损伤!另一方面
可能年幼杂种胚对胚培养条件要求更严格*更不容
易抢救成功-#!.
东方百合系内不同品种之间杂交!是亲缘关系
较近的杂交!采取在授粉后
,">
进行胚抢救由于
胚龄越小的杂种胚需要的渗透势越高!胚龄越大的
杂种胚需要的渗透势越低-#!.!采用+低糖,的+
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基做胚抢救培养基此培养基为近年来扩繁百合种
质的常用培养基使用此培养基!一方面可用于杂
种胚珠萌发!另一方面可使萌发的杂种苗直接进入
扩繁阶段
在授粉
,">
左右进行胚抢救的操作中!没有采
用百合育种历史上惯常采用的剥胚法!而是采用了
胚珠直接接种和切胚珠接种结果发现采用切胚珠
接种比胚珠直接接种萌芽更早*萌芽率更高可能
因为运用胚珠直接接种!珠被对于吸收水分和营养
中起到了一定阻挡作用&运用切胚珠接种!珠被边缘
被切出一条缝隙!有利于水分和营养物质进入胚珠!
促进杂种胚萌发
总之!通过本研究初步寻找到一种普遍适用于
东方百合系内杂交育种的杂交技术!即采用柱头直
接授粉!在授粉
,">
左右!取饱满胚珠!采用切胚珠
接种进行胚抢救
参考文献!
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