全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４４(３): ３２７￣３３１(２０１４)
收稿日期: ２０１３￣０８￣３０ꎻ 修回日期: ２０１３￣１０￣２４
基金项目: 国家葡萄产业技术体系建设项目(ＣＡＲＳ￣３０￣ｂｃ￣３)
通讯作者: 董雅凤ꎬ研究员ꎬ主要从事果树病毒学研究ꎻＴｅｌ:０４２９￣３５９８２７８ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｙｆｄｏｎｇ＠１６３.ｃｏｍꎮ
研究简报
葡萄 Ａ病毒外壳蛋白原核表达及抗血清制备
任 芳ꎬ 董雅凤∗ꎬ 张尊平ꎬ 范旭东ꎬ 胡国君ꎬ 朱红娟
(中国农业科学院果树研究所ꎬ国家落叶果树脱毒中心ꎬ兴城 １２５１００)
Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ Ａ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
ＲＥＮ Ｆａｎｇꎬ ＤＯＮＧ Ｙａ￣ｆｅｎｇꎬ ＺＨＡＮＧ Ｚｕｎ￣ｐｉｎｇꎬ ＦＡＮ Ｘｕ￣ｄｏｎｇꎬ ＨＵ Ｇｕｏ￣ｊｕｎꎬ ＺＨＵ Ｈｏｎｇ￣ｊｕａｎ (Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｖｉｒｕｓ￣ｆｒｅｅ Ｄｅｃｉｄｕｏｕｓ Ｆｒｕｉｔ Ｔｒｅｅꎬ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｏｍｏｌｏｇｙꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｃｉ￣
ｅｎｃｅｓꎬ Ｘｉｎｇｃｈｅｎｇ １２５１００ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ Ａ (ＧＶＡ)ꎬ
ｔｈｅ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ ＧＶＡ ｉｓｏｌａｔｅ ＬＮ６８ ( ＪＦ７５４５７１) ｗａｓ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＴ￣２８ａ. Ｔｈｅ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＴ￣ＧＶＡ ＣＰ ｗａｓ ｔｈｅｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｅ. ｃｏｌｉ ＢＬ２１ (ＤＥ３) ｐｌｙｓＳ ｓｔｒａｉｎ. Ａｎ ａｐｐｒｏｘｉ￣
ｍａｔｅｌｙ ２６ ｋＤａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＧＶＡ ＣＰ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｔ ａ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｂｙ ＩＰＴＧ ｉｎ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ. Ｔｈｅ
ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ａｎｔｉｇｅｎ ｆｏｒ ｒａｉｓｉｎｇ ＧＶＡ ＣＰ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ. Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｏｆ
ＧＶＡ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎｄ ＥＬＩＳＡ. Ｉｔ ｗａｓ ｓｈｏｗｎ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｕｓｅｄ ｔｏ
ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＧＶＡ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓꎬ ａｎｄ ａｌｓｏ ｉｎ ｉｎｄｉｒｅｃｔ￣
ＥＬＩＳＡ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ＧＶＡ ｉｎ ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｇｏｍｐｈｒｅｎａ ｇｌｏｂｏｓ ａｔ ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ｕｐ ｔｏ １:２ ０００. Ｌａｒｇｅ
ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｙｉｅｌｄｅｄ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＰ ｇｅｎｅꎬ ａｎｄ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ
ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＧＶＡ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ Ａꎻ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎꎻ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎻ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０３￣０３２７￣０５
葡萄 Ａ病毒(Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ ＡꎬＧＶＡ)为线性
病毒科(Ｆｌｅｘｉｖｉｒｉｄａｅ)葡萄病毒属(Ｖｉｔｉｖｉｒｕｓ)的代
表种ꎬ是葡萄皱木复合病 ( ｒｕｇｏｓｅ ｗｏｏｄ ｃｏｍｐｌｅｘ
ｄｉｓｅａｓｅ)的重要病原之一ꎬ可引起葡萄嫁接成活率
下降、春季萌芽延迟、生长减弱甚至衰退死亡等危
害[１ꎬ２]ꎮ ＧＶＡ 为线状单链 ＲＮＡ 病毒ꎬ基因组共编
码 ５ 个开放阅读框(ＯＲＦ１￣５)ꎬ其中 ＯＲＦ４ 编码外
壳蛋白(ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎꎬ ＣＰ)ꎬ是病毒粒子包裹和系统
移动所必需的功能蛋白[３ꎬ ４]ꎮ ＧＶＡ 自然寄主为葡
萄ꎬ机械摩擦可侵染本氏烟等草本寄主[２]ꎬ由于嫁
接和无性繁殖材料调运等因素造成该病毒远距离
传播ꎬ目前在世界多个国家和地区均有发生ꎮ
葡萄为多年生藤本植物ꎬ病毒侵染后植株终身
带毒、持久危害ꎮ 栽培无病毒苗木和培育抗病品种
是防控葡萄病毒病的主要途径ꎬ而病毒检测是其中
的一个关键环节ꎮ 血清学是快速检测葡萄病毒的
主要方法之一ꎬ其操作简便、快速ꎬ成本低ꎬ适用于
田间样品的大量检测ꎬ但前提是要制备相应的抗血
清ꎮ 我国目前尚无市售 ＧＶＡ 抗血清ꎬ所用抗血清
均从国外进口ꎬ成本高昂ꎬ且国外抗血清与国内毒
源是否存在特异性差异还不明确ꎬ因此利用我国分
离物进行抗血清研制至关重要ꎮ 传统方法通过提
纯病毒粒子制备抗血清ꎬ但从寄主体内分离纯化病
毒粒子较困难ꎬ且常含寄主成分导致制备的抗血清
植物病理学报 ４４卷
特异性差ꎬ易出现假阳性等问题ꎮ 随着分子生物学
的发展ꎬ利用基因工程技术将病毒外壳蛋白基因在
大肠杆菌中高效表达ꎬ以表达产物作为抗原获得效
价高、特异性强的抗血清ꎬ是一种非常有效的方法ꎮ
本实验室已克隆并测定了我国多个 ＧＶＡ 分离物
ＣＰ基因序列[５]ꎮ 本研究以 ＧＶＡ 种群中的优势分
离物 ＬＮ６８(ＧｅｎｅＢａｎｋ 登录号:ＪＦ７５４５７１)ＣＰ 基因
构建原核表达载体ꎬ在大肠杆菌中获得高效表达ꎬ
以纯化蛋白为抗原制备抗血清ꎬ并对抗血清的效价
和特异性进行了检测分析ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 材料
ＧＶＡ毒源及包含 ＣＰ 基因的质粒由本实验室
保存ꎻＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ 感受态、Ｔａｑ 酶、限制性
内切酶购自 ＴａＫａＲａ 公司ꎻＣｌｏｎｅｇｅｔ 试剂盒、原核表
达载体 ｐＥＴ￣２８ａ购自上海文渊阁生物技术公司ꎻ大
肠杆菌表达菌株 ＢＬ２１(ＤＥ３)ｐｌｙｓＳ购自天根生物公
司ꎻＨｉｓ标签蛋白纯化试剂盒购自 Ｐｒｏｍｅｇａ 公司ꎻ羊
抗兔(ＩｇＧ)购自上海生工生物工程有限公司ꎮ
１.２ ＧＶＡ ＣＰ 基因的 ＰＣＲ 扩增及原核表达载体
构建
以本实验室保存的 ＰＭＤ￣ＧＶＡ ＣＰ 克隆质粒
为模板进行目的基因扩增ꎬ利用非内切酶依赖的新
型克隆系统 Ｃｌｏｎｅｇｅｔ 试剂盒进行原核表达载体构
建ꎬ引物设计按照 Ｃｌｏｎｅｇｅｔ 试剂盒要求ꎬ在 ５′端加
入与载体两端相同的 １５ ｂｐ 核苷酸(见下划线位
置): ＰＡＦ ( ５′￣ＡＴＧＧＧＴＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＧＣＡ￣
ＣＡＣＴＡＣＧＣＣＡＡＧＡ￣３′)ꎬ ＰＡＲ ( ５′￣ＴＴＧＴＣＧＡＣＧ￣
ＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＴＡＴＡＴＣＴＣＧＡＣＡＧＣＣＴＧ￣３′)ꎮ
将 ｐＥＴ￣２８ａ 用 ＥｃｏＲ Ｉ 单酶切成线性化载体ꎬ在
Ｃｌｏｎｅｇｅｔ 专有酶作用下将目的片段与载体连接ꎮ
转化大肠杆菌 ＢＬ２１感受态ꎬＰＣＲ检测和测序筛选
阳性克隆ꎮ ＰＣＲ鉴定采用载体 Ｔ７启动子引物(５′￣
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ￣３′)和 Ｔ７ 终止子
引物(５′￣ＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ￣３′)ꎬ目的
片段包含 ＧＶＡ ＣＰ基因及部分载体序列ꎮ
１.３ 重组蛋白诱导表达及纯化
将含重组质粒的 ＢＬ２１接种于含 Ｋｍ的 ＬＢ中ꎬ
３７℃振荡过夜培养ꎬ按 １ ∶ １００ 稀释到新鲜 ＬＢ(含
Ｋｍ)中ꎬ振荡培养至 ＯＤ６００约 ０.６时ꎬ加入 ＩＰＴＧ至终
浓度 １ ｍｍｏｌＬ－１ꎬ３７℃振荡培养 ６ ｈꎮ 表达产物用
ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳分析ꎮ 大量诱导表达后ꎬ按照 Ｈｉｓ
标签蛋白纯化试剂盒说明ꎬ通过 Ｎｉ２＋亲和吸附纯化
蛋白ꎬＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳检测纯化蛋白ꎮ
１.４ 抗血清制备、效价测定及特异性检测
以纯化蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔ꎬ纯化
产物加入 ２０％的佐剂添加剂ꎬ分 ２、２、２、１周期进行
免疫ꎬ首次免疫使用弗氏完全佐剂ꎬ增强免疫使用
福氏不完全佐剂ꎮ 通过 ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ 蛋白纯化去除血
清中的杂蛋白ꎬＥＬＩＳＡ 测定抗体效价ꎮ 以制备抗
血清为一抗ꎬ市售辣根过氧化物酶(ＨＲＰ)标记的
羊抗兔为二抗ꎬ对实验室保存的阳性草本样品以及
田间葡萄样品进行检测ꎬ待检样品 /阴性对照吸光
值(Ｐ / Ｎ)大于 ２.０ 为阳性ꎮ 采用 Ｗｅｓｔｅｒｎ￣ｂｌｏｔｔｉｎｇ
方法检测抗血清的特异性ꎬ以纯化重组蛋白和诱导
菌液总蛋白为抗原ꎬ空载体表达产物为阴性对照ꎮ
２ 结果与分析
２.１ ＧＶＡ ＣＰ基因 ＰＣＲ扩增及原核表达载体构建
利用 ＰＡＦ / ＰＡＲ 引物ꎬ从 ＧＶＡ ＬＮ６８ 分离物
ＣＰ克隆质粒中扩增到包含引物序列及载体连接片
段的约 ６３０ ｂｐ目的片段(图 １￣Ａ)ꎮ 将目的片段与
ｐＥＴ￣２８ａ载体在 Ｃｌｏｎｅｇｅｔ 试剂盒专用酶作用下连
接ꎬ并直接转化大肠杆菌表达菌株 ＢＬ２１ꎬ转化产物
ＰＣＲ检测结果表明成功获得阳性克隆(图 １￣Ｂ)ꎮ
阳性克隆测序结果显示扩增片段包含了 ＧＶＡ 的
完整 ＣＰ基因ꎬ并且与源序列同源性 １００％ꎬ且阅读
框正确ꎬ成功构建了重组原核表达载体 ｐＥＴ￣ＧＶＡ
ＣＰꎮ
２.２ 重组蛋白诱导表达及纯化
对诱导表达产物进行 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 电泳分析ꎬ
在约 ２６ ｋＤａ 位置出现过量表达的蛋白ꎬ与预期大
小一致ꎬ空载体及未诱导对照在该位置没有过量表
达蛋白ꎬ说明重组蛋白在大肠杆菌中获得正确表达
(图 ２￣Ａ)ꎮ 大量表达产物利用 Ｈｉｓ 标签蛋白纯化
试剂盒进行融合蛋白的纯化ꎬ纯化后产物 ＳＤＳ￣
ＰＡＧＥ电泳结果显示ꎬ在约 ２６ ｋＤａ 位置出现一条
特异性蛋白条带(图 ２￣Ｂ)ꎬ说明获得了浓度和纯度
均较高的纯化蛋白ꎮ
８２３
３期 任 芳ꎬ等:葡萄 Ａ病毒外壳蛋白原核表达及抗血清制备
Ｆｉｇ. １ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＶＡ ＣＰ ｇｅｎｅ ( Ａ ) ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ( Ｂ )
Ｍ: Ｄ２０００ꎻ Ａ１: Ｗａｔｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ａ２: ＧＶＡ ＬＮ６８ ｉｓｏｌａｔｅꎻ Ｂ１￣Ｂ４: Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ １－４.
Ｆｉｇ. ２ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｐＥＴ２８ａ￣ＧＶＡ ＣＰ ｉｎ ＢＬ２１ (ＤＥ３) ｐｌｙｓＳ
Ａ: Ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓꎻ Ｂ: Ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ.
Ｍ: Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒꎻ Ａ１: Ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｐＥＴ￣２８ａ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ＢＬ２１ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＩＰＴＧꎻ
Ａ２ꎬ Ａ３ꎬ Ｂ１: Ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｐＥＴ￣ＧＶＡ ＣＰ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ＢＬ２１ ｗｉｔｈ (Ａ３ꎬ Ｂ１) ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ (Ａ２) ＩＰＴＧ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎꎻ
Ｂ２: Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ. Ｔｈｅ ａｒｒｏｗｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ.
２.３ 抗血清制备、效价测定及特异性检测
以纯化蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔ꎬ获得
了 ＧＶＡ ＣＰ 抗血清ꎬ通过 ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ 蛋白纯化去除
血清中的杂蛋白ꎬ获得纯化的免疫球蛋白 ＩｇＧꎮ 以
所制备的抗血清为一抗ꎬＨＲＰ 标记羊抗兔为二抗
进行Ｗｅｓｔｅｒｎ￣ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析ꎮ 结果显示ꎬＧＶＡ ＣＰ抗
血清与纯化蛋白和诱导菌液总蛋白均产生特异性
反应ꎬ与空载体表达产物无特异性反应(图 ３)ꎮ 表
明所制抗血清可与目的蛋白发生抗原￣抗体识别反
应ꎬ特异性较好ꎮ
应用制备的抗血清ꎬ采用间接 ＥＬＩＳＡ 方法对
实验室保存的携带 ＧＶＡ 的千日红 (Ｇｏｍｐｈｒｅｎａ
ｇｌｏｂｏｓａ)、携带葡萄 Ｂ 病毒 (Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ Ｂꎬ
ＧＶＢ)的西方烟(Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ)以及田间
葡萄样品进行检测ꎮ 其中ꎬ携带 ＧＶＡ 的千日红检
测结果为阳性ꎬ田间葡萄样品(乌兹别克玫瑰)检
９２３
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. ３ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓ￣
ｓｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ＧＶＡ ＣＰ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｕ￣
ｒｉｆｉｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｍ: Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒꎻ １:Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎꎻ ２ꎬ ３: Ｅ. ｃｏｌｉ ｔｒａｎｓ￣
ｆｏｒｍｅｄ ｗｉｔｈ ｐＥＴ￣２８ａ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＩＰＴＧꎻ ４ꎬ ５: Ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｆｒｏｍ ｐＥＴ￣ＧＶＡ ＣＰ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ＢＬ２１ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＩＰＴＧ. Ｔｈｅ
ａｒｒｏｗ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ.
测结果为阳性ꎬＧＶＢ 毒源及健康植株检测结果均
为阴性ꎬ表明该抗血清对植物材料特异性较好(表
１)ꎮ 以携带 ＧＶＡ 的千日红为抗原ꎬ采用间接
ＥＬＩＳＡ对制备的抗血清进行效价测定(表 ２)ꎮ 抗
血清稀释至 ２ ０００ 倍后仍表现阳性反应ꎬ效价达
１ ∶ ２ ０００ꎮ
Ｔａｂｌｅ １ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＧＶＡ ＣＰ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ
ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ
Ｓａｍｐｌｅ Ｒｅｓｕｌｔ
ＧＶＡ ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｇｏｍｐｈｒｅｎａ ｇｌｏｂｏｓａ ＋
Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ＣＶ. Ｍｕｓｃａｔ ｄ’Ｏｕｚｂｅｋｉｓｔａｎ ＋
ＧＶＢ ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ –
Ｈｅａｌｔｈｙ ｐｌａｎｔ –
“ ＋ ” : Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅａｃｔｉｏｎꎻ “–” : Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ.
Ｔａｂｌｅ ２ Ｔｉｔｅｒ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ
Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ / Ａ４５０
Ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ
１２５ ２５０ ５００ １ ０００ ２ ０００
Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｆｏｒ ＧＶＡ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｓａｍｐｌｅ / Ｐ ０.１７６ ０.１６４ ０.１４９ ０.１４２ ０.１４０
Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｆｏｒ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ / Ｎ ０.０７５ ０.０７０ ０.０６７ ０.０６４ ０.０６３
Ｐ / Ｎ ２.３４７ ２.３４３ ２.２２４ ２.２１９ ２.２２２
３ 讨论
ＧＶＡ具有丰富的遗传多样性ꎬ已有研究将其
分为 ３个变异组群:ＧＶＡⅠ、Ⅱ和Ⅲ[２]ꎮ 不同分离
物间序列同源性存在较大差异ꎬ而不同分离物间的
分子差异与血清学分化是否存在相关性还缺乏研
究ꎮ 本实验室从不同葡萄品种中分离到 １２ 个
ＧＶＡ分离物ꎬ分离物间 ＣＰ 序列同源性很高ꎬ并与
ＧＶＡⅠ组最为接近ꎬ其中ꎬ６０％的克隆序列聚在同
一个进化分支ꎬ推测这些序列为我国 ＧＶＡ 种群的
优势序列[５]ꎮ 本研究选取具有优势序列的分离物
ＬＮ６８为模板用于原核表达和抗血清制备研究ꎬ以
期获得检测谱广、检测效果好的抗血清ꎮ
传统方法采用提纯病毒粒子作为抗原免疫动
物制备抗血清ꎬ但由于 ＧＶＡ 在葡萄中含量很低ꎬ
且葡萄中含有大量酚类物质等ꎬ使得病毒分离提纯
非常困难ꎻＧＶＡ在田间还常与其他病毒复合侵染ꎬ
难以获得较纯的病毒粒子ꎮ 虽然 ＧＶＡ 可侵染本
氏烟等草本寄主[２]ꎬ但摩擦接种十分困难ꎬ很难获
得单毒源ꎬ且所提纯的病毒粒子常含寄主杂蛋白ꎬ
导致血清检测易产生假阳性ꎮ 利用原核表达策略
制备抗血清快速、高效、特异性较强ꎬ近年来在果树
病毒血清制备中应用较多ꎮ 本研究利用原核表达
载体 ｐＥＴ￣２８ａ 在大肠杆菌中高效表达了 ＧＶＡ ＣＰ
蛋白ꎬ以其作为抗原免疫大耳白兔获得抗血清ꎮ 经
Ｗｅｓｔｅｒｎ￣ｂｌｏｔｔｉｎｇ和间接 ＥＬＩＳＡ 对抗血清进行特异
性和效价测定ꎬ抗血清与纯化蛋白及诱导总蛋白均
可产生抗原￣抗体识别反应ꎬ与空载体对照不反应ꎬ
表明所制备的抗血清特异性较好ꎮ 将抗血清用于
植物材料检测时ꎬ携带 ＧＶＡ 的千日红和田间带毒
葡萄样品为阳性ꎬ健康植株和携带 ＧＶＢ 的烟草均
为阴性ꎬ表明抗血清可用于 ＧＶＡ 的特异性检测ꎮ
同时ꎬ为进一步研究 ＧＶＡ 不同分离物的血清学分
化提供了一定基础ꎮ
０３３
３期 任 芳ꎬ等:葡萄 Ａ病毒外壳蛋白原核表达及抗血清制备
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
[１] Ｍａｒｔｅｌｌｉ Ｇ Ｐꎬ Ｍｉｎａｆｒａ Ａꎬ Ｓａｌｄａｒｅｌｌｉ Ｐ. Ｖｉｔｉｖｉｒｕｓꎬ ａ
ｎｅｗ ｇｅｎｕｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｖｉｒｕｓ [ Ｊ] . Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙꎬ
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[２] Ｇｏｓｚｃｚｙｎｓｋｉ Ｄ Ｅꎬ Ｊｏｏｓｔｅ Ａ Ｅ Ｃ. Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉ￣
ｖｅｒｇｅｎｔ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ Ａ [ Ｊ] . Ｅｕｒｏｐｅａｎ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２００３ꎬ １０９(４): ３９７－４０３.
[３] Ｇａｌｉａｐａｒｏｖ Ｎꎬ Ｔａｎｎｅ Ｅꎬ Ｓｅｌａ Ｉꎬ ｅｔ ａｌ. Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ
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ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ
Ａ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｉｔａｌｉａｎ ｖｉｎｅｓ
[Ｊ] . Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２００８ꎬ １２０
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[５] Ｒｅｎ Ｆꎬ Ｆａｎ Ｘ Ｄꎬ Ｄｏｎｇ Ｙ Ｆꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ
Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ Ａ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ
Ｂｒｅｅｄｉｎｇ (分子植物育种)ꎬ ２０１２ꎬ １０(５): ５６８－５７４.
责任编辑:李晖
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