全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
#"""*$"!
"
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#
"&*#$(*#"
!!!!!!!!!!!!!!!
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$
#"+,-"-
%
.
+/001+#"""*$"!+!"#$+"&+#$(
收稿日期$
!"#$*"$*"-
&修改稿收到日期$
!"#$*"-*"-
基金项目$中国烟草总公司项目
##"!"#%"#""-
"
23*"-
#(&中国烟草总公司云南省公司项目"
!"#%34"#
#
作者简介$童治军"
#(&")
#!男!博士!主要从事烟草分子育种研究)
5*67/8
$
9:
.
&-#
!
#-%+;<6
"
通信作者$肖炳光!博士!研究员!主要从事烟草育种与生物技术研究)
5*67/8
$
=/7<>
?!
!-%+1@9
$
种烟草基因组
%%&
位点信息分析和标记开发
童治军!肖炳光"
"云南省烟草农业科学研究院!烟草行业烟草生物技术育种重点实验室!国家烟草基因工程研究中心!昆明
-""!#
#
摘
!
要$利用生物信息学方法对绒毛状烟草*林烟草和本塞姆氏烟草
%
份烟草野生种基因组数据中的
AAB
位点信
息进行了分析)结果表明!在全长分别为
!+#$C>
*
!+$$C>
和
!+(C>
的绒毛状烟草*林烟草和本塞姆氏烟草基
因组中分别获得
#%%,
个*
#(-$(%
个和
!,&,&$
个
AAB
位点!平均相隔
#%+($D>
*
#!+$!D>
和
(+%#D>
出现一个
AAB
)在
AAB
位点分布区域上!绝大部分的
AAB
位点分布在内含子和
EFB
"尤其是
G*EFB
#区域&在
AAB
基序类
型上!主要集中在二*三碱基基序且二者占总
AAB
位点数目的
&"H
以上!并以二碱基基序类型丰度最高&在
AAB
基
序结构上!基因组中出现频率及数量最高的是含有
I
"
F
#
1
的基序结构&在
AAB
基序的重复次数上!除单碱基基序
类型外!重复次数多在
%
"
#"
次之间)利用分别属于

个不同烟草组的
&
份烟草材料验证所合成的
%""
对引物!所
有合成的引物均能扩增获得目标片段!其中有
&"
对引物存在扩增多态性)表明来源于绒毛状烟草*林烟草和本塞
姆氏烟草基因组的
AAB
标记在亲缘关系相对较近的烟草种间具有高度保守性和通用性!基于此
%
份烟草野生种基
因组数据开发
AAB
引物用于后续的相关遗传研究具有可行性)
关键词$绒毛状烟草&林烟草&本塞姆氏烟草&基因组&
AAB
中图分类号$
J,&(
文献标志码$
I
%()*
+
",%%&-".#/0,"(123#"0#045(**4"62.."
7*0"1*820!9*)*:"
;
1*03",%%&<2(=*(8
FK4CLM/
.
N1
!
OPIKQ/1
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N71
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"
"
R@
S
T7>S
7;;?
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?
!
479/<178F<>7;;?
/1@@U/1
?
B@0@7U;MX@19@U
!
3N1171I;7W@6
S
7;;?
U/;N89NU78A;/@1;@0
!
RN16/1
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-""!#
!
XM/17
#
>683(2.3
$
A/6
Y
8@0@
Z
N@1;@U@
Y
@790
"
AAB0
#
/19M@[M<8@
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@1<6@07;;<0*!"#$%"&&%$()%$*"+
,
$-("*
!
!"#$%"&&*
.
/0)*%-"*71W!"#$%"&&1)%2&("&&W<[18<7W@WVU<69M@XM/17F<>7;;97>70@
"
XFC\Q
#
[707178
S
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S
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8<;/[@U@6/1@W
!
+$$C>71W!+(C>7;;<0
+
?
@1<6/;0@
Z
N@1;@0
!
71W9M@7]@U7
?
@W/0971;@>@9[@@1AAB8<;/[707
YY
U<=/679@8
S
#%+($D>
!
#!+$!D>71W(+%#D>
!
U@0
Y
@;9/]@*
8
S
+I86<09789M@AAB8<;/[@U@W/09U/>N9@W/1/19U<1W<67/1071WEFBW<67/10
"
@0
Y
@;/78
S
9M@G*EFB
#
+
\/*1N;8@<9/W@71W9U/*1N;8@<9/W@U@
Y
@790
!
9<978
S
7;;?
V!
[@U@9M@67/16<9/V9
SY
@0
71W9M@W/*1N;8@<9/W@[709M@6<097>N1W71;@/178AAB0+FM@M/
?
M@09VU@
Z
N@1;
S
71W9M@6<097>N1W71;@
?
NU79/<1[@U@I
"
F
#
1
+5=;@
Y
99M@6<1<*1N;8@<9/W@6<9/V9
SY
@
!
9M@U@
Y
@791N6>@U6<9/V9
SY
@0[70>@9[@@1%71W#"+FMU@@MN1WU@WAAB
Y
U/6@U
Y
7/U0U71W<68
S
0
S
19M@0/:@WVU<69MU@@[/8W
9<>7;;<
?
@1<6@0[@U@0N>
.
@;9@W9< X^BN0/1
?
&9<>7;;<7;;@00/<1070679@U/780[M/;M>@8<1
?
90
Y
@;/@0?
@1N0!"#$%"&&71W9M@U@0N8900M<[@W9M79789M@
Y
U/6@U
Y
7/U0;Y
U!
097>8@
71W97U
?
@9>71W0
!
Y
U/6@U0[@U@
Y
<8
S
6Y
M/;+FM@U@0N890/1W/;79@W9M79AAB8<;//19M@
;8<0@U
?
@1@9/;U@879/<10M/
Y
76<1
?
9<>7;;<0
Y
@;/@0[@U@M/
?
M8
S
;<10@U]@W71W;@N0@W/19M@V<8<[/1
?
U@0@7U;M+P9/06@71/1
?
VN89Y
AAB
Y
U/6@U
Y
7/U0VU<6[/8W9<>7;;<
?
@1<6/;W797VYY
8/;79/<1U@879/]@
?
@1@9/;7178
S
0/0+
?*
+
@"(!8
$
!"#$%"&&%$()%$*"
,
$-("*
&
!3*
.
/0)*%-"*
&
!31)%2&("&&
&
?
@1<6@
&
AAB
!!
烟草为茄科"
A<8717;@7@
#烟属"
!"#$%"&&
#一年
生或多年生经济作物!属内植物共有
#$
个组"
0@;*
9/<1
#
--
个种"
0
Y
@;/@0
#!其体细胞染色体数目有
(
#
*
#"
#
*
#!
#
*
#-
#
*
#&
#
*
#(
#
*
!"
#
*
!#
#
*
!!
#
*
!%
#
*
!$
#
等
##
种之多#()在烟属
--
个种中!除起
源于南美洲安第斯山区的普通烟草种和黄花烟草种
外!剩余的
-$
个种均是烟草野生种!其中绒毛状烟
草"
!"#$%"&&%$()%$*$
,
$-("*T+
&
!1_#!
#
_!$
FF
#*林烟草"
!3*
.
/0)*%-"*T+
&
!1_#!
#
_!$AA
#
和本塞姆氏烟草"
!31)%2&("&&T+
&
!1_#(
#
_
%&QQ
#是体细胞染色体数目分别为
#!
#
和
#(
#
的
%
份烟草野生种)由于烟草属内各种间多态性水平
低!*-(*染色体数目多,(*基因组较大且重复序列含
量较高&(!因此烟草的
AAB
分子标记开发和利用研
究比较滞后!严重制约了烟草的遗传研究和分子育
种)
AAB
"
0/6
Y
8@0@
Z
N@1;@U@
Y
@790
!简单重复序列#
标记!是基于重复序列两侧保守的特定短序列设计
引物来扩增重复序列本身的
\4I
分子标记(*#"()
与众多
\4I
标记一样!
AAB
标记除具有无表型效
应*不受环境限制和影响*在生物基因组内大量存在
且分布均匀外!还具有稳定*可靠*等位基因间呈共
显性遗传等优点!使其广泛地应用于遗传图谱构建*
基因定位等领域##()但
AAB
标记成功开发的局限
性及重要环节是严重地依赖于对生物基因组信息的
了解!尤其是对基因组"或
5AF
序列#数据中的
AAB
信息进行分析)由于烟草全基因组测序工作十分困
难!以至于关于绒毛状烟草*林烟草和本塞姆氏基因
组中
AAB
信息分析和标记开发方面的研究!国内外
的报道较少)张俊娥等#!(*胡重怡等#%(*薛金爱
等#$(和王卫峰等#(分别利用烟草
5AF
序列数据和
绒毛状烟草基因组序列数据对烟草
5AF*AAB
和基
因组
AAB
位点的信息及分布特征进行了分析)利
用生物信息学在其他植物"如谷子*胡椒*拟南芥*水
稻*西红柿*小麦*高粱*玉米等#基因组或
5AF
序列
数据中挖掘*分析
AAB
信息的报道较多#-*!#()目
前!
AAB
标记在烟草遗传分析中虽有一定的应用!
如遗传图谱构建!!*!$(*基因定位!*!-(*分子标记辅
助选择育种!,(*遗传多样性分析!*-!&(等!但规模和
力度远不如其他作物)
本研究拟利用中国烟草基因组数据库"
XFC*
\Q
#中的绒毛状烟草*林烟草和本塞姆氏烟草基因
组测序产生的海量数据!探索其基因组
AAB
位点分
布情况!具体包括
AAB
基序类型和结构*
AAB
位点
的数量及密度*
AAB
位点分布的区域和重复次数!
并依据
AAB
位点信息开发引物在烟草属内进行验
证!为
AAB
分子标记应用提供参考)
#
!
材料和方法
A+A
!
材
!
料
A+A+A
!
植物材料
!
本研究共用了
&
份烟草材料"表
#
#!其中普通烟草栽培种和烟草野生种各
$
份!均由
云南省烟草农业科学研究院中国烟草育种研究"南
方#中心(提供)
A+A+B
!
基因组数据
!
绒毛状烟草*林烟草和本塞姆
氏烟草全基因组数据以
I`AFI
文件格式下载自中
国烟草基因组数据库"
XM/17F<>7;;97>70@
!
XFC\Q
&其中绒毛状烟草和林烟草基因组
数据目前尚未公开#)经数据分析!获得的绒毛状烟
草和林烟草基因组大小分别为
!#%&"%$$">
Y
和
!$$"$#,(!>
Y
!各包含
(""-
个和
(-%%
个
A;7V*
V<8W0
!其中!基因组常染色质区覆盖度达到
(H
以
上!基因区覆盖度达
(&H
以上!获得的全基因组序
列图谱"第一版#
;<19/
?
4"
超过
!"D>
!
0;7VV<8W
4"
超过
%"D>
)获得的本塞姆氏烟草基因组大
小为
!(%-$""%->
Y
!共包含
#$"&("
个片段)
表
A
!
供试材料的名称和类型"组#
F7>8@#
!
476@071W9
SY
@0
"
0@;9/<10
#
材料编号
a79@U/78
4<+
材料名称
a79@U/78176@
类型"组#
F
SY
@
"
A@;9/<1
#
#
红花大金元
b<1
?
MN7W7
.
/1
S
N71
烤烟
8`N@;NU@W9<>7;;<
! A760N1
香料烟
KU/@19789<>7;;<
% 8`雪茄烟
X/
?
7U9<>7;;<
$ QNU8@
S
!#
白肋烟
QNU8@
S
9<>7;;<
!3%$()%$*"
,
$-("*
绒毛烟草组
F<6@19<07@
- !3*
.
/0)*%-"*
花烟草组
I8797@
, !3
4
/&5#&
圆锥烟草组
7^1/;N8797
& !31)%2&("&&
香甜烟草组
AN7]@<8@19@0
"#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
A+B
!
方
!
法
ACBCA
!
绒毛状烟草*林烟草和本塞姆氏烟草基因组
%%&
位点的搜寻
!
利用
AABPF
软件"
M99
Y
$%%
[[[+
?
U76@1@+?
%
?
U76@1@
%
0@7U;M@0
%
00U9<<8
#在所获得
的
%
份烟草野生种基因组内进行
AAB
位点信息的
搜索!该软件仅用于查找二*三*四*五*六碱基

种
类型的
AAB
)对于单碱基类型的
AAB
信息则利用
FB`
软件 "
F71W@6 B@
Y
@790 /`1W@U
!
M99
Y
$%%
971*
W@6+>N+@WN
%
9UV
%
9UV+M968
#进行搜寻)
AAB
搜索的
参数设置为$单碱基重复
#
!">
Y
"基序
a_#
&重复
次数
4
#
!"
#&二碱基重复
#
#!>
Y
"
a_!
&
4
#
-
#&三
碱基重复
#
#>
Y
"
a_%
&
4
#

#&四碱基重复
#
#-
>
Y
"
a_$
&
4
#
$
#&五碱基重复
#
#>
Y
"
a_
&
4
#
%
#&六碱基重复
#
#&>
Y
"
a_-
&
4
#
%
#)
ACBCB
!
%%&
引物的开发与
DE&
扩增分析
!
利用
@^U8
语言编写程序!在符合条件的
AAB
位点两侧各
截取长度为
!"">
Y
的核苷酸序列!用
U^/6@U%
"
M9*
9
Y
$%%
[[[+VU%
;
?
/*>/1
%
Y
U/6@U%
#设
计
AAB
引物)在设计引物时!主要考虑以下几个关
键因素$"
#
#引物长度!
#&
"
!>
Y
"理想值为
!">
Y
#&
"
!
#
X^B
预期扩增的产物长度!
#"
"
$"">
Y
"理想
值为
!"">
Y
#&"
%
#退火温度"
F6
#!
c
"
-!c
"理
想值为
&c
#&"
$
#
CX
含量"
CXH
#!
$"H
"
-"H
"理
想值为
"H
#&"

#尽量避免引物二聚体*发夹结构
及错配)
X^B
扩增体系为
!"
$
T
!其中
#
"
%"
1
?
%
$
T\4I
样品
#+
$
T
*
#"d X^BB@7;9/<1QNVV*
@U
"
a
?
!e
Y
8N0
#
!
$
T
*
!66<8
%
TW4F^ 0#+!
$
T
*
#"
$
6<8
%
T
正反向引物各
!
$
T
*
U6&
7
"+,E
!最后用
WWb
!
K
补足
!"
$
T
)
X^B
扩增程序为
(c
预变性
6/1
&然后进行
%"
个循环!每个循环包括
(c
变
性
%"0
*
&c
"视引物的不同而变化#复性
%"0
*
,!
c
延伸
%"0
&最后
,!c
延伸
6/1
)
X^B
产物在
-H
的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离!
!"f
恒
压下电泳
#+M
!按照
A71
?
N/1@99/
等!((的快速银染
法进行染色!并拍照保存)
!
!
结果与分析
BCA
!
$
份烟草野生种基因组
%%&
位点数量和分布
在全长分别为
!#%&"%$$"
*
!$$"$#,(!
和
!(%-$""%->
Y
的绒毛状烟草*林烟草和本塞姆氏
烟草基因组内利用
AABPF
和
FB`
软件分别搜寻到
符合要求的
AAB
位点
#%%,
个*
#(-$(%
个和
!,&,&$
个!平均每隔
#%+($
*
#!+$!
和
(+%"D>
出现
一个
AAB
"表
!
#)
#%%,
个绒毛状烟草基因组
AAB
位点中!分
布在
G*EFB
*外显子*内含子和
%G*EFB$
种基因
组不同区域的位点个数分别为
,&!
个*
#%--
个*
,,-
个和
&$%
个!分别占总数的
+#!H
*
#"+"!H
*
%-+%,H
和
%+&#H
)
AAB
位点在
$
种不同
区域的密度分别为
!#+$
个%
a>
*
%$+%$
个%
a>
*
-$+($
个%
a>
和
&$+-#
个%
a>
!平均密度为
,#+,%
个%
a>
"
#%%,
%
!#%&+"%a>
#)
#(-$(%
个林烟
草基因组
AAB
位点中!分布在
G*EFB
*外显子*内
含子和
%G*EFB$
种基因组不同区域的位点个数分
别为
(,",
个*
#(#""
个*
&$#
个和
&(
个!分别
占
$+($H
*
(+,!H
*
$%+"%H
和
%+"#H
)
AAB
位点在
$
种不同区域的密度分别为
!$(+%
个%
a>
*
$,+(
个%
a>
*
&#+%&
个%
a>
和
(+!%
个%
a>
!平均为
&"+!
个%
a>
"
#(-$(%
%
!$$"+$#&a>
#)
!,&,&$
个
本塞姆氏基因组
AAB
位点中!分布在
G*EFB
*外显
子*内含子和
%G*EFB$
种基因组不同区域的位点
个数分别为
#$!$-
个*
!&(#"
个*
#%-!#
个和
&%-%
个!分 别 占
+##H
*
#"+%,H
*
$&+(,H
和
!+((H
)
AAB
位点在
$
种不同区域的密度分别为
%%%+#,
个%
a>
*
-+-&
个%
a>
*
##,+(%
个%
a>
和
#!(+"$
个%
a>
!平均为
#",+$(
个%
a>
"
!,&,&$
%
!(%+-$a>
#)在
AAB
位点分布区域和密度上!绒
毛状烟草*林烟草和本塞姆氏烟草基因组有两个相
同点$
#
#在
EFB
区域"尤其是
G*EFB
区域#!
AAB
位点出现频率"密度#最大!而
AAB
位点数目"或所
占比例#最低&
!
#在外显子区域!
AAB
位点出现的密
度和所占比例均远低于内含子区域"表
%
#)
BCB
!
$
份烟草野生种基因组
%%&
基序类型和结构
在全部的
-
种基序"单*二*三*四*五*六碱基#
类型中!绒毛状烟草*林烟草和本塞姆氏烟草基因组
AAB
位点有以下相同之处$"
#
#单碱基基序类型的
AAB
位点数目占各基因组
AAB
位点总数的比例基
本相同&"
!
#基因组
AAB
位点主要集中在二*三碱基
基序类型上!且两者共占各自总
AAB
位点数目的约
&"H
!分别为
,(+"H
*
&#+(H
和
&%+(#H
&"
%
#六碱
基基序类型的
AAB
位点所占的比例要高于单*四*
五碱基基序类型!且四*五碱基基序类型是
-
种基序
类型中出现频率最低的"表
!
#)从基序结构出现的
频率上看!绒毛状烟草基因组
AAB
中!单碱基基序
出现频率最高的结构是
I
%
F
!占单碱基基序结构的
&"+($H
&二碱基基序中出现最多的是
IF
%
FI
!占
二碱基的
-#+"%H
!最少的是
XC
%
CX
!占
"+%%H
&三
碱基基序以
IIX
%
FFC
*
IFF
%
FII
和
IXI
%
FCF
##
&
期
!!!!!!!!!!!!
童治军!等$
%
种烟草基因组
AAB
位点信息分析和标记开发
较多!分别占三碱基的
##+((H
*
#"+#!H
和
(+!,H
)
在林烟草基因组
AAB
中!单碱基基序出现频率最高
的仍是
I
%
F
!占单碱基基序的
&#+"%H
&二碱基基序
中出现最多的仍是
IF
%
FI
!占二碱基基序的
-!+!#H
!最少的是
XC
%
CX
!占
"+##H
&三碱基基序
以
IIX
%
FFC
*
XII
%
CFF
和
IFF
%
FII
较多!分
别占三碱基的
#!+!!H
*
#!+!"H
和
##+-(H
)本塞
姆氏烟草基因组
AAB
中!单碱基基序出现频率最高
表
B
!
绒毛状烟草*林烟草和本塞姆氏烟草基因组中
%%&
位点信息
F7>8@!
!
FM@AAB8<;//1V,
$-("*
?
@1<6@
!
!3*
.
/0)*%-"*
?
@1<6@71W!31)%2&("&&
?
@1<6@
项目
P9@6
数目
4<+
类型比例
U^<
Y
%
H
平均距离"
I]@U7
?
@W/0971;@
%
D>
绒毛状烟草基因组
!3%$()%$*"
,
$-("*
?
@1<6@
单碱基
a<1<*1N;8@<9/W@ "&( %+,( %-&+"-
二碱基
\/*1N;8@<9/W@ ,%-&$ $&+" !(+"!
三碱基
FU/*1N;8@<9/W@ $&!%# %#+$ $$+%%
四碱基
F@9U7*1N;8@<9/W@ %! !+#! --+&
五碱基
@^197*1N;8@<9/W@ %% !+#( -%,+!,
六碱基
b@=7*1N;8@<9/W@ #("!% #!+$" ##!+%(
总计
F<978 #%%, #"" #%+($
林烟草基因组
!3*
.
/0)*%-"*
?
@1<6@
单碱基
a<1<*1N;8@<9/W@ ,-!% %+&& %!"+#$
二碱基
\/*1N;8@<9/W@ #"!,$ !+!( !%+,
三碱基
FU/*1N;8@<9/W@ &!,# !(+-- $#+&&
四碱基
F@9U7*1N;8@<9/W@ $($& !+! $(%+!#
五碱基
@^197*1N;8@<9/W@ -"%, %+", $"$+!$
六碱基
b@=7*1N;8@<9/W@ #-&-( &+( #$$+-,
总计
F<978 #(-$(% #"" #!+$!
本塞姆是烟草基因组
!31)%2&("&&
?
@1<6@
单碱基
a<1<*1N;8@<9/W@ ,,#& !+,, %%-+"
二碱基
\/*1N;8@<9/W@ #%,""$ $(+#$ #&+(%
三碱基
FU/*1N;8@<9/W@ (-($ %$+,, !-+,
四碱基
F@9U7*1N;8@<9/W@ $&"& #+,! %(+$$
五碱基
@^197*1N;8@<9/W@ $(,& #+,( !#+"!
六碱基
b@=7*1N;8@<9/W@ !,%%# (+&" ($+("
总计
F<978 !,&,&$ #"" (+%"
!!
注$
"
+
平均距离
_!+#$
"
!+$$
或
!+(
#
C>
%碱基类型的
AAB
数目)
4<9@
$
"
+I]@U7
?
@W/0971;@_!+#$
"
!+$$#
C>
%
AAB4<+
表
$
!
%%&
在绒毛状烟草*林烟草和本塞姆氏烟草基因组中的分布
F7>8@%
!
AAB
+
0W/09U/>N9/<1?
@1<6@/1!3%$()%$*"
,
$-("*
!
!3*
.
/0)*%-"*71W!31)%2&("&&
项目
P9@6
碱基数目
Q70@
Y
7/U
%
>
Y
AAB
位点数目
4<+所占比例
U^<
Y
%
H
密度
\@10/9
S
"
AAB
%
a>
#
绒毛状烟草基因组
!3%$()%$*"
,
$-("*
?
@1<6@
G*EFB %#!#%#, ,&! +#! !#+$
外显子
5=<1 $$,$("&#& #%-- #"+"! %$+%$
内含子
P19U<1 &&&$&&%- ,,- %-+%, -$+($
%G*EFB -("&$$ &$% %+&# &$+-#
全基因组
gM<8@
?
@1<6@ !#%&"%$$" #%%, #"" ,#+,%
林烟草基因组
!3*
.
/0)*%-"*
?
@1<6@
G*EFB %&(!(!"# (,", $+($ !$(+%
外显子
5=<1 $"#%$$&#, #(#"" (+,! $,+(
内含子
P19U<1 #"%&(-#%, &$# $%+"% &#+%&
%G*EFB -#(""&&% &( %+"# (+!%
全基因组
gM<8@
?
@1<6@ !$$"$#,(! #(-$(% #"" &"+!
本塞姆氏烟草基因组
!31)%2&("&&
?
@1<6@
G*EFB $!,&(" #$!$- +## %%%+#,
外显子
5=<1 $$"#-$$%% !&(#" #"+%, -+-&
内含子
P19U<1 ##,-$$%- #%-!# $&+(, ##,+(%
%G*EFB -$&"(%-" &%-% !+(( #!(+"$
全基因组
gM<8@
?
@1<6@ !(%-$""%- !,&,&$ #"" #",+$(
!#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
的结构也是
I
%
F
!占单碱基基序结构的
&"+-%H
&二
碱基基序中出现最多的是
IF
%
FI
!占二碱基的
(+!"H
!最少的是
XC
%
CX
!占
"+!%H
&三碱基基序以
XII
%
CFF
*
IIX
%
FFC
和
IXI
%
FCF
为较多!分别
占三碱基的
!!+#,H
*
#+!#H
和
&+(#H
"表
$
#)
BC$
!
$
份烟草野生种基因组
%%&
基序重复次数
从基序重复次数上看!绒毛状烟草基因组
AAB
中!单碱基基序重复次数多在
!"
"
%"
"
!"
$
4
$
%"
#
表
F
!
绒毛状烟草*林烟草和本塞姆氏烟草基因组中的
%%&
基序结构信息
F7>8@$
!
FM@/1V?
NU79/<1/1!3%$()%$*"
,
$-("*
!
!3*
.
/0)*%-"*71W!31)%2&("&&
?
@1<6@0
项目
P9@6
基序结构
a<9/V
;<1V/
?
NU79/<1
绒毛状烟草基因组
!3%$()%$*"
,
$-("*
?
@1<6@
数目
4<+
所占比例
U^<
Y
%
H
林烟草基因组
!3*
.
/0)*%-"*
?
@1<6@
数目
4<+
所占比例
U^<
Y
%
H
本塞姆氏烟草基因组
!31)%2&("&&
?
@1<6@
数目
4<+
所占比例
U^<
Y
%
H
单碱基基序
a<1<*1N;8@<9/W@
I
%
F $##( &"+($ -#,, &#+"% -!!% &"+-%
C
%
X (," (+"- #$$- &+(, #$( (+%,
总计
F<978 "&( #"" ,-!% #"" ,,#& #""
二碱基基序
\/*1N;8@<9/W@
IX
%
FC ,&#" #"+-" ####& #"+&! #,! ##+%,
IC
%
FX &%($ ##+%( #!!!- ##+(" #(%, #$+#%
IF
%
FI $$(-- -#+"% -%(#$ -!+!# &##"# (+!"
XI
%
CF %&&# +!, %&$ +!$ -!%% $+
XC
%
CX !$ "+%% ### "+## %#% "+!%
XF
%
CI &%&& ##+%& (((! (+,% #$$!& #"+%
总计
F<978 ,%-&$ #"" #"!,$ #"" #%,""$ #""
三碱基基序
FU/*1N;8@<9/W@
IIX
%
FFC ,&# ##+(( ,#!% #!+!! #$,$% #+!#
IIC
%
FFX $%!& &+(, $&$ (+$# ,%,! ,+-"
IIF
%
FFI $&&# #"+#! -&#! ##+-( -(!- ,+#$
IXI
%
FCF $$,% (+!, $,! ,+& &-$# &+(#
IXX
%
FCC -"! #+! %- "+-% -$( "+-,
IXC
%
FCX & "+#& !"% "+% !&, "+%"
IXF
%
FCI ($& #+(, -,, #+#- #"! #+"(
ICI
%
FXF %$!& ,+## $!$, ,+!( -$%# -+-%
ICX
%
FXC #%% "+!& %!, "+- $#& "+$%
ICC
%
FXX &! #+,, &$ #+$, #- #+-#
ICF
%
FXI ,(, #+- (%- #+-# #%$" #+%&
IFI
%
FIF %--, ,+-" !(!# +"# $&#% $+(-
IFX
%
FIC --& #+%( &%, #+$$ &&% "+(#
IFC
%
FIX ("# #+&, !%&% $+"( #%" #+&
IFF
%
FII %,(& ,+&, %"% +!$ $!$$ $+%&
XII
%
CFF $%$ (+"% ,#"( #!+!" !#$&( !!+#,
XIX
%
CFC !"% "+$! !", "+%- $"( "+$!
XIC
%
CFX ##$ "+!$ !% "+$" !,! "+!&
XIF
%
CFI #%-& !+&$ !$"( $+#% #-#! #+--
XXI
%
CCF %,, "+,& %$ "+( $," "+$&
XXC
%
CCX ,! "+# $$ "+"& (, "+#"
XXF
%
CCI !-( "+- $(- "+& && "+(#
XCI
%
CXF #- "+%$ #,& "+%# #-$ "+#,
XCX
%
CXC %# "+"- !, "+" #&, "+#(
XCC
%
CXX ! "+## !# "+"$ & "+"(
XCF
%
CXI #% "+%! #-( "+!( #$( "+#
XFI
%
CIF ((! !+"- &- #+$, #!$% #+!&
XFX
%
CIC (#$ #+(" ,-! #+%# #- #+-#
XFC
%
CIX ##$ "+!$ !- "+$$ %( "+$#
XFF
%
CII %,## ,+-( $%-% ,+$( ,"%& ,+!-
总计
F<978 $&!%# #"" &!,# #"" (-($ #""
%#
&
期
!!!!!!!!!!!!
童治军!等$
%
种烟草基因组
AAB
位点信息分析和标记开发
之间!约占单碱基基序的
(%+#&H
"
$#%
%
&"(
#!其
中重复次数最多的基序结构为
I
"重复
$,#
次#&二
碱基基序的重复次数多在
-
"
#"
之 间!约占
,%+(!H
!其中重复次数最多的基序结构为
IF
"
!#"
次#&三碱基基序的重复次数多在

"
#"
之
间!约占
&&+#,H
!其中重复次数最多的基序结构为
CII
"
#&"(
次#&四碱基基序的重复次数多在
$
"
#"
之间!约占
(-+#-H
!其中重复次数最多的基序结构
为
IFIX
"
&%
次#&五碱基基序的重复次数多在
%
"

之间!约占
($+H
!其中重复次数最多的基序结
构为
FXIFI
和
IFIXF
"各
$,
次#&六碱基基序的
重复次数多在
%
"

之间!约占
(&+#!H
!其中重复
次数最多的基序结构为
IIICII
"
%%
次#)林烟
草基因组
AAB
中!单碱基基序的重复次数多在
!"
"
%"
之间!约占
($+",H
!其中
I
"
%,(
次#是重复次数
最多的基序结果&二碱基基序的重复次数多在
-
"
#"
之间!约占
,&+(H
!其中
IF
"
(-#%
次#是重复次
数最多的基序结构&三碱基基序的重复次数多在

"
#"
之间!约占
&&+$#H
!其中
FFI
"
$-
次#是重
复次数最多的基序结构&四碱基基序的重复次数多
在
$
"
#"
之间!约占
(!+,-H
!其中
FIXI
"
$%&$
次#是重复次数最多的基序结构&五碱基基序的重复
次数多在
%
"

之间!约占
($+,"H
!其中
IIFIF
"
%$
次#是重复次数最多的基序结构&六碱基基序的
重复次数多在
%
"

之间!约占
(&+$(H
!其中
IC*
FICX
"
#"!#
次#是重复次数最多的基序结构)本
塞姆氏烟草基因组
AAB
中!单碱基基序的重复次数
多在
!"
"
%"
之间!约占
(#+!$H
!其中
I
"
#,%
次#是
重复次数最多的基序结构&二碱基基序的重复次数
多在
-
"
#"
之间!约占
,#+"!H
!其中
IF
"
%!
次#是
重复次数最多的基序结构&三碱基基序的重复次数
多在

"
#"
之间!约占
&,+#!H
!其中
IFI
"
!#
次#
是重复次数最多的基序结构&四碱基基序的重复次
数多在
$
"
#"
之间!约占
&(+$H
!其中
IFIC
"
!-
次#是重复次数最多的基序结构&五碱基基序的重复
次数多在
%
"

之间!约占
(%+&H
!其中
FIFFI
"
#$
次#是重复次数最多的基序结构&六碱基基序的重复
次数多在
%
"

之间!约占
(,+,H
!其中
IIIIXI
"
#,
次#是重复次数最多的基序结构"表

#)
BCF
!
$
份烟草野生种基因组
%%&
标记的
DE&
扩增
分析
在绒毛状烟草基因组*林烟草体基因组和本塞姆
氏烟草基因组中利用
U^/6@U%
软件分别开发
##!(%
对*
#(!-"!
对和
!,#$&"
对
AAB
引物!开发的成功率
表
G
!
%%&
基序在绒毛状烟草*林烟草和本塞姆氏烟草基因组中的重复次数
F7>8@
!
FM@U@
Y
@794<+,
$-("*
!
!3*
.
/0)*%-"*71W!31)%2&("&&
?
@1<6@0
项目
P9@6
重复次数
FM@6<9/V0
+
;<1V/
?
NU79/<1
%
"
-
"
#" ##
"
# #-
"
!"
#
!#
重复次数最多的基序结构
a7=4<+6<9/V0
+
;<1V/
?
NU79/<1
绒毛状烟草基因组
!3%$()%$*"
,
$-("*
?
@1<6@
单碱基
a<1<*1N;8@<9/W@ $#"-
7
#,"% I
"
$,#
#
二碱基
\/*1N;8@<9/W@ $$," ##(%( $& !-(" IF
"
!#"
#
三碱基
FU/*1N;8@<9/W@ %!"!%
>
#""! %%&# #%%& (&, CII
"
#&"(
#
四碱基
F@9U7*1N;8@<9/W@
!%"&
;
&!! &- #, !# IFIX
"
&%
#
五碱基
@^197*1N;8@<9/W@ %#,! #,- " ! FXIFI
"
$,
#&
IFIXF
"
$,
#
六碱基
b@=7*1N;8@<9/W@ #&--- %%! #- % - IIICII
"
%%
#
林烟草基因组
!3*
.
/0)*%-"*
?
@1<6@
单碱基
a<1<*1N;8@<9/W@ %##
7
!%#! I
"
%,(
#
二碱基
\/*1N;8@<9/W@ &",$% #(!! $!"- ,#$ FI
"
(-#%
#
三碱基
FU/*1N;8@<9/W@
!&-!
>
!!(& %!,# #--& #&"! FFI
"
$-
#
四碱基
F@9U7*1N;8@<9/W@ %"$#
;
#$( #&, $& #!% FIXI
"
$%&$
#
五碱基
@^197*1N;8@<9/W@ ,#, !& !$ IIFIF
"
%$
#
六碱基
b@=7*1N;8@<9/W@ #--#$ !#& #, # ICFICX
"
#"!#
#
本塞姆氏烟草基因组
!31)%2&("&&
?
@1<6@
单碱基
a<1<*1N;8@<9/W@ -""%
7
#,# I
"
#,%
#
二碱基
\/*1N;8@<9/W@ (,!( !%-%, ##-#! $$-" IF
"
%!
#
三碱基
FU/*1N;8@<9/W@ $!&!,
>
$#-!( $$ ,"%% # IFI
"
!#
#
四碱基
F@9U7*1N;8@<9/W@
!%!
;
#,,% "! " # IFIC
"
!-
#
五碱基
@^197*1N;8@<9/W@ $-,! !- $# " " FIFFI
"
#$
#
六碱基
b@=7*1N;8@<9/W@ !-,#, -"( $ # " IIIIXI
"
#,
#
!!
注$
7+
重复次数为
!"
时"
4_!"
#单碱基基元数目&
>+4_
时三碱基基元数目&
;+$
$
4
$

时四碱基基元数目)
4<9@
$
7+4<+&
>+4<+&
;+4<+Y
@197*1N;8@<9/W@6<9/V799M@8@]@8$
4
$
+
$#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
分别 约 为
(&+-H
"
##!(%
%
#%%,
#*
(&+"!H
"
#(!-"!
%
#(-$(%
#和
(,+%&H
"
!,#$&"
%
!,&,&$
#)在
开发的
AAB
引物中各自随机选取
#""
对引物进行合
成并验证!用于验证的
%""
对
AAB
引物在参试的
&
份
烟草材料中均能扩增得到稳定清晰的目标条带)
#""
对绒毛状烟草基因组
AAB
引物"以
Fa9
为引物名称
的前缀#在供试的
$
份普通烟草品种中虽均能进行有
效扩增*但未出现多态性!即在普通烟草中的多态率
为
"
&而在另外
$
份烟草野生种中筛选到
#(
对有多态
性的引物!多态率为
#(H
"
#(
%
#""
#"图
#
!
I
#)
#""
对
林烟草基因组
AAB
引物"以
Fa0
为引物名称的前
缀#在
$
份普通烟草品种中同样未获得有多态的引
物&而在
$
份野生烟草中却获得了
!#
对有多态的引
物!多态率为
!#H
"
!#
%
#""
#"图
#
!
Q
#)
#""
对本塞
姆氏烟基因组
AAB
引物"以
Fa>
为引物名称的前
缀#在供试的
$
份普通烟草品种中检测出
#%
对引物
呈现出现多态性!即在普通烟草中的多态率为
#%H
"
#%
%
#""
#&而在另外
$
份烟草野生种中筛选到
!,
对
有多态性的
AAB
引物!在野生烟草中的多态率为
!,H
"图
#
!
X
#)
图
#
!
普通烟草和野生烟草不同引物的扩增结果
I+
引物
Fa9","%,
的扩增产物&
Q+
引物
Fa0#%#",
的扩增产物&
X+
引物
Fa>#-""
的扩增产物)
#
"
$+
普通烟草&

"
&+
野生烟草
/`
?
+#
!
X^B
Y
UY
U/6@U0<11<1*^ IC5>
S
0/8]@U097/1/1
?
>@9[@@1!"#$%"&&9<>7;;<071W[/8W9<>7;;<0
I+^XB
Y
U&
Q+^XB
Y
U&
X+^XB
Y
U#-""
&
#
"
$+XN89/]79@W9<>7;;<
679@U/780
&

"
&+g/8W9<>7;;<679@U/780
%
!
讨
!
论
$CA
!
基因组
%%&
位点与物种进化关系
绒毛状烟草*林烟草和普通烟草基因组中的
#
"
-
碱基基序的
AAB
位点以二碱基基序出现频率
最高!其次是三碱基基序与六碱基基序)这与拟南
芥#(!%"(*水 稻#-!#&!#!%"(*小 麦#-*#(!#(*玉 米#&(*棉
花#&(*胡椒#"!%#(*西红柿%#(*马铃薯%#*%!(和葡萄%%(
基因组
AAB
位点中存在大量的单*二*三碱基基序
的结果一致&与高粱%$(*豆科植物根瘤菌和秀丽线
虫%(基因组中
AAB
位点信息的研究结果有所不
同!这些物种基因组
AAB
位点以四*五*六碱基基序
为主)研究表明!短重复基序的大量存在表明该物
种的进化水平相对较高%$(!而长重复基序占绝大多
数的物种一般具有较低的突变频率或具有较短的进
化时间%-*%&()本研究中的
%
份烟草野生种基因组
中!二*三碱基基序占绝大多数!表明烟草在生物进
化与分类地位中处于相对较高的进化水平!其基因
组经历了较长的进化时间或具有较高的突变频率)
$CB
!
$
份烟草野生种基因组
%%&
位点的分布特征
在对植物基因组
AAB
位点信息分布特征研究
中!大量的研究主要集中在
AAB
位点出现频率*分
布区域*基序类型和基序结构
$
个方面)"
#
#在
AAB
位点出现频率方面!以
AAB
长度
#
#&>
Y
为标准!
T7[0<1
等%"(研究表明!拟南芥和水稻全基因组中
AAB
位点出现频率分别为
!%+,
和
##+$D>
)在烟
草
5AF*AAB
的研究中!张俊娥等#!(*胡重怡等#%(
和薛金爱等#$(分别按照
AAB
长度
#
#!>
Y
*
AAB
长
度
#
#->
Y
和
AAB
长度
#
#">
Y
为标准!在烟草
5AF
序列数据中进行搜索发现!烟草
5AF*AAB
出
现频率分别为
"+(!
*
#$+!#
和
%+#-D>
)王卫峰
等#(利用
AAB`P4\B
软件并以
AAB
长度
#
!">
Y
为标准!在绒毛状烟草基因组数据进行搜索!结果表
明!绒毛状烟草基因组中
AAB
出现频率为
$""D>
)
本研究为了方便下一步设计
AAB
引物及尽可能提
高所开发的
AAB
引物的实用性!采用了比以往研究
者更为严格的搜寻
AAB
位点统计标准!结果显示!
在绒毛状烟草*林烟草和本塞姆氏烟草基因组中
AAB
位点出现频率为分别为
#%+($
*
#!+$!
和
(+%"
D>
)在绒毛状烟草基因组中
AAB
位点出现的频率
上!本研究结果是王卫峰等#(搜索结果的
!&+-
倍!
原因可能是使用软件的不同及基因组数据的质量不
同而造成的)"
!
#在
AAB
位点分布区域方面!通过
对拟南芥和水稻全基因组中的
AAB
位点分布研究!
#
&
期
!!!!!!!!!!!!
童治军!等$
%
种烟草基因组
AAB
位点信息分析和标记开发
T7[0<1
等%"(发现
AAB
在
EFB
区域"尤其是
G*
EFB
区域#出现的密度最高!其次是内含子区域!外
显子区域最低)薛金爱等#!(发现位于
CAA
中
AAB
位点比例明显高于
5AF
序列!分析可知!
CAA
序列
中包含了非编码区而
5AF
序列中则不包含非编码
区)本研究结果与前人对植物
AAB
位点信息分析
报道十分吻合#$!%"(!这一结果也刚好与生物自身的
进化相吻合!即在物种的进化过程中!由于核酸不同
区域所承受的选择压不同而最终导致了相对保守的
外显子区域出现
AAB
重复序列的概率大大降低!而
在非翻译区域"
EFB
#及内含子区域出现
AAB
重复
序列的概率大大增加)"
%
#在
AAB
基序类型上!现
有的研究一致认为!在全基因组中不论是绝对数目
还是所占的相对比例!均以二碱基基序出现最多!三
碱基基序次之#"!#!%"!%((&而在
5AF
序列中!则是以
三碱基基序最多!二碱基基序次之#!*#$!#-*#(()本研
究中!我们搜寻的
AAB
位点信息是基于绒毛状烟
草*林烟草和本塞姆氏烟草全基因组序列!其结果与
前人在全基因组中的报道一致!即二碱基基序出现
最多!三碱基基序次之)"
$
#在
AAB
基序结构方面!
本研究表明在单碱基基序类型中以
I
%
F
基序结构
出现频率最高!此结果与以往的研究一致&在二碱基
基序类型中本研究的基因组
AAB
位点均以
IF
%
FI
基序结构出现的频率最高!此结果与小麦*玉米*大
豆*水稻及绒毛状烟草基因组中以
IC
%
FX
出现的
频率最高有所不同#"!#!%"(&在三碱基基序类型中!拟
南芥和绒毛状烟草基因组以
IIC
%
FFX
基序结构
出现频率最高#!%"(!而大麦*小麦*玉米*高粱*水
稻*黑麦等禾本科作物中则以
XXC
%
CXX
基序结构
最丰富!
IFF
%
FII
最少#-*#&!%"(!本研究中则以
IIX
%
FFC
的出现频率最高)此外!在本研究中检
测到的共
-!&-%$
"
#%%,e#(-$(%e!,&,&$
#个
AAB
位点中!其基序结构方面均存在着含有
C
"或
X
#数量"含量#越少则该基序结构出现频率也越高
的趋势)这种趋势很可能与碱基对所含的能量有
关!即打破
CX
键所需的能量要远高于
IF
所需的
能量!因此!
IF
相较于
CX
更易变动!所以在产生
AAB
重复序列时含有
IF
重复基序结构的类型出现
的频率更高%$!%&*%(()
$C$
!
$
份烟草野生种基因组
%%&
的应用
现有的
AAB
位点功能研究表明!一般情况下基
因内或基因附近的
AAB
影响基因的表达#"!%,!%((!
AAB
标记在基因组内已知的位置及侧翼保守序列
对重要农艺性状功能基因的分析*
JFT
精细定位*
群体遗传分析等方面的研究十分有利!有助于快速*
准确找到基因连锁位点!为候选基因的筛查*鉴定*
基因注释及功能分析等提供线索)
Q/1W8@U
等!!*!%(
和
F<1
?
等!$(利用
AAB
标记分别在烟草类型间"烤
烟与晒烟#和类型内"烤烟与烤烟#构建了高密度的
普通烟草"
!1_$&
#分子遗传图谱&
F<1
?
等!(和
f<19/6/997
等!-(利用
AAB
标记分别对烟草赤星病
抗性基因和烟草黑胫病抗性基因进行了全基因组的
JFT
扫描并获得了主效
JFT
&
2等!,(利用
与烤烟
X中黑胫病抗性基因紧密连锁
的
AAB
标记对
R%!-
进行了分子标记辅助选择育
种&
a<<1
等!&(利用
AAB
分子标记分析了
$
份烟
草属材料的遗传多样性)本研究基于绒毛状烟草*
林烟草和本塞姆氏烟草基因组开发合成的
%""
对
AAB
引物均能在供试的
&
份烟草材料中扩增获得
稳定清晰的目标片段)
!
份烟草祖先种"绒毛状烟
草和林烟草#基因组
AAB
引物均未能在参试的
$
份
普通烟草品种中扩增获得多态性!而在
$
份烟草野
生种中获得较高的多态率"绒毛状烟草基因组
AAB
的多态率为
#(H
!林烟草基因组
AAB
的多态率为
!#H
#!表明我们开发的这
!
种基因组
AAB
引物不
适合普通烟草种内研究!而在种属间或更高的分类
级别上对烟草进行进化*分类*资源多样性*功能基
因等遗传育种领域的研究是可行的)基于本塞姆氏
烟草基因组开发的
AAB
引物在参试的
$
份普通烟
草品种中多态率为
#%H
!在
$
份烟草野生种中多态
率为
!,H
!适合普通烟草种内和不同烟草种间研
究)究其原因!可能是$"
#
#栽培烟草"尤其是烤烟#
由于经历了长期的人工驯化和定向选择等因素的影
响导致了其亲缘关系较近*遗传基础相对狭窄&野生
烟草因受人为因素影响较少而保留了较丰富的遗传
多样性,*&(&"
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#绒毛状烟草"
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#和林烟草"
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#两祖先种杂交后!经染色体自然加倍形成的
普通烟草"
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_$&FFAA
#
中含有的
F
和
A
两套基因组成分虽经长期的进化
选择但仍相对保守&而野生烟草种间则不存在此现
象!因此!野生烟草种间存在着较丰富的多样性)此
外!由于本塞姆氏烟草"
!31)%2&("&&!1_#(
#
_%&QQ
#与参试的其余
,
份烟草材料在基因组成分
上存在一定程度的差异#(!因此!源于该基因组的
AAB
引物既能在普通烟草种内获得较高的多态率!
也能在野生烟草种间呈现极高的多态性)
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