全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４６(１): １３５￣１３９(２０１６)
收稿日期: ２０１４￣１２￣２０ꎻ 修回日期: ２０１５￣０８￣１４
基金项目: 国家林业公益性行业科研专项(２０１３０４４０２)
通讯作者: 刘君昂ꎬ 教授ꎬ 主要从事森林健康经营ꎻ Ｔｅｌ: １３８７５８８９５７７ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｋｊｃ９６２０＠１６３.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１６.０１.０１７
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研究简报
降香黄檀黑痣病菌的快速分子检测
刘倩丽ꎬ周国英ꎬ李 河ꎬ董文统ꎬ刘成锋ꎬ刘君昂∗
(中南林业科技大学ꎬ经济林培育与保护教育部重点实验室ꎬ长沙 ４１０００４)
Ｒａｐｉｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａ ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａ ｉｎ Ｄａｌｂｅｒｇｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ 　 ＬＩＵ
Ｑｉａｎ￣ｌｉꎬ ＺＨＯＵ Ｇｕｏ￣ｙｉｎｇꎬ Ｌｉ Ｈｅꎬ ＤＯＮＧ Ｗｅｎ￣ｔｏｎｇꎬ ＬＩＵ Ｃｈｅｎｇ￣ｆｅｎｇꎬ ＬＩＵ Ｊｕｎ￣ａｎｇ　 (Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ
Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｎｏｎ￣ｔｉｍｂｅｒ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｆｏｒｅｓｔ Ｓｉｌｖｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ﹠ Ｔｅｃｈｎｏ￣
ｌｏｇｙꎬ Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０００４ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔａｒ ｓｐｏｔ ｏｆ Ｄａｌｂｅｒｇｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａꎬ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａ ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａꎬ ｉｓ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｄｉｓｅａｓｅꎬ ａｎｄ ｓｅ￣
ｒｉｏｕｓｌｙ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ. Ｈｅｒｅ ｗｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ａ ｓｐｅｃｉｅｓ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ
ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ. ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａꎬ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ ( ＩＴＳ) ｓｅ￣
ｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐ. ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａ ａｎｄ ａｎｏｔｈｅｒ Ｐ. ｓｐｐ.ꎬ ａｎ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｕｓꎬ ｆｒｏｍ ｗｈｉｃｈ ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｓｐｅｃｉｅｓ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｐｒｉｍｅｒｓ Ｐ１ / Ｐ２(Ｐ１:５￣ ＣＧＡＧＧＴＣＡＧＡＡＴＣＡＡＡＣＧ￣３ꎬ Ｐ２:５￣ ＴＧＡＡＧＡＡＣＧＣＡＧＣＧＡＡＡＴ￣３)ꎬ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ.
Ｐ１ / Ｐ２ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｏｎｌｙ ａ ｕｎｉｑｕｅ ２７３ ｂｐ ｂａｎｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ Ｐ. ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａ. Ａ Ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲ ｐｒｏｃｅ￣
ｄｕｒｅ ｕｓｉｎｇ ＩＴＳ４ / ＩＴＳ５ ａｓ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ￣ｒｏｕｎｄ ｐｒｉｍｅｒｓꎬ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ Ｐ１ / Ｐ２ ｐｒｉｍｅｒｓꎬ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ
１０ ０００ ｆｏｌｄ ｔｏ １００ ａｇ. Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｆａｓｔ ＤＮＡ￣ｋｉｔ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓꎬ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｂｙ Ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅｄ ｗｉｔｈｉｎ １ ｄａｙ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＰＣＲ￣ｂａｓｅｄ
ｍｅｔｈｏｄｓ ｈｅｒｅ ｃｏｕｌｄ ｓｉｍｐｌｉｆｙ ｂｏｔｈ ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｄａｌｂｅｒｇｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａꎻ Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａ ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａꎻ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎꎻ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲꎻ Ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲ
文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１６)０１￣０１３５￣０５
　 　 黄檀黑痣菌(Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａ ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａ)能引
起降香黄檀黑痣病ꎬ该病菌在世界分布十分广泛ꎬ
且寄主植物种类繁多ꎬ除了降香黄檀以外ꎬ还可侵
染大果紫檀、檀香紫檀等多种紫檀属植物ꎮ 该菌所
致病害会在寄主表面形成黑色凸起的盾片ꎬ严重影
响寄主光合作用ꎬ致使其提前落叶[１]ꎮ 通过对黄
檀黑痣菌进行早期检测ꎬ可以及时采取防治措施ꎬ
控制病害的进一步发展ꎮ 而黄檀黑痣菌是活体营
养真菌ꎬ不能离体培养ꎬ使用常规的病害诊断技术
难以准确快速鉴定该病原菌ꎮ 因此ꎬ建立一种快
速、灵敏、准确的黄檀黑痣菌分子检测技术具有重
要的实际意义ꎮ
　 　 随着分子生物学技术的发展ꎬＰＣＲ 技术在灵
敏度、检出率及专一性方面均有了很大的提高ꎬ且
具有不需要进行病原菌分离培养等特点[２]ꎮ 本文
分析比较了黄檀黑痣菌和其他黑痣菌的 ＩＴＳ序列ꎬ
旨在通过设计检测黄檀黑痣菌的特异性引物ꎬ结合
ＰＣＲ技术ꎬ建立一套快速、灵敏、准确的黄檀黑痣
菌分子检测技术ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 供试样本及菌株
　 　 供试样本:于 ２０１３￣２０１４ 年间采自海南省 ９ 个
市县ꎬ供试样本及菌株相关信息见表 １ꎮ

　
植物病理学报 ４６卷
Ｔａｂｌｅ １　 Ｃｏｄｅｓ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｃｌｏｎｅ ａｎｄ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ
Ｃｏｄｅ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｈｏｓｔ Ｓｏｕｒｃｅ
Ｎｏ. ｏｆ
ｉｓｏｌａｔｅｓ
ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ
ｐｒｉｍｅｒ Ｐ１ / Ｐ２
Ｂ０１ Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａ ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａ Ｄａｌｂｅｒｇｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ Ｔ. Ｃｈｅｎ. Ｌｅｄｏｎｇ １ ＋
Ｂ０２ Ｐｈｙ. ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａ Ｄ. ｏｄｏｒｉｆｅｒａ Ｔ. Ｃｈｅｎ. Ｃｈｅｎｇｍａｉ ２ ＋
Ｂ０３ Ｐｈｙ. ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａ Ｄ. ｏｄｏｒｉｆｅｒａ Ｔ. Ｃｈｅｎ. Ｔｕｎｃｈａｎｇ ２ ＋
Ｂ０４ Ｐｈｙ. ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａ Ｄ. ｏｄｏｒｉｆｅｒａ Ｔ. Ｃｈｅｎ. Ｄｏｎｇｆａｎｇ １ ＋
Ｂ０５ Ｐｈｙ. ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａ Ｄ. ｏｄｏｒｉｆｅｒａ Ｔ. Ｃｈｅｎ. Ｄｉｎｇａｎ １ ＋
Ｂ０６ Ｐｈｙ. ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａ Ｄ. ｏｄｏｒｉｆｅｒａ Ｔ. Ｃｈｅｎ. Ｗｕｚｈｉ Ｍｏｕｎｔａｉｎ １ ＋
Ｂ０７ Ｐｈｙ. ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａ Ｄ. ｏｄｏｒｉｆｅｒａ Ｔ. Ｃｈｅｎ. Ｈａｉｋｏｕ １ ＋
Ｂ０８ Ｐｈｙ. ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａ Ｄ. ｏｄｏｒｉｆｅｒａ Ｔ. Ｃｈｅｎ. Ｑｉｏｎｇｚｈｏｎｇ １ ＋
Ｂ０９ Ｐｈｙ. ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａ Ｄ. ｏｄｏｒｉｆｅｒａ Ｔ. Ｃｈｅｎ. Ｄａｎｚｈｏｕ １ ＋
Ｂ１０ Ｐｈｙ. ｇｒａｍｉｎｉｓ Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｃｅｎｔｒａｓｉａｔｉｃｕｍ Ｔｚｖｅｌ. Ｃｈｅｎｇｍａｉ ２ －
Ｂ１１ Ｐｈｙ. ｇｒａｍｉｎｉｓ Ｒｏｅｇｎｅｒｉａ Ｃ. Ｋｏｃｈ Ｄｉｎｇａｎ ２ －
Ｂ１２ Ｐｈｙ. ｇｒａｍｉｎｉｓ Ｐｅｎ. ａｌｏｐｅｃｕｒｏｉｄｅｓ Ｔｕｎｃｈａｎｇ ２ －
Ｂ１３ Ｐｈｙ. ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｄｉｓ ｈａｒａ. Ｐｈｙ. ｖｉｒｉｄｉｓ Ｔｕｎｃｈａｎｇ ２ －
Ｂ１４ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ Ｄ. ｏｄｏｒｉｆｅｒａ Ｔ. Ｃｈｅｎ. Ｃｈｅｎｇｍａｉ ２ －
Ｂ１５ Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ ｓｐ. Ｄ. ｏｄｏｒｉｆｅｒａ Ｔ. Ｃｈｅｎ. Ｃｈｅｎｇｍａｉ １ －
Ｂ１６ Ｅｎｄｏｍｅｌａｎｃｏｎｉｏｐｓｉｓ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃａ Ｄ. ｏｄｏｒｉｆｅｒａ Ｔ. Ｃｈｅｎ. Ｃｈｅｎｇｍａｉ １ －
Ｂ１７ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ Ｄ. ｏｄｏｒｉｆｅｒａ Ｔ. Ｃｈｅｎ. Ｃｈｅｎｇｍａｉ １ －
Ｂ１８ Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ ｓｐｈａｅｒｉｃａ Ｐｔｅｒｏｃａｒｐｕｓ ｍａｃａｒｏｃａｒｐｕｓ Ｋｕｒｚ Ｃｈｅｎｇｍａｉ １ －
Ｂ１９ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｂｏｎｉｎｅｎｓｅ Ｐｈｙ. ｍａｃａｒｏｃａｒｐｕｓ Ｋｕｒｚ Ｃｈｅｎｇｍａｉ １ －
Ｂ２０ Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ Ｐｈｙ. ｍａｃａｒｏｃａｒｐｕｓ Ｋｕｒｚ Ｃｈｅｎｇｍａｉ １ －
Ｂ２１ Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ ｓｃｉｒｐｉｎａ Ｐｈｙ. ｍａｃａｒｏｃａｒｐｕｓ Ｋｕｒｚ Ｃｈｅｎｇｍａｉ １ －
Ｂ２２ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ Ｐｈｙ. ｍａｃａｒｏｃａｒｐｕｓ Ｋｕｒｚ Ｃｈｅｎｇｍａｉ １ －
　 “＋” : ２７３ ｂｐ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ｐｒｉｍｅｒ Ｐ１ / Ｐ２ꎻ　 “－” : Ｎｏ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ.
１.２　 方法
１.２.１　 基因组 ＤＮＡ 提取　 ＤＮＡ 提取参照 Ｄｅｎｉｓｅ
等方法[３]ꎮ
１.２.２　 ＰＣＲ 扩增 　 选用真菌通用引物 ＩＴＳ４ / ＩＴＳ５
( ＩＴＳ４:５￣ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ￣３ꎬ ＩＴＳ５:５￣
ＧＧＡ ＡＧＧＴＡＡ ＡＡＧ ＴＣＡ ＡＧＧ￣３)扩增 ＩＴＳ 基
因[４]ꎮ ＰＣＲ 反应体系(２５ μＬ):模板 １ μＬꎬ引物
ＩＴＳ４ / ＩＴＳ５ 各 １ μＬꎬ２ ×ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ １２. ５ μＬꎬ
ｄｄＨ２Ｏ ９.５ μＬꎮ ＰＣＲ反应程序:９４℃预变性 ４ ｍｉｎꎻ
９４℃变性 ３０ ｓꎬ５５℃退火 ３０ ｓꎬ７２℃延伸 １ ｍｉｎꎬ３５个
循环ꎻ最后 ７２℃延伸 １０ ｍｉｎꎮ 反应结束后取以上扩
增产物 ４ μＬꎬ采用 １.０％琼脂糖凝胶进行电泳检测ꎬ
在凝胶成像系统的紫外光照射下拍照ꎮ
　 　 巢式 ＰＣＲ反应体系以引物 ＩＴＳ４ / ＩＴＳ５ 作为第
一轮反应引物ꎬ取 １ μＬ第一轮 ＰＣＲ反应产物作为
模板ꎬ结合黄檀黑痣菌特异性引物进行第二轮
ＰＣＲ扩增ꎬ反应程序及检测方法同上ꎮ
１.２.３　 特异性引物的设计　 利用测序得到的黄檀
黑痣菌(Ｐ. ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａ)序列及 ＧｅｎＢａｎｋ 中已登
录的黑痣属其他种的 ＩＴＳ 序列ꎬ使用 ＢｉｏＥｄｉｔ 软件
比较其之间的差异ꎬ利用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５ 设计出
一对特异性引物 Ｐ１ / Ｐ２ꎮ 本文进行 ＩＴＳ 序列比对
时使用了 Ｐ. ｇｒａｍｉｎｉｓ多个菌株的 ＩＴＳ 序列进行比
较分析(图 １)ꎬ并将设计的引物在 ＧｅｎＢａｎｋ 中进
行 ＢＬＡＳＴ分析验证其特异性ꎮ
６３１

　
　 １期 刘倩丽ꎬ等:降香黄檀黑痣病菌的快速分子检测
２　 结果与分析
２.１　 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ区扩增结果
　 　 选用引物 ＩＴＳ４ / ＩＴＳ５进行 ＩＴＳ区的扩增ꎬ结果
表明该对引物可以从 １８ 个供试(样本 Ｂ０１ ~ Ｂ０９
各 ２份ꎬ见表 １)的黄檀黑痣菌 ＤＮＡ中扩增出一条
长约 ５００ ｂｐ的条带ꎮ
　 　 将条带进行切胶回收后送至公司测序ꎬ将得
到的１８条测序结果进行同源性比较ꎬ发现其碱基
序列完全一致ꎬ大小为 ５２５ ｂｐꎬ且在序列中能找到
扩增时所用的引物ꎬ则可证明该序列属于目的序
列ꎮ 该 序 列 已 经 上 传 至 ＧｅｎＢａｎｋꎬ 获 登 录
号 ＫＭ８７５７３０ꎮ
２.２　 引物特异性验证
　 　 为验证引物的特异性ꎬ采用特异引物 Ｐ１ / Ｐ２
对采集自海南 ９个市县的 Ｐ. ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａ、Ｐ. ｇｒａ￣
ｍｉｎｉｓ、Ｐ. ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｄｉｓ ｈａｒａ.ꎬ以及分离自降香黄
檀、大果紫檀的真菌菌株为材料进行特异性扩增ꎮ
结果表明ꎬ特异性引物仅能从供试的 １１ 个(样本
Ｂ０２、Ｂ０３各提供 ２份ꎬ样本 Ｂ０１、Ｂ０４￣Ｂ０９各提供 １
份)Ｐ. ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａ的 ＤＮＡ 中特异地扩增出一条
长约 ２５０ ｂｐ的条带ꎬ而其他 １８ 个(样本 Ｂ１０~ Ｂ１４
各提供 ２份ꎬＢ１５~Ｂ２２ 各提供 １ 份)供试 ＤＮＡ 均
无扩增条带ꎬ表明该引物具有特异性(图 ２、图 ３)ꎮ
Ｆｉｇ. １　 Ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ Ｐ１/ Ｐ２ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐａｒｔｉａｌ ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａ ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａ
Ｂ０１￣Ｂ０５: Ｐ. ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａ ꎻ Ｂ１０￣１￣Ｂ１２￣１: Ｐ. ｇｒａｍｉｎｉｓ.
Ｆｉｇ. ２　 Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ＰＣＲ￣ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓＰ１ / Ｐ２
Ｌａｎｅ Ｍ: ２ ０００ ｂｐ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １: Ｂ０１ꎻ Ｌａｎｅ ２￣３: Ｂ０２ꎻ Ｌａｎｅ ４￣５: Ｂ０３ꎻ Ｌａｎｅ ６: Ｂ０４ꎻ Ｌａｎｅ ７: Ｂ０５ꎻ
Ｌａｎｅ ８: Ｂ０６ꎻ Ｌａｎｅ ９: Ｂ０７ꎻ Ｌａｎｅ １０: Ｂ０８ꎻ Ｌａｎｅ １１: Ｂ０９ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
７３１

　
植物病理学报 ４６卷
２.３　 引物灵敏度检测
　 　 将 Ｐ. ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａ 基 因 组 ＤＮＡꎬ从 １００
ｎｇ􀅰μＬ ￣１的浓度开始ꎬ逐步按 １０ 倍数量级向下稀
释至 １０ ａｇ􀅰μＬ ￣１ꎬ从每一个浓度梯度的样品中取
１ μＬ 为模板进行常规 ＰＣＲ和巢式 ＰＣＲ扩增ꎮ 在
２５ μＬ 的反应体系中ꎬ利用引物 Ｐ１ / Ｐ２ 进行常规
ＰＣＲ扩增ꎬ可从含有 １ ｐｇ 的基因组 ＤＮＡ 中扩增
出一条长约 ２５０ ｂｐ 的条带(图 ４￣Ａ)ꎮ 而先后利
用 ＩＴＳ４ / ＩＴＳ５ 和 Ｐ１ / Ｐ２ 进行巢式 ＰＣＲꎬ可以稳定
地检测到 １００ ａｇ 的基因组 ＤＮＡꎮ 这与单独使用
特异性引物扩增相比ꎬ使检测灵敏度提高了 １０４
倍(图 ４￣Ｂ)ꎮ
Ｆｉｇ. ３　 Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ＰＣＲ￣ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ Ｐ１ / Ｐ２
Ｌａｎｅ Ｍ: ２０００ｂｐ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １: ｄｄ Ｈ２Ｏꎻ Ｌａｎｅ ２: Ｂ０２ꎻ Ｌａｎｅ ３￣４: Ｂ１０ꎻ Ｌａｎｅ ５￣６: Ｂ１１ꎻ Ｌａｎｅ ７￣８:
Ｂ１２ꎻ Ｌａｎｅ ９￣１０: Ｂ１３ꎻ Ｌａｎｅ １１￣１２: Ｂ１４ꎻ Ｌａｎｅ １３: Ｂ１５ꎻ Ｌａｎｅ １４: Ｂ１６ꎻ Ｌａｎｅ １５: Ｂ１７ꎻ
Ｌａｎｅ １６: Ｂ１８ꎻ Ｌａｎｅ １７: Ｂ１９ꎻ Ｌａｎｅ １８: Ｂ２０ꎻ Ｌａｎｅ １９: Ｂ２１ꎻ Ｌａｎｅ ２０: Ｂ２２ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
Ｆｉｇ. ４　 Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒ ａｎｄ Ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａ ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａ
Ａ: Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＣＲ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍｅｒｓ Ｐ１ / Ｐ２ ｕｓｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡꎬ Ｂ: Ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍｅｒｓ ＩＴＳ４ / ＩＴＳ５ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｆｉｒｓｔ ｒｏｕｎｄ ｏｆ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒｓ. Ｐ１ / Ｐ２ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｒｏｕｎｄ ｏｆ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ . Ｌａｎｅ Ｍ: ２ ０００ｂｐ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ
Ｌａｎｅ １: ｄｄ Ｈ２Ｏꎻ Ｌａｎｅ ２￣１２: Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ＤＮＡ ａｔ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ １００ｎｇꎬ １０ｎｇꎬ １ｎｇꎬ １００ｐｇꎬ １０ｐｇꎬ １ｐｇꎬ
１００ｆｇꎬ １０ｆｇꎬ １ｆｇꎬ １００ａｇꎬ １０ａｇ ｉｎ ２５ μＬ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ.
８３１

　
　 １期 刘倩丽ꎬ等:降香黄檀黑痣病菌的快速分子检测
２.４　 降香黄檀发病组织的病原物检测
　 　 分别采集降香黄檀叶片的发病组织及健康组
织共 ２３ 份样品ꎬ利用巢式 ＰＣＲ 进行检测ꎮ 结果
(图 ５)表明ꎬ利用巢式 ＰＣＲ 能从 １２ 个发病组织
(泳道 １３~２４)中稳定的扩增出一条约为 ２５０ ｂｐ的
特异性条带ꎬ而 １１ 个健康植物组织(泳道 ２ ~ １２)
中也有 ６个扩增出条带ꎬ说明该健康植物组织已受
到 Ｐ. ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａ 的侵染ꎬ暂未表现出明显的症
状ꎮ 对扩增出条带的泳道进行切胶回收测序ꎬ测序
结果 表 明 它 们 的 碱 基 序 列 一 致ꎬ 且 与 Ｐ.
ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａ 的序列完全相同ꎬ则可排除假阳性结
果ꎮ 该技术在降香黄檀受到 Ｐ. ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａ 侵染
未表现出明显症状之前即可将其检测出来ꎬ可用于
植物发病组织中 Ｐ. ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａ的快速分子检测ꎮ
Ｆｉｇ. ５　 Ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍｅｒｓ
ＩＴＳ４ / ＩＴＳ５ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｒｏｕｎｄ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒｓ Ｐ１ / Ｐ２ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｒｏｕｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｌａｎｅ Ｍ: ２０００ ｂｐ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １: ｄｄ Ｈ２Ｏꎻ Ｌａｎｅ ２￣１２: Ｈｅａｌｔｈｙ Ｄａｌｂｅｒｇｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ ｔｉｓｓｕｅｓꎻ
Ｌａｎｅ １３￣２４: Ｄｉｓｅａｓｅｄ Ｄ. ｏｄｏｒｉｆｅｒａ ｔｉｓｓｕｅｓ.
３　 结果与讨论
　 　 传统的植物病害检测方法大都是依靠对病原
物分离培养后形态学鉴定ꎬ但该方法耗时较长ꎬ且
不适用于病原物的早期快速鉴定[５]ꎮ 因此ꎬ传统
检测方法可能会贻误病害防治的最佳时期ꎮ
　 　 本研究直接从降香黄檀黑痣病病叶组织中提
取黄檀黑痣菌基因组 ＤＮＡꎬ通过对其 ｒＤＮＡ ＩＴＳ
区克隆后测序ꎬ所得序列与 ＧｅｎＢａｎｋ 中已登录的
黑痣属其他种的序列进行比对ꎬ根据序列差异设计
出特异性引物 Ｐ１ / Ｐ２ꎮ 结合真菌通用引物 ＩＴＳ４ /
ＩＴＳ５对降香黄檀基因组 ＤＮＡ 进行常规 ＰＣＲ 扩
增ꎬ在 ２５ μＬ的反应体系中ꎬ其检测下限达到 １ ｐｇ
Ｐ. ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａ基因组 ＤＮＡꎮ 在相同的体系条件
下ꎬ利用巢式 ＰＣＲ技术可以使检测的基因组 ＤＮＡ
下限达到 １００ ａｇꎬ使灵敏度提高了 １０４倍ꎬ从而能够
检测到处于潜伏期的黄檀黑痣菌ꎮ 本研究首次构
建出针对 Ｐ. ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａ的快速分子检测技术ꎬ该
技术易操作、耗时短、且灵敏度高ꎮ 结合简单的
ＤＮＡ提取方法ꎬ１ 个工作日就可以检测出降香黄
檀是否已经受到 Ｐ. ｄａｌｂｅｒｇｉｉｃｏｌａ的侵染ꎬ该技术可
用于由黄檀黑痣菌所致病害的早期快速分子检测ꎮ
参考文献
[１] 　 Ｌｉ Ｘ Ｌ. Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａ ｉｎ Ｃｈｉｎａ [ Ｊ] .
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｙｕｎｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ (云南大学学报 )ꎬ
２００８ꎬ ３０(Ｓ１):５￣８.
[２] 　 Ｗａｎｇ Ｙ Ｃꎬ Ｚｈａｎｇ Ｗ Ｌꎬ Ｗａｎｇ Ｙꎬ ｅｔ ａｌ. Ｒａｐｉｄ ａｎｄ
ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｏｊａｅ ｉｎ ｓｏｉｌ ａｎｄ
ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｓｏｙｂｅａｎｓ ｂｙ ｓｐｅｃｉｅｓ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ[ Ｊ] . Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２００６ꎬ ９６
(１２):１３１５￣１３２１.
[３] 　 Ｄｅｎｉｓｅ Ｗ Ｓꎬ Ｅｄｕａｒｄｏ Ｒ Ｎꎬ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｈ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｙｓ￣
ｔｅｍａｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａｌｅｓ(Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａꎬ Ｆｕｎｇｉ)
ｂａｓｅｄ ｏｎ １８Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ [ Ｊ ] .
Ｂｒａｚｉｌｉａｎ Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ ２００３ꎬ
４６(３):３１５￣３２２.
[４] 　 Ｃｈｅｎ Ｊ Ｓꎬ Ｚｈｅｎｇ Ｆ Ｃ. Ｔｈｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＴＳ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｆｕｎｇｉ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
[ Ｊ ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｈｕｉ. Ｓｃｉ.ꎬ ２００７ꎬ ３５ ( １３ ):
３７５８￣３７８６.
[５ ] 　 Ｗａｎｇ Ｈ. Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｆａｓｔ￣ｍｏｌｅｃｕｌｅ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｏｆ ｐｉｎｅ ｎｅｅｄｌｅ ｃａｓｔ [Ｄ] . Ｓｉ￣
ｃｈｕａｎ: Ｓｉｃｈｕａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ ２０１０.
责任编辑:曾晓葳
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