全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(9): 1602−1611 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(2012ZL058)和国家自然科学基金青年基金(31201489)资助。
* 通讯作者 (Corresponding authors): 王倩 , E-mail: wangqian2000_zb@163.com, Tel: 0532-88701031; 刘好宝 , E-mail: l88702236@
163.com, Tel: 0532-88701829
第一作者联系方式: E-mail: jinyirong688@163.com
Received(收稿日期): 2012-12-31; Accepted(接受日期): 2013-04-22; Published online(网络出版日期): 2013-07-09.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130709.1601.016.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01602
林烟草钾离子通道基因 NKT6的克隆与表达定位分析
靳义荣 1,2 宋毓峰 1,2 白 岩 1,2 张 良 1,2 董连红 1,2 刘朝科 3
冯祥国 3 胡晓明 3 王 倩 1,* 刘好宝 1,*
1中国农业科学院烟草研究所 / 农业部烟草生物学与加工重点实验室, 山东青岛 266101; 2中国农业科学院研究生院, 北京 100081;
3川渝中烟工业有限责任公司, 四川成都 610000
摘 要: Shaker 家族钾离子通道在植物钾的吸收转运及其他生命过程中发挥重要作用。本研究利用同源克隆的策略
从林烟草中获得一个 Shaker家族钾离子通道基因, 命名为 NKT6 (GenBank登录号为 KC310448)。该基因 cDNA序列
全长 2 317 bp, 编码由 681个氨基酸组成的蛋白, 该蛋白与 Shaker家族其他成员具有较高同源性。NKT6基因组 CDS
序列共含有 11个外显子、10个内含子。系统进化树分析表明, NKT6蛋白是 Shaker家族 Group II的成员之一。荧光
定量 PCR分析发现, NKT6的表达量在林烟草的茎和腋芽中最高, 其次在萼片、叶、花中, 在根中最低。亚细胞定位
结果表明, NKT6主要定位于细胞膜和核膜附近的内质网上。干旱与外源 ABA胁迫处理后, NKT6的表达量均呈下降
趋势。推测 NKT6可能在林烟草气孔开放中发挥作用。
关键词: 钾离子通道; 林烟草; NKT6; 克隆表达; 亚细胞定位
Molecular Cloning and Expression Analysis of Potassium Channel Gene NKT6
in Nicotiana sylvestris
JIN Yi-Rong1,2, SONG Yu-Feng1,2, BAI Yan1,2, ZHANG Liang1,2, DONG Lian-Hong1,2, LIU Chao-Ke3,
FENG Xiang-Guo3, HU Xiao-Ming3, WANG Qian1,*, and LIU Hao-Bao1,*
1 Key Laboratory of Tobacco Biology and Processing, Ministry of Agriculture / Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sci-
ences, Qingdao 266101, China; 2 Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3 China Tobacco Chuanyu
Industrial Co. Ltd., Chengdu 610000, China
Abstract: Shaker family potassium channels play a crucial role in absorption and transportation of potassium in plants. A new
potassium channel gene, designated NKT6 (GenBank accession number KC310448), was isolated from Nicotiana sylvestris using
homologous cloning strategy. The full length sequence of NKT6 cDNA was 2137 bp. The deduced protein sequence contained 618
amid acids and exhibited high homology with Shaker family potassium channels. The genomic sequence of NKT6 contained 11
exons and 10 introns. The phylogenetic tree showed that NKT6 belongs to Group II of Shaker family. Real-time quantitative PCR
assay indicated that the expression level of NKT6 in stem was the highest at full-bloom stage of N. sylvestris. Subcellular localiza-
tion assay showed NKT6 was localized on plasma membrane and endoplasmic reticulum of tobacco epidermal cells. The expres-
sion level of NKT6 declined after drought and ABA treatment. These results demonstrated that NKT6 might play a role in stomatal
movement.
Keywords: Potassium channel; Nicotiana sylvestris; NKT6; Cloning and expression; Subcellular localization
钾是植物生长发育所必需的矿质营养元素之一,
是作物产量与品质形成的限制因素。植物中钾的吸
收与转运依赖膜蛋白, 主要包括钾离子通道和高亲
和性的钾转运体[1]。在大多数土壤环境中, 钾离子通
道对钾吸收的贡献率在 50%以上[2-3]。根据蛋白的结
构与功能, 植物钾离子通道可分为 Shaker、KCO 与
第 9期 靳义荣等: 林烟草钾离子通道基因 NKT6的克隆与表达定位分析 1603


CNGC 三个家族。其中, Shaker 家族被认为是介导
植物钾营养吸收、转运和细胞钾离子动态平衡过程
的最为重要的钾离子通道蛋白[4]。
Shaker 钾离子通道蛋白含 6 个跨膜结构域
(S1~S6)。S4包含保守且有规律间隔开的带正电荷氨
基酸残基序列, 存在电压感应区[5]。S5与 S6之间的
离子传导孔区(P结构域), 构成了离子选择性过滤器
的部分区域[6]。P结构域含有一段高度保守的氨基酸
序列 TxxTxGYGD, 该序列是钾离子通道的标志性
序列[7]。拟南芥基因组中包含 15个钾离子通道基因,
其中 9个编码产物属 Shaker家族, 分属于 Shaker家
族的 5个组, 即 Group I、Group II、Group III、Group
IV 和 Group V, 同组成员在蛋白表达、定位及生理
功能等方面具有较高的相似性[8]。Group I和Group II
为内向整流型钾离子通道, 介导钾离子由胞外流向
胞内; Group V为外向整流型钾离子通道, 介导钾离
子由胞内流向胞外; Group III 为弱内向整流型钾离
子通道, 可介导钾离子的双向流动; Group IV为调控
亚基 , 单独存在时不能形成功能性钾离子通道。
Group I与 Group IV主要存在于根中; Group II主要
存在于叶片尤其是保卫细胞中; Group III分布广泛,
在韧皮部中表达尤为丰富; 外向整流型 Group V 存
在于根、茎及保卫细胞中。
烟叶中的钾含量是评价其品质的重要指标, 但
关于烟草中钾离子通道的研究还比较少。1999 年,
首次克隆了圆锥烟草(Nicotiana paniculata)的一个钾
离子通道基因 NpKT1 [9]。Sano等[10]采用同源克隆的
策略在普通烟草中得到 NKT1、NKT2、NTORK 与
NtKC1。该研究利用烟草 BY-2 细胞系发现, NKT1
与 NtKC1介导的钾离子的吸收在细胞间期的膨胀和
G1向 S阶段的转化过程中发挥功能, 细胞分裂期则
需要 NTORK介导的钾离子外流, NKT2在 BY-2细
胞中未显著表达。其后, 黄花烟草及普通烟草中相
继有钾离子通道基因的报道[11-14]。目前, 烟草钾离
子通道的研究大多局限于基因的克隆, 对其在烟草
中的定位、组织分布、调控机制等方面了解还不多。
本研究采用同源克隆的方法 , 从二倍体林烟草
(Nicotiana sylvestris)中获得一个新的 Shaker 家族钾
离子通道基因NKT6 (GenBank ID: KC310448); 并通
过与其基因组 DNA序列的比对分析, 确定 NKT6基
因内含子和外显子的分布及对该基因的生物信息学
与组织表达研究, 进一步对其编码产物进行了亚细
胞定位分析。该研究为了解烟草钾离子通道在烟草
生长发育过程中的作用提供了试验依据, 在促进烟
草钾吸收与分子育种方面具一定应用价值。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物材料 在温室中种植林烟草(N. sylves-
tris)和本生烟(N. benthamiana)。
提取正常生长至盛花期的林烟草根、茎、叶、
花、萼片和腋芽组织的总 RNA, 用于组织定量试验。
将正常生长至 4~5片真叶期的林烟草分为 3组,
每组分为处理与对照两部分。第 1组用 10%PEG培
养液浇灌以模拟干旱, 用全营养液浇灌为对照; 第 2
组用 50 μmol L−1外源ABA溶液叶面喷施, 以喷水为
对照; 第 3 组用低钾培养液浇灌为低钾胁迫处理 ,
用全营养液浇灌为对照。各处理之幼苗均在持续光
照的培养箱中培养。分别采集干旱和 ABA处理 1、
3、6、12和 24 h以及低钾胁迫处理 2、4、6、24和
48 h 后的林烟草叶片 , 于液氮中速冻后迅速放于
−80℃冰箱保存, 提取上述叶片总 RNA, 进行表达
水平变化分析。
1.1.2 试剂 RNAiso Plus、Taq 聚合酶、DNA
marker、PrimeScript RT Reagent Kit、pMD19-T、
PrimeScript RT-PCR Kit、Agarose Gel DNA Purifica-
tion Kit、PrimeScript RT Reagent Kit、SMART RACE
cDNA Amplication Kit (Clontech)、MiniBEST Uni-
versal Genomic DNA Extraction Kit购自宝生物工程
(大连 )有限公司。用于瞬时表达的载体 pGDG、
pGDR、pGDP19 (表达番茄丛矮病毒基因沉默抑制子
P19 蛋白)由美国加州大学伯克利分校的 Andrew O.
Jackson教授惠赠[15]。试验所用引物由北京六合华大
基因科技股份有限公司合成(表 1)。
1.2 NKT6全长 cDNA克隆与 NKT6基因组 DNA
的获得
1.2.1 中间片段的扩增 根据GenBank中已发表
的拟南芥、番茄等植物的钾离子通道基因的 cDNA
序列 , 在基因中部保守区段设计引物对 NKT-F/
NKT-R, 预计扩增 400 bp的条带。采用 TRIzol法提
取林烟草叶片中总 RNA, 进行 RT-PCR 反应(参照
PrimeScript RT-PCR Kit操作说明)。PCR反应条件为
94℃预变性 5 min; 94℃变性 30 s, 58℃退火 30 s,
72℃延伸 30 s, 35个循环; 72℃延伸 10 min。PCR产
物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后, 将目的条带纯化
回收(参照 TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit
1604 作 物 学 报 第 39卷

操作说明)。将回收产物连入 pMD19-T载体, 转化大
肠杆菌 Escherichia coli DH5α。筛选阳性菌落, 摇菌
提取质粒, 送北京六合华大基因科技股份有限公司
测序。采用 DNAMAN和 NCBI Blast分析测序结果。
1.2.2 NKT6 全长 cDNA 克隆的获得 参照
SMART RACE cDNA Amplication Kit操作说明书进
行 5′端与 3′端的 RACE 反应。根据 1.2.1 中获得的
cDNA中间片段, 设计特异性引物 5′GSP与 3′GSP。
以 3′GSP/UPM为引物扩增基因的 3′端, 3′RACE反应
条件为 94℃预变性 5 min; 94℃变性 30 s, 65℃退火
30 s, 72℃延伸 2 min, 35个循环; 72℃延伸 10 min。
以 5′GSP/UPM为引物扩增 5′端, 5′RACE反应条件为
94℃预变性 5 min; 94℃变性 30 s, 65℃退火 30 s,
72℃延伸 2 min, 35个循环; 72℃延伸 10 min。PCR
产物的获得及测序参见步骤 1.2.1。
应用 SeqMan 软件将中间片段、 5′RACE、
3′RACE 序列进行电子拼接 , 根据拼接后的全长
cDNA 序列 , 在 5′-UTR 和 3′-UTR 设计引物对
NKT6-1F/NKT6-1R, 用于扩增完整 ORF。反应条件
为 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 2 min, 35个
循环; 72℃ 10 min。PCR产物的获得及测序参见步
骤 1.2.1。所获正确克隆被命名为 pMD19-T-NKT6。
1.2.3 NKT6 基因组 DNA 的获得 按照 Mini-
BEST Universal Genomic DNA Extraction Kit操作说
明, 提取林烟草基因组 DNA。根据 NKT6 cDNA序列
设计引物对 NKT6-2F/NKT6-2R, 以基因组 DNA 为模
板, 进行 PCR扩增。反应条件为 94℃ 5 min; 94℃ 30 s,
54℃ 30 s, 72℃ 3 min, 35个循环; 72℃ 10 min。

表 1 试验中采用的引物及序列
Table 1 Primers used in this study
引物名称
Name of primers
序列
Sequence of primers (5–3)
用途
Purpose
NKT-F TAGGTGTTGGGAGATGTT
NKT-R GCAAATAGGGCACTGACT
扩增 NKT6 cDNA中间片段
To amplify the middle fragment of NKT6 cDNA
5′GSP AACTTGAAGCCAACTCCACC NKT6 5′ RACE反应
To amplify the 5′ region of NKT6 cDNA
3′GSP ATCACAAAGAAAGCGGTGGAGT NKT6 3′ RACE反应
To amplify the 3′ region of NKT6 cDNA
NKT6-1F CAAGAAAGTCTAAAACCCCACC
NKT6-1R TTTTTTTTTTTTTTTTTT
扩增 NKT6全长 cDNA
To amplify the full-length sequence of NKT6 cDNA
NKT6-2F ATGTCTTTTTCTTATGCTA
NKT6-2R TTGCAATTTTGATTTCTCCC
扩增 NKT6基因组序列
To amplify the genomic sequence of NKT6
NKT6-3F TAGGTGTTGGGAGATGTTTCTG
NKT6-3R TTAGGTTCATCAACAAGGAGATAGG
扩增长为 208 bp的 NKT6中间片段, 用于组织定量
To amplify the middle fragment of NKT6 with a length of 208
bp for Real-time quantitative PCR
NKT6-4F CTCGAGCCATGGTGTCTTTCTCTTATGCTA
AA AACTG
NKT6-4R CGGGATCCGGTACCGCAAGCATTCATGTT
AAG GAAGAA
扩增 NKT6, 用于亚细胞定位
To amplify NKT6 for subcellular localization
Actin-F CAAGGAAATCACCGCTTTGG 扩增内参基因 Actin
To amplify the internal reference gene Actin

1.3 NKT6基因的表达特性分析
根据烟草 Actin基因和 NKT6的序列, 分别设计
荧光定量 PCR 引物对 Actin-F/Actin-R、NKT6-3F/
NKT6-3R。参照宝生物 SYBR Premix Ex Taq (Perfect
Real Time)的操作说明书, 利用 SYBR Green I荧光
染料法进行相对荧光定量 PCR 反应, 每个样品设 3
次重复。PCR 反应体系为: ddH2O 6.8 μL、SYBR
Premix Ex Taq 10 μL、Rox Dye II0.4 μL、cDNA 2 μL
和上下游引物各 0.4 μL。PCR反应条件: 95℃ 30 s;
95℃ 5 s, 60℃ 34 s, 40个循环。
1.4 NKT6基因编码蛋白的亚细胞定位
1.4.1 亚细胞定位载体的构建 以 NKT6-4F/
NKT6-4R为引物, 以 pMD19-T-NKT6 (见 1.2.2)为模
板, 扩增 NKT6基因。PCR产物经 Xho I与 BamH I
双酶切后, 连入 Xho I与 BamH I双酶切处理的定位
载体 pGDG、 pGDR, 获得质粒 pGDG-NKT6、
pGDR-NKT6, 分别表达蛋白 GFP-NKT6 (NKT6 氨
基端融合绿色荧光蛋白 GFP)和 DsRed2-NKT6 (NKT6
第 9期 靳义荣等: 林烟草钾离子通道基因 NKT6的克隆与表达定位分析 1605


氨基端融合红色荧光蛋白 DsRed2)。
1.4.2 以农杆菌浸润法侵染本生烟 通过液氮冻
融法将质粒 pGDG-NKT6、pGDR-NKT6和 pGDP19
转入农杆菌 EHA105。挑取阳性菌落接种到含对应
抗生素的 LB液体培养基(25 mg L–1 Rif, 50 mg L–1
Kan), 每分钟 200转 28℃振荡培养 12~16 h。将 3种
菌液 5000 × g离心 5 min, 悬浮(悬浮缓冲液: 10 mmol
L–1 MgCl2, 10 mmol L–1 MES, 150 μmol L–1 As)。含
pGDP19 的菌液分别与含 pGDG-NKT6 或 pGDR-
NKT6菌液混合, 使其 OD600为 0.3、0.5。室温静置 3
h后注射烟草叶片, 48~96 h内观察定位结果。
1.4.3 荧光观察 撕取浸润 48~96 h 的本生烟叶
片下表皮进行观察。GFP经 488 nm激光激发, 通过
550~590 nm 滤镜后获得荧光信号。DsRed2 发出的
红色荧光经 543 nm激光激发, 通过 570~600 nm滤
镜后获得信号。图像经软件 EZ-C1 FreeViewer 3.90
转换成 TIFF格式输出[16]。
2 结果与分析
2.1 NKT6基因的克隆与序列分析
2.1.1 NKT6 全长 cDNA 克隆的获得与序列分析
以 Shaker家族钾离子通道蛋白保守序列设计简
并引物, 从林烟草中扩增到 381 bp的 cDNA片段。
Blast 分析发现, 该片段编码的氨基酸序列与马铃薯
中钾离子通道基因 KST1高度同源, 相似性达 89%。
根据中间片段序列设计特异引物, 进行 5′和 3′RACE,
分别扩增得到 613和 1809 bp的条带。应用 Seqman
软件对获得的序列进行电子拼接 , 针对 5′-UTR
和 3′-UTR 区设计引物, 扩增获得全长 cDNA 序列
(图 1)。


图 1 NKT6全长 cDNA获得的过程
Fig. 1 Acquirement of the full-length cDNA of NKT6

该 cDNA 序列全长 2317 bp, 5′-UTR 61 bp,
3′-UTR 210 bp, 含有 2046 bp 的完整开放阅读框
(ORF)(图 2)。该 ORF可编码一个由 681个氨基酸组
成的蛋白质 , 推定分子量为 78.1 kD, 等电点为
6.81。Blast 分析结果表明, NKT6 与马铃薯 KST1
(X79779.1)、拟南芥 KAT1 (NM123993.2)、KAT2
(NM117939.4)的核苷酸序列相似性分别为 87%、
60%和 61%, 与其氨基酸序列相似性分别为 94%、
76%和 73%。前期工作已经从烟草中扩增得到 3 个
钾离子通道基因 NKT3、NKT4、NKT5 [12-14], 因此将
本试验获得的基因命名为 NKT6。
2.1.2 NKT6 基因组 DNA 的获得与分析 以林烟
草基因组 DNA为模板, 根据 NKT6 cDNA序列设计
引物, 扩增得到其基因组 DNA序列, 全长 3172 bp。
基因组序列与 cDNA序列比对结果表明, NKT6基因
组由 11个外显子和 10个内含子组成(图 3)。11个外


图 2 PCR扩增结果
Fig. 2 Products of PCR
M: D2000 marker; 1: 中间片段扩增结果; 2: 5′RACE扩增结果;
3: 3′RACE扩增结果; 4: 基因全长扩增结果。
M: D2000 marker; 1: middle fragment of NKT6; 2: product of
5′RACE; 3: product of 3′RACE; 4: product of full-length cDNA
amplification.
1606 作 物 学 报 第 39卷


图 3 NKT6基因组结构图
Fig. 3 The structure of NKT6 genomic DNA

显子的长度分别为 181、220、159、62、314、243、
96、32、186、447和 263 bp。它们分别被长度为 88、
83、101、105、90、92、104、98、122和 86 bp的
内含子隔开, 10个内含子长度变化幅度不大。
2.1.3 NKT6 编码蛋白的生物信息学分析 蛋白
的保守结构域分析表明, NKT6存在离子转运结构域
和环核苷酸结合域(图 4)。离子转运结构域包含 6个
跨膜区, 第 5与第 6跨膜区之间形成 P环, 决定了通
道离子选择性, 而环核苷酸结合域存在于 cAMP 及
cGMP 依赖的蛋白激酶及门控离子通道中。预测表
明, NKT6含 6个跨膜区(S1~S6)。S5与 S6之间的 P
结构域与其他 Shaker 钾离子通道具有很高相似性,
具有 TxxTxGYGD序列(图 5), 该序列是钾离子通道
的标志性序列[7]。采用 MEGA4.1 对 NKT6 与其他
Shaker 家族钾离子通道氨基酸序列进行比对并构建
系统进化树(图 6)。结果初步表明 NKT6属于 Shaker
家族 Group II, 为胞外磷酸化激活的内向整流型钾
离子通道, 推测 NKT6 可能介导钾离子由胞外向胞
内的运输。
2.2 NKT6的表达特性分析
2.2.1 NKT6 的组织表达分析 对正常生长条件
下林烟草中 NKT6的组织分布进行荧光定量 PCR检
测。结果表明, NKT6表达量由高到低依次在茎、腋
芽、萼片、叶、花、根中。其中茎中的表达量为叶
中的 8 倍, 在根中几乎没有表达(图 7)。与 NKT6 同
源性较高的马铃薯 KST1 在叶与花中表达, 在根中
没有表达, 主要介导保卫细胞的钾内流, 调控气孔
运动[17]。NKT6在玉米中的同源基因 ZMK2.1在茎与
叶中表达, 介导钾向韧皮部的流动 [18]。因此, 推测
NKT6可能在烟草的生长过程中发挥类似的功能。



图 4 NKT6的保守结构域分析
Fig. 4 Conserved domains of NKT6
Ion_trans: 离子转运结构域; cNMP_binding: 环核苷酸结合域。
Ion_trans: the conserved domain of ion transport proteins; cNMP_binding: cyclic nucleotide-monophosphate binding domain.


图 5 NKT6与其他 Shaker家族钾离子通道氨基酸序列比对
Fig. 5 Multiple amino-acid alignment of NKT6 with other Shaker family potassium channels
图中红色矩框柜标记为 Shaker家族钾离子通道中保守的 TxxTxGYGD序列。
The conserved sequence “TxxTxGYGD” of Shaker family potassium channels is indicated by a red rectangle.

第 9期 靳义荣等: 林烟草钾离子通道基因 NKT6的克隆与表达定位分析 1607




图 6 NKT6蛋白在 Shaker钾离子通道家族中的分类地位
Fig. 6 Taxonomic position of NKT6 in Shaker family potassium channels
图中标尺 0.1表示分支长度。The scale bar (0.1) is used to measure the branch length.



图 7 林烟草中 NKT6的表达分析
Fig. 7 Expression analysis of NKT6 in N. sylvestris
St: 茎; L: 叶; F: 花; Se: 萼片; A: 腋芽; R: 根。
St: stem; L: leaf; F: flower; Se: sepal; A: axillary bud; R: root.
2.2.2 NKT6 在干旱处理下的表达分析 荧光定
量 PCR检测表明, 干旱处理不同时间后, 叶中NKT6
的表达量均低于对照处理。随着处理时间的增加 ,
NKT6的表达量呈下降趋势(图 8)。干旱处理 1 h后,
NKT6表达量下降 35%。处理 12 h, NKT6表达量仅
为对照的 25%, 说明在干旱胁迫下 NKT6 的表达受
到抑制。
2.2.3 NKT6 在 ABA 处理下的表达分析 荧光定
量 PCR检测表明, ABA 处理后, 叶中 NKT6 的表达
量均低于对照(图 9)。其中, 外源 ABA 处理 1 h 后,
NKT6 的表达量降低 60%, 说明在外源 ABA 胁迫下
NKT6的表达受到一定程度的抑制。
2.2.4 NKT6 在低钾处理下的表达分析 荧光定
量 PCR检测表明, 低钾处理下, NKT6的表达量变化
不明显(图 10), 推测NKT6在转录水平可能不受低钾
胁迫的诱导表达。
1608 作 物 学 报 第 39卷


图 8 NKT6在干旱胁迫下的相对表达量
Fig. 8 Relative expression of NKT6 under drought treatment



图 9 NKT6在 ABA处理下的相对表达量
Fig. 9 Relative expression of NKT6 under ABA treatment

图 10 NKT6在低钾处理下的相对表达量
Fig. 10 Relative expression of NKT6 under low-K+ treatment

2.3 NKT6编码产物的亚细胞定位
GFP-NKT6 可在本生烟表皮细胞内大量表达 ,
绿色荧光信号主要分布在细胞膜上, 在核膜附近的
内质网中也有微弱的荧光信号, 细胞核中未检测到
明显的信号。随着注射时间的延长和蛋白表达量的
增加, 荧光信号有聚合现象。只表达对照 GFP的烟草
表皮细胞中, GFP 蛋白大量表达, 绿色荧光信号主要
分布于细胞质、细胞膜和细胞核中(图 11)。NKT6融
合 DsRed2 时, 定位结果与其融合 GFP 基本一致(图
12)。DsRed2-NKT6主要分布在细胞膜和核膜附近的
内质网上, 强度略强于 GFP-NKT6。对照 DsRed2 则
在细胞质、细胞膜和细胞核中大量表达。初步表明,
NKT6定位于细胞膜和核膜附近的内质网膜上。



图 11 GFP-NKT6在本生烟表皮细胞中的定位
Fig. 11 Subcellular localization of NKT6 fused with GFP in the epidermal cells of N. benthamiana
第 9期 靳义荣等: 林烟草钾离子通道基因 NKT6的克隆与表达定位分析 1609




图 12 DsRed2-NKT6在本生烟表皮细胞中的定位
Fig. 12 Subcellular localization of NKT6 fused with DsRed2 in epidermal cells of N. benthamiana

3 讨论
3.1 NKT6克隆的获得与序列分析
Shaker 家族钾离子通道在烟草的生命过程中发
挥着重要作用。但目前国内只有少数烟草钾离子通
道基因得到克隆。本研究利用同源克隆和 RACE 技
术, 从林烟草中得到一个新的钾离子通道基因, 命
名为 NKT6。分析表明, NKT6 蛋白与其他物种中的
Shaker 家族钾离子通道高度同源, 属于 Shaker 家族
Group II。
本研究发现 NKT6 与大部分 Shaker 家族 Group
II 成员在 C-末端胞内区结构上存在一致性, 即不存
在锚定蛋白结构域。该结构域在 Shaker 家族 Group
I、Group III和 Group V成员中存在, 可能不参与通
道蛋白亚基的异聚化作用, 而在与其他蛋白的互作
或细胞膜锚定的过程中发挥作用[19]。
NKT6 与 Shaker 家族 Group II 成员 KAT2 和
ZmK2.1 具有相似的基因组序列结构, 均有 11 个外
显子和 10个内含子, 且不同长度内含子的分布较一
致[18]。Group II另一成员 KAT1缺失 2个内含子, 但
也具有较为相似的结构[20]。真核生物基因中的内含
子可影响基因的表达。NKT6内含子序列和分布的确
定可为转录水平上 NKT6表达调控的研究提供参考。
同时, NKT6基因组序列的获得也为后续采用定向诱
导基因组局部突变技术(TILLING)筛选 NKT6突变体,
进而解析 NKT6的功能奠定了基础[21]。
3.2 NKT6的亚细胞定位分析
拟南芥中已发现的 9个 Shaker家族钾离子通道
全部定位于细胞质膜[22]。与拟南芥中 Shaker家族成
员的研究结果一致, 融合荧光蛋白的 NKT6 主要被
定位于细胞膜, 推测 NKT6 主要在细胞膜上行使蛋
白功能。在瞬时表达后期, 在内质网中检测到荧光
信号, 其原因可能是试验中采用 35S 强启动子导致
NKT6 的过量表达, 蛋白不能及时转运至细胞膜而
滞留在内质网中。后续试验可通过扩增 NKT6 自身
启动子, 研究其自身启动子驱动下的 NKT6 表达和
定位情况, 综合确定 NKT6的定位。
3.3 NKT6的功能分析
一般而言, 植物中特定组织表达的钾离子通道
常具有特定的功能, 例如拟南芥 AKT1 在根部特异
表达, 介导拟南芥根细胞从土壤中吸收 K+, SPIK在
拟南芥花粉管与花粉中特异表达, 影响花粉管的生
长与花粉活力[23-24]。本试验发现, NKT6在林烟草的
茎、腋芽和叶等地上组织中表达, 而在根中几乎未
检测到, 且与调节气孔运动的 KST1、KAT2 等基因
高度同源, 因此推测其可能在气孔运动或 K+的韧皮
部装载过程中发挥作用。气孔能够响应多种环境信
号, 从而调节植物的蒸腾作用与 CO2 的吸收, 而干
旱和外源 ABA 处理会引起气孔关闭[25]。K+是影响
气孔运动的重要因素, 细胞内 K+浓度降低使保卫细
胞渗透势下降, 最终引起细胞失水、气孔关闭。本
研究表明, 干旱和外源 ABA 处理后, 叶中 NKT6 的
1610 作 物 学 报 第 39卷

表达量降低, 因此, 推测其介导保卫细胞的 K+内流,
从而调控气孔运动。拟南芥中 Shaker家族钾离子通
道 KAT1、KAT2与 GORK三者共同调控气孔的开闭,
其中 KAT1和 KAT2主要参与气孔保卫细胞的 K+内
流, GORK 为外向钾通道, 负责气孔关闭过程中的
K+外流。ABA与其他逆境条件下, KAT1和 KAT2在
叶中的表达量降低[26-27], 这与本研究中 NKT6 的表
达一致。
本研究中 NKT6 在低钾条件下的表达量未出现
显著变化。拟南芥中最重要的 K+吸收通道 AKT1 在
低钾胁迫下, 也未检测到其转录水平的明显变化[23],
但其上游激活因子 CBL1/CBL9和 CIPK23的表达量
明显升高, 从而使有活性的 AKT1 增加[28]。蚕豆保
卫细胞中钾离子通道 KAT1 可被 ABR 激酶磷酸化,
以响应 ABA信号途径下的气孔关闭[29]。可见, 除转
录水平外, Shaker 家族钾离子通道也存在转录后水
平的调控。因此, 对于 NKT6 在低钾、干旱、ABA
等逆境下的表达及在蛋白水平上的调控还需更深入
研究。
4 结论
获得了一个 Shaker 家族钾离子通道基因 NKT6,
其 mRNA在林烟草的茎和腋芽中大量表达。该基因
编码产物 NKT6 由 681 个氨基酸组成, 包含钾离子
通道的保守结构域, 属于 Shaker家族Group II, 定位
于烟草表皮细胞的细胞膜上。NKT6 基因组序列含
11个外显子和 10个内含子。干旱与外源 ABA胁迫
处理下, NKT6的表达量降低。初步推测 NKT6可能
在保卫细胞气孔开放中发挥作用。
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