全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４４(５): ４７８￣４８５(２０１４)
收稿日期: ２０１３￣０３￣２２ꎻ 修回日期: ２０１４￣０５￣０２
基金项目: 湖北省重点科技攻关项目(２００６ＡＡ２０１Ｂ０６)
通讯作者: 黄俊斌ꎬ教授ꎬ主要从事植物真菌病害与分子植物病理学研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｊｕｎｂｉｎｈｕａｎｇ＠ｍａｉｌ.ｈｚａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
第一作者: 郑露ꎬ男ꎬ副教授ꎬ研究方向为植物病原真菌致病机制与比较基因组学ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｌｕｚｈｅｎｇ＠ｍａｉｌ.ｈｚａｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１４.０５.００５
大蒜白斑病菌 ＳＳ￣毒素的结构鉴定
郑 露１ꎬ 刘 伟２ꎬ 陈长水３ꎬ 姜道宏１ꎬ 黄俊斌１∗
( １华中农业大学植物科技学院ꎬ湖北省作物病害监测与安全控制重点实验室ꎬ武汉 ４３００７０ꎻ
２中国种子集团有限公司生命科学技术中心ꎬ武汉 ４３００７５ꎻ ３华中农业大学理学院ꎬ武汉 ４３００７０)
摘要:大蒜白斑病是由 Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ 引起的一种重要的大蒜病害ꎬ病菌可产生致病毒素 ＳＳ￣毒素ꎮ 本文采用薄层层析
和高效液相色谱法对该毒素进行分离纯化ꎬ结合化学鉴定、紫外可见吸收光谱、红外光谱、质谱、元素分析以及核磁共振等
方法鉴定毒素结构ꎮ 通过化学反应可初步判断该毒素是一种酚类物质ꎻ毒素在 ２１５、２６４和 ４５８ ｎｍ处有紫外可见吸收峰ꎻ在
红外光谱中可看出ꎬ毒素结构中有酚￣ＯＨ(３ ４００ ｃｍ－１)、￣ＣＨ３(２ ９４６ ｃｍ
－１、１ ４４９ ｃｍ－１、１ ３９５ ｃｍ－１)、芳香环(３ ０９２ ｃｍ－１、
１ ５９５ ｃｍ－１)、￣ＣＯ(１ ６７０ ｃｍ－１)和酮￣Ｃ＝Ｏ(１ ６４０ ｃｍ－１)存在的伸缩振动ꎻ根据电喷雾质谱和元素分析结果得到 ＳＳ－毒素的
分子式为 Ｃ１６Ｈ１６Ｏ８ꎻ进一步结合毒素的核磁共振氢谱和碳谱将 ＳＳ￣毒素鉴定为 ７￣甲氧基￣２￣甲基￣１ꎬ２ꎬ３ꎬ４￣四氢￣１ꎬ２ꎬ３ꎬ４ꎬ
５￣五羟基蒽醌ꎮ 本文是首次对 Ｓ. ｓｏｌａｎｉ致病毒素的化学结构进行鉴定ꎮ
关键词:大蒜白斑病菌ꎻ ＳＳ￣毒素ꎻ 化学结构ꎻ 鉴定
Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＳ￣ｔｏｘｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｃａｕｓｉｎｇ ｇａｒｌｉｃ
ｌｅａｆ ｂｌｉｇｈｔ ＺＨＥＮＧ Ｌｕ１ꎬ ＬＩＵ Ｗｅｉ２ꎬ ＣＨＥＮ Ｃｈａｎｇ￣ｓｈｕｉ３ꎬ ＪＩＡＮＧ Ｄａｏ￣ｈｏｎｇ１ꎬ ＨＵＡＮＧ Ｊｕｎ￣ｂｉｎ１ ( １Ｋｅｙ
Ｌａｂ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｈｕｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｗｕｈａｎ
４３００７０ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒꎬ Ｃｈｉｎａ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｅｅｄ Ｇｒｏｕｐ Ｃｏ. Ｌｔｄ.ꎬ Ｗｕｈａｎ ４３００７５ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ３Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｗｕｈａｎ ４３００７０ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｇａｒｌｉｃ ｌｅａｆ ｂｌｉｇｈｔ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｉｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｇａｒｌｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ. Ａ ｐｈｙｔｏｔｏｘｉｎꎬ
ＳＳ￣ｔｏｘｉｎ ｆｒｏｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｉｌｔｒａｔｅ ｏｆ Ｓ. ｓｏｌａｎｉ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ＴＬＣ ａｎｄ ＨＰＬＣ ｍｅｔｈｏｄｓ. ＳＳ￣ｔｏｘｉｎ
ｇａｖｅ ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｆｅｒｒｉｃ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ＵＶ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｍａｘｉｍａ ａｔ ２１５ꎬ ２６４ ａｎｄ ４５８ ｎｍꎬ ｗｈｉｃｈ ｉｎｄｉｃａ￣
ｔｅｄ ａｎ ａｒｏｍａｔｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｔｏｘｉｎ. Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｘｉｎ ｆｏｒ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐｓ
(３ ４００ ｃｍ－１)ꎬ ｍｅｔｈｙｌ ｇｒｏｕｐｓ (２ ９４６ ｃｍ－１ꎬ １ ４４９ ｃｍ－１ ａｎｄ １ ３９５ ｃｍ－１)ꎬ ａｒｏｍａｔｉｃ ｒｉｎｇｓ (３ ０９２ ｃｍ－１ ａｎｄ １ ５９５
ｃｍ－１)ꎬ ｕｎｃｈｅｌａｔｅｄ ＣＯ (１ ６７０ ｃｍ－１) ａｎｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＣＯ (１ ６４０ ｃｍ－１) ｗｅｒｅ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｗｉｔｈ ＩＲ ｓｐｅｃｔｒｕｍ. Ｔｈｅ
ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＥＳＩ￣ＭＳ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｗｉｔｈ ｅｌｅｍｅｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍｕｌａ ｏｆ ＳＳ￣ｔｏｘｉｎ ｉｓ Ｃ１６Ｈ１６Ｏ８ .
Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＳＳ￣ｔｏｘｉｎ ｗａｓ ｆｕｒｔｈｅｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ ７￣ｍｅｔｈｏｘｙ￣２￣ｍｅｔｈｙｌ￣１ꎬ２ꎬ３ꎬ４￣ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ￣１ꎬ２ꎬ３ꎬ４ꎬ５￣ｐｅｎｔａ￣
ｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｄａｔａ ｏｆ ＵＶꎬ ＩＲꎬ １Ｈ￣ＮＭＲ ａｎｄ １３Ｃ￣ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒａ. Ｔｈｉｓ ｉｓ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｐｈｙｔｏｔｏｘｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｓ. ｓｏｌａｎｉ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ ｓｏｌａｎｉꎻ ＳＳ￣ｔｏｘｉｎꎻ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎻ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
中图分类号: Ｓ４３６.３３ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０５￣０４７８￣０８
大蒜白斑病是一种重要的叶部病害ꎬ由无性孢
子类丝孢纲(Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ)茄匍柄霉(Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉ￣
ｕｍ ｓｏｌａｎｉ) 侵染所致[１]ꎮ ２００５~２００９年调查发现ꎬ
该病在湖北省当阳市 １０万亩大蒜生产基地大面积
发生ꎬ严重时病叶率可达 ９５％以上ꎬ蒜苗年均减产
２０％~７０％ꎬ甚至出现绝收ꎬ严重影响了大蒜的产量
和品质ꎮ 大蒜白斑病主要为害叶片ꎬ初期产生卵圆
形小白斑ꎬ而后中央变紫ꎬ逐渐扩大成椭圆或纺锤
５期 郑 露ꎬ等:大蒜白斑病菌 ＳＳ￣毒素的结构鉴定
形暗紫色病斑ꎬ湿度大时ꎬ病部产生黑色霉层ꎬ呈同
心轮纹状ꎬ后期病斑连片造成叶尖枯死ꎮ
迄今ꎬ已报道的匍柄霉属真菌毒素有十余种ꎬ
其中由 Ｓ. ｂｏｔｒｙｏｓｕｍ产生的毒素包括 ｓｔｅｍｐｈｙｌｔｏｘｉｎ
( Ｉ￣ＩＶ)、ｓｔｅｍｐｈｙｐｅｒｙｌｅｎｏｌ[２]、ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｎ / ａｌｔｅｒｓｏｌａｎｏｌ
Ａ[ ３]、ｓｔｅｍｐｈｙｌｏｘｉｎ( Ｉꎬ ＩＩ) [４]和 ｓｔｅｍｐｈｏｌ[５]ꎻ另外ꎬ
Ｓ. ｒａｄｉｃｉｎｕｍ可产生 ｓｔｅｍｐｈｙｌｏｎｅ / ｒａｄｉｃｉｎｉｎ[６]和 ｐｙ￣
ｒｅｎｏｐｈｏｒｉｎ[７]ꎻ而 Ｓ. ｓａｒｃｉｎａｅｆｏｒｍｅ 仅能产生 ｓｔｅｍ￣
ｐｈｏｎｅ[８]ꎮ 除以上结构已知的毒素外ꎬＳｉｎｇｈ 等[９]
还在梨褐斑病菌 Ｓ. ｖｅｓｉｃａｒｉｕｍ 的培养滤液中分离
得到两种毒素ꎬ分别命名为 ＳＶ￣ｔｏｘｉｎ Ｉ 和 ＳＶ￣ｔｏｘｉｎ
ＩＩꎮ 作者在前期研究中发现ꎬＳ. ｓｏｌａｎｉ 可产生一类
小分子的非寄主专化性毒素ꎬ采用薄层层析和高效
液相色谱法可分离纯化出 Ｓ.ｓｏｌａｎｉ 毒素的主要致病
组分 ＳＳ￣毒素ꎬ该毒素可引起大蒜叶片的白斑症状ꎬ
对大蒜根芽生长、叶片细胞超微结构及叶片质膜系
统均有破坏作用[１０~１２]ꎮ 但到目前为止ꎬ关于 Ｓ.ｓｏｌａ￣
ｎｉ产生致病毒素组分的化学结构仍未见报道ꎮ
本文通过对大蒜白斑病菌毒素主要致病组分
ＳＳ￣毒素的化学特性、红外光谱、质谱等进行测定ꎬ确
定了该毒素的化学结构ꎬ为进一步研究该毒素的功
能、探讨病原菌与寄主的互作机制等奠定了基础ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 试验材料
供试菌株为大蒜白斑病菌 ( Ｓ. ｓｏｌａｎｉ)菌株
ＤＹ￣５ꎬ由湖北省作物病害监测与安全控制重点实
验室提供ꎻ甲醇为国产分析纯或色谱纯ꎻ无水乙醇、
乙酸乙酯、石油醚、盐酸羟胺、三氯化铁、氯化亚铁、
碘、碘化钾、茚三酮等试剂均为国产分析纯ꎻ预制层
析硅胶板 ＧＦ２５４(１０ ｃｍ×２０ ｃｍ)由浙江省台州市
路桥四甲生化塑料厂生产ꎮ
１.２ ＳＳ￣毒素的分离和纯化
参照 Ｚｈｅｎｇ等[１１]的方法ꎬ分离、纯化 ＳＳ￣毒素ꎮ
将供试菌株 ＤＹ￣５转至 ＰＳＡ 平板上活化 ７ ｄꎬ在菌
落边缘打取直径为 ６ ｍｍ菌丝块ꎬ每两块菌丝块接
入一瓶 ２００ ｍＬ ＰＳＢ 液体培养基中ꎬ置 ２５℃、
１５０ ｒｐｍｍｉｎ－１振荡培养ꎮ ２１ ｄ 后用 ４ 层纱布、定
性滤纸过滤获得毒素滤液ꎮ 取 ＰＳＢ 毒素滤液ꎬ加
等体积甲醇、４℃过夜ꎬ离心取上清液ꎬ用 １ / ２ 体积
的乙酸乙酯萃取 ３次ꎬ合并乙酸乙酯相ꎬ在 ５０℃的
ＲＥ￣５２旋转蒸发仪中蒸去有机溶剂ꎬ即得粗毒素ꎮ
将粗毒素甲醇溶液点至已活化的硅胶板
ＧＦ２５４ 上ꎬ 用展开剂乙酸乙酯 /石油醚 /甲醇
(４ ∶ １ ∶ ０.３５)展开各组分ꎬ在 ２５４ ｎｍ 紫外光下将
ＳＳ￣毒素层析带(Ｒｆ ∶ ０.４)刮下[１１]ꎬ回收合并用乙
酸乙酯溶解ꎬ滤纸过滤、离心后取上清液ꎬ在 ５０℃
蒸去有机溶剂ꎮ ＴＬＣ 分离组分用色谱甲醇溶解ꎬ
经 ０.２２ μｍ孔径的微孔滤膜滤去不溶物ꎬ进一步对
ＳＳ￣毒素进行纯化制备ꎮ 制备型 ＨＰＬＣ 色谱条件
为:ＰｒｅｐＬＣ ５００Ａ 系统 (ＷａｔｅｒｓꎬＭｉｌｆｏｒｄꎬＵＳＡ)ꎬ
Ｖｙｄａｃ Ｃ１８ ( ５. ７ × ３０ ｃｍꎬ １５ ~ ２０ μｍ) 色谱柱
(ＶｙｄａｃꎬＨｅｓｐｅｒｉａꎬＵＳＡ)ꎬ以 Ｖ(甲醇) ∶ Ｖ(水) ＝
４０ ∶ ６０ 作流动相ꎬ 检测波长 ２１５ ｎｍꎬ 流速
７.５ ｍＬｍｉｎ－１ꎮ 根据分离谱图ꎬ收集主要色谱峰ꎬ
置 ５０℃蒸去有机溶剂ꎮ 所得棕红色 ＳＳ￣毒素用色
谱甲醇溶解ꎬ置 ４℃保存备用ꎮ 采用高效液相法检
测毒素的纯度ꎬＳＳ￣毒素溶液经微孔滤膜过滤后在
分析型 Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ 高效液相色谱仪上检测ꎻ
ＨＰＬＣ 色谱条件:Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ 系统 (Ａｇｉ￣
ｌｅｎｔꎬＰａｌｏ ＡｌｔｏꎬＵＳＡ)ꎬＺｏｒｂａｘ－ＸＤＢ Ｃ１８(１５０ ｍｍ
× ４.６ ｍｍꎬ５ μｍ)反向色谱柱(Ｈｅｗｌｅｔｔ －Ｐａｃｋａｒｄꎬ
Ｎｅｗｐｏｒｔꎬ ＵＳＡ)ꎬ以 Ｖ(甲醇) ∶ Ｖ(水) ＝ ４０ ∶ ６０
作流动相ꎬ检测波长 ２１５ ｎｍꎬ流速 １.０ ｍＬｍｉｎ－１ꎮ
以上分离纯化过程中ꎬ均对毒素组分进行活性跟
踪ꎻ毒素致病活性采用离体叶片针刺法测定[３]ꎬ取
大蒜品种长坂坡的三叶期叶片ꎬ经微伤处理后ꎬ将
３０ μＬ待测毒素液滴至伤口处ꎬ置 ２５℃保湿培养
３ ｄ后观察叶片症状ꎬ确定分离毒素的致病活性ꎮ
１.３ ＳＳ￣毒素的结构鉴定
１.３.１ 化学鉴定 酚类物质的检测采用常规氯化
铁试验ꎬ取 ＳＳ￣毒素的水溶液 １ ｍＬꎬ加 １％ ＦｅＣｌ３溶
液 ２滴ꎬ观察是否产生颜色反应ꎻ氨基、多肽或蛋白
质类物质通过茚三酮试验检测ꎬ取 ＳＳ￣毒素的水溶
液 １ ｍＬꎬ加入 １％茚三酮溶液 ２ 滴ꎬ加热煮沸 ５
ｍｉｎꎬ待其冷却ꎬ如出现蓝紫色可能有氨基化合物
存在ꎻ生物碱的检测采用碘￣碘化钾试验ꎬ取 １ ｇ 碘
及 １０ ｇ碘化钾溶于 ５０ ｍＬ 水中ꎬ加 ２ ｍＬ 醋酸ꎬ再
用水稀释至 １００ ｍＬꎬ取 ｌ ｍＬ稀酸溶液ꎬ加入 ＳＳ￣毒
素溶液 ２滴ꎬ如产生棕色或褐色沉淀为正性反应ꎬ
说明存在生物碱ꎻ酯类物质的检测采用羟肟酸试
验ꎬ取 ０.５ ｍｏｌＬ－１盐酸羟胺乙醇溶液 １ ｍＬꎬ加入
９７４
植物病理学报 ４４卷
６ ｍｏｌＬ－１ ＮａＯＨ溶液 ２００ ｍＬꎬ滴加 ２ 滴 ＳＳ￣毒素
溶液ꎬ煮沸后加入 １ ｍｏｌＬ－１的盐酸 ２ ｍＬꎬ如有混
浊ꎬ滴加 ２ ｍＬ乙醇使溶液澄清ꎬ然后加入 １ 滴 ５％
ＦｅＣｌ２溶液ꎬ如褪色加 ＦｅＣｌ２溶液至颜色不变为止ꎬ
如出现洋红色为正性反应ꎬ说明存在酯类结构ꎮ
１.３.２ 紫外￣可见和红外吸收光谱 ＳＳ￣毒素溶解
于色谱甲醇中ꎬ在 Ｍａｐａｄａ ＵＶ￣１６００ＰＣ 紫外￣可见
分光光度计上进行全波长扫描ꎬ测定紫外、可见区
的最大吸收波长ꎮ 以甲醇为空白对照ꎬ比色皿为石
英比色皿ꎮ
红外光谱测定采用 ＫＢｒ压片法ꎬ取少量 ＳＳ￣毒素
经 Ｐ２Ｏ５干燥后ꎬ与 ＫＢｒ粉末混合均匀ꎬ用压片机压成
薄片ꎬ在 Ｎｉｃｏｌｅｔ ５７００ ＦＴＩＲ傅立叶变换红外光谱分析
仪上测定其红外吸收光谱ꎮ 根据红外吸收峰的位置、
强度和峰形ꎬ推断毒素结构中可能存在的官能团ꎮ
１.３.３ 电喷雾质谱和元素分析 在 ＡＰＩ ２０００ 三重
四极杆液质联用仪上以注射泵直接进样ꎬ以 ＥＳＩ 法
测定ꎮ 测定 ＳＳ￣毒素在正离子模式下的质谱图ꎮ
电喷雾离子源ꎬ喷雾电压为 ４１５ ｋＶꎬ毛细管温度为
１８０℃ꎬ注射泵进样速度为 ３ μＬｍｉｎ－１ꎮ
在 Ｅｌｅｍｅｎｔａｒ Ｖａｒｉｏ ＥＬ ＩＩＩ 元素分析仪上测定
ＳＳ￣毒素的 Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｎ元素组成ꎮ 检测器为特殊热
敏热导检测器(ＴＣＤ)ꎮ 样品重复测定 ２次ꎮ
１.３.４ 核磁共振氢谱和碳谱 将 ＳＳ￣毒素溶解于
氘代 ＤＭＳＯ中ꎬ在 Ｂｒｕｋｅｒ－６００ ＭＨｚ超导核磁共振
仪上进行 ＮＭＲ 分析 ( ＴＭＳ 为内标)ꎬ测定其
１Ｈ￣ＮＭＲ和１３Ｃ￣ＮＭＲꎮ
２ 结果与分析
２.１ ＳＳ￣毒素分离和纯化
为获得足够的 ＳＳ￣毒素纯品用于其化学结构
鉴定ꎬ对 ４ ０００ ｍＬ毒素培养滤液进行分离纯化ꎬ经
ＴＬＣ分离收集层析带(Ｒｆ ∶ ０.４)所含毒素组分ꎬ在
大蒜叶片上生测后可产生典型白斑症状ꎻ用分析型
ＨＰＬＣ对该 ＴＬＣ 组分进行分析ꎬ发现物质中存在
有 ５个亚组分:Ｉ(Ｒｔ ０ ~ ３.０ ｍｉｎ)ꎬＩＩ(Ｒｔ ３.０ ~ ５.８
ｍｉｎ)ꎬＩＩＩ(Ｒｔ ５.８~７.１ ｍｉｎ)ꎬＩＶ(Ｒｔ ７.１~８.２ ｍｉｎ)和
Ｖ(Ｒｔ ８.２ ~ １２.０ ｍｉｎ) (图 １)ꎮ 制备型 ＨＰＬＣ 的色
谱峰与分析型 ＨＰＬＣ色谱峰相似ꎬ但出峰时间相对
较迟ꎻ对各亚组分进行收集ꎬ经生物活性测定ꎬ确定
亚组分 ＩＩ 为活性峰ꎮ 共收集得到 １００ ｍｇ ＳＳ￣毒
素ꎮ 致病活性测定结果表明ꎬ３ ｄ 后制备的 ５０ μｇ
ｍＬ－１ＳＳ￣毒素可致大蒜叶片产生白色病斑ꎮ 用
分析型 ＨＰＬＣ 对 ＳＳ￣毒素进行纯度鉴定ꎬ发现图谱
中仅有一个单峰出现(Ｒｔ ４.８ ｍｉｎ)(图 １)ꎬ由此可
判定 ＳＳ￣毒素纯度较高ꎮ
Ｆｉｇ. １ ＨＰＬＣ ｅｌｕｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＳＳ￣
ｔｏｘｉｎ (Ａ) ａｎｄ ｔｈｅ ｔｏｘｉｃ ｆｒａｃｔｉｏｎ (Ｂ)
ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ＴＬＣ
２.２ 化学鉴定
通过 ＦｅＣｌ３、茚三酮、Ｉ２￣ＩＫ 和羟肟酸试验的颜
色反应来判定 ＳＳ￣毒素结构中可能存在的有机官
能团ꎬ从反应结果可初步判断(表１) ꎬ该毒素是一
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ＳＳ￣ｔｏｘｉｎ
Ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ Ｒｅｓｕｌｔ
Ｐｈｅｎｏｌ ＦｅＣｌ３ ｔｅｓｔ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
Ａｍｉｄｏｇｅｎꎬ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ ｔｅｓｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ
Ａｌｋａｌｏｉｄ Ｉ２ ￣ＩＫ ｔｅｓｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ
Ｅｓｔｅｒ Ｈｙｄｒｏｘｉｍｉｃ ａｃｉｄ ｔｅｓｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ
０８４
５期 郑 露ꎬ等:大蒜白斑病菌 ＳＳ￣毒素的结构鉴定
种酚类物质ꎬ而不是酯、生物碱、多肽、蛋白质或氨
基类化合物ꎮ
２.３ 紫外￣可见和红外吸收光谱分析
将 ＳＳ￣毒素溶解于色谱甲醇中ꎬ对其进行紫外￣
可见光谱的全波长扫描ꎮ 结果表明(图 ２)ꎬ该毒素
有 ３个吸收峰ꎬ波长分别为 ２１５、２６４和 ４５８ ｎｍꎬ其
Ｆｉｇ. ２ ＵＶ/ ＶＩＳ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ＳＳ￣ｔｏｘｉｎ
中在 ２１５ ｎｍ处吸收峰最大ꎮ 由于在可见光区段有
吸收峰ꎬ可推断物质中应含有较大的共轭体系ꎮ
红外光谱分析结果表明(图 ３)ꎬＩＲυｍａｘ ｃｍ－１:
３ ５０１ꎬ３ ４００ꎬ３ ０９２ꎬ２ ９９３ꎬ２ ９４６ꎬ２ ９１３ꎬ１ ６７０ꎬ
１ ６４０ꎬ１ ５９５ꎬ１ ４７９ꎬ１ ４４９ꎬ１ ３９５ꎬ１ ３０１ꎻ其中在
３ ４００ ｃｍ－１处有酚￣ＯＨ存在的伸缩振动ꎬ在 ２ ９４６、
１ ４４９ 和 １ ３９５ ｃｍ－１处有￣ＣＨ３的伸缩振动ꎬ在 ３ ０９２
ｃｍ－１处的 γＣＨ和 １ ５９５ ｃｍ－１强峰证明有苯环骨架
振动ꎬ在 １ ６７０ ｃｍ－１处显示有￣ＣＯ 的伸缩振动ꎬ
１ ６４０ ｃｍ－１处有酮￣Ｃ＝Ｏ伸缩振动ꎻ另外ꎬ在红外光
谱中未发现有 Ｃ≡Ｃ(２ １００~２ ２７０ ｃｍ－１)、Ｃ＝Ｃ＝Ｃ
(１ ９００~２ ０００ ｃｍ－１)及羧￣ＯＨ(２ ５００~３ ６００ ｃｍ－１)
基团的存在ꎮ
２.４ 电喷雾质谱及元素分析
ＥＳＩ－ＭＳ正离子源谱(图 ４)给出 ｍ / ｚ ３６０ [Ｍ
＋Ｎａ＋Ｈ] ＋、３５９ [Ｍ＋Ｎａ] ＋离子峰ꎬ可确定 ＳＳ￣毒素
的分子量为 ３３６ꎮ 根据元素分析结果(表 ２)ꎬ计算
得到 Ｃ、Ｈ、Ｏ元素组成比例为 ２ ∶ ２ ∶ １ꎮ 结合质谱
及元素分析数据可将 ＳＳ￣毒素的分子式确定为
Ｃ１６Ｈ１６Ｏ８ꎬ不饱和度(Ω) 为 ９ꎮ
Ｆｉｇ. ３ Ｉｎｆｒａｒｅｄ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ＳＳ￣ｔｏｘｉｎ
１８４
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. ４ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ＳＳ￣ｔｏｘｉｎ (Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｏｎ ｍｏｄｅ)
Ｔａｂｌｅ ２ Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｄａｔａ ｏｆ ＳＳ￣ｔｏｘｉｎ
Ｒｅｐｅａｔ
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅｌｅｍｅｎｔ / ％
Ｃ Ｈ Ｏ Ｎ
１ ５４.３７０ ５.１４８ ４０.５８２ ０
２ ５４.２３０ ５.２０６ ４０.７６４ ０
Ａｖｅｒａｇｅ ５４.３００ ５.１７７ ４０.６７３ ０
２.５ 核磁共振氢谱和碳谱
从１Ｈ￣ＮＭＲ的信号可知(图 ５Ａ)ꎬＳＳ￣毒素分子
中含有 １个独立的￣ＣＨ３(δ:１.３４)ꎬ１ 个￣Ｏ￣ＣＨ３结构
(δ:３.９０)ꎬ３ 个烷烃上的￣ＣＨ￣(δ:３.６７ꎬ４.２７ꎬ４.７１)
及 ２ 个苯环上的￣ＣＨ￣( δ: ６. ７６ꎬ ６. ８０ )ꎻ 另外ꎬ
１３Ｃ￣ＮＭＲ图谱显示(图 ５Ｂ)ꎬ化合物包括 １４个不饱
和碳信号:δ６９. ０、７４. １、７３. ５、６９. ５、１０３. ６、１６４. ８、
１０３.４、１６５. １、１８９. ４、１８４. ４、１４２. ８、１４２. ６、１０９. ９ 和
１３０.６ꎻ２个饱和碳信号:δ２１.１ 和 ５５.８ꎮ 这些信号
与 ７￣甲氧基￣２￣甲基￣１ꎬ２ꎬ３ꎬ４￣四氢￣１ꎬ２ꎬ３ꎬ４ꎬ５￣五羟
基蒽醌(７￣ｍｅｔｈｏｘｙ￣２￣ｍｅｔｈｙｌ￣１ꎬ２ꎬ３ꎬ４￣ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ￣１ꎬ
２ꎬ３ꎬ４ꎬ５￣ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅ)即 ａｌｔｅｒｓｏｌａｎｏｌ
Ａ的１Ｈ￣ＮＭＲ 和１３Ｃ￣ＮＭＲ 信号基本一致(表 ３ꎬ表
４)ꎮ
Ｔａｂｌｅ ３ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｎ １Ｈ￣ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｄａｔａ ｂｅｔｗｅｅｎ ＳＳ￣ｔｏｘｉｎ ａｎｄ ａｌｔｅｒｓｏｌａｎｏｌ Ａ
Ｐｏｓｉｔｉｏｎ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｈｉｆｔ ｏｆ １Ｈ / δ
ＳＳ￣ｔｏｘｉｎ Ａｌｔｅｒｓｏｌａｎｏｌ Ａ
Ｈ￣１ ４.７１ ４.４８
Ｈ￣２ ３.６７ ３.６４
Ｈ￣４ ４.２７ ４.３２
Ｈ￣５ ６.８０ ７.０２
Ｈ￣７ ６.７６ ６.８３
Ｍｅ￣３ １.３４ １.２４
ＯＭｅ￣６ ３.９０ ３.９１
Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｈｉｆｔ ｏｆ １Ｈ ｏｆ ａｌｔｅｒｓｏｌａｎｏｌ Ａ ｗａｓ ｃｉｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｏｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ.[１３] .
２８４
５期 郑 露ꎬ等:大蒜白斑病菌 ＳＳ￣毒素的结构鉴定
Ｔａｂｌｅ ４ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｎ １３Ｃ￣ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｄａｔａ ｂｅｔｗｅｅｎ ＳＳ￣ｔｏｘｉｎ ａｎｄ ａｌｔｅｒｓｏｌａｎｏｌ Ａ
Ｐｏｓｉｔｉｏｎ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｈｉｆｔ ｏｆ １３Ｃ / δ
ＳＳ￣ｔｏｘｉｎ Ａｌｔｅｒｓｏｌａｎｏｌ Ａ
Ｃ￣１ ６９.０ ６８.３
Ｃ￣２ ７４.１ ７３.６
Ｃ￣３ ７３.５ ７２.７
Ｃ￣４ ６９.５ ６８.３
Ｃ￣５ １０３.６ １０６.４
Ｃ￣６ １６４.８ １６２.９
Ｃ￣７ １０３.４ １０５.６
Ｃ￣８ １６５.１ １６５.１
Ｃ￣９ １８９.４ １８８.１
Ｃ￣１０ １８４.４ １８３.３
Ｃ￣１ａ １４２.８ １４４.２
Ｃ￣４ａ １４２.６ １４１.８
Ｃ￣９ａ １０９.９ １０９.２
Ｃ￣１０ａ １３０.６ １３２.９
Ｍｅ￣３ ２１.１ ２２.２
ＭｅＯ￣６ ５５.８ ５６.１
Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｈｉｆｔ ｏｆ １ ３Ｃ ｏｆ ａｌｔｅｒｓｏｌａｎｏｌ Ａ ｗａｓ ｃｉｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｏｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ.[１３] .
综合分析上述化学鉴定、紫外可见吸收光谱、
红外光谱、质谱、元素分析以及核磁共振氢和碳谱
试验数据ꎬ确定大蒜白斑病菌 ＳＳ￣毒素的化学结构
与文献报道的 ａｌｔｅｒｓｏｌａｎｏｌ Ａ 结构相同ꎬ化学结构
式如图 ６所示ꎮ
３ 结论与讨论
植物病原真菌毒素的分离纯化和结构鉴定一
直是毒素研究的难点ꎮ 目前ꎬ已发现的真菌毒素包
括多糖、酚、肽和杂环等多种类型的化合物[１４]ꎮ 然
而ꎬ有关 Ｓ. ｓｏｌａｎｉ 产生毒素的化学结构尚未见报
道ꎮ 作者结合 ＴＬＣ 和 ＨＰＬＣ 法对 Ｓ.ｓｏｌａｎｉ 毒素进
行分离、纯化ꎬ使毒素组分逐个分离ꎬ且在 ＨＰＬＣ纯
化时只出现了 ５个亚组分峰ꎬ所得峰图较为简单便
于毒素纯化ꎻ但由于其他组分产率较低ꎬ本文仅对
毒素的主要致病组分 ＳＳ￣毒素进行了鉴定ꎮ
在结构鉴定过程中ꎬ作者前期采用电子轰击电
离源(ＥＩ)质谱但未得到 ＳＳ￣毒素的分子离子峰ꎬ这
说明该毒素可能是一类非挥发和难挥发的物质ꎻ因
而进一步用电喷雾离子源质谱进行分析ꎬ发现使用
这种“软电离”质谱技术ꎬ可在谱图中直接找到待
测物质的分子离子峰ꎮ 由 ＥＳＩ￣ＭＳ 谱图得出该毒
素的分子量为 ３３６ꎬ结合元素分析结果ꎬ确定 ＳＳ￣毒
素的分子式为 Ｃ１６Ｈ１６Ｏ８ꎬ进一步比较紫外光谱、红
外光谱及核磁共振谱ꎬ查找相关文献发现该毒素与
ａｌｔｅｒｓｏｌａｎｏｌ Ａ ( ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｎ) 波谱结构一致ꎬ属于
ａｌｔｅｒｓｏｌａｎｏｌｓ类化合物ꎮ
据文献报道ꎬ仅 Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ、 Ａ. ｐｏｒｒｉ、
Ｓ.ｂｏｔｒｙｏｓｕｍ、 Ｄａｃｔｙｌａｒｉａ ｌｕｔｅａ 和 Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ ｊｕｎｉ￣
ｐｅｒｉｖｏｒａ五种植物病原真菌可产生 ａｌｔｅｒｓｏｌａｎｏｌ 类
代谢产物[３ꎬ１５~１７]ꎮ 这类化合物为蒽醌的衍生物ꎬ除
对植物有毒害作用外[１８]ꎬ还对原生动物和细菌有
一定的抗生作用[１９ꎬ２０]ꎬ另外ꎬａｌｔｅｒｓｏｌａｎｏｌ 类毒素可
引起人体细胞的癌变[２１ꎬ２２]ꎬ影响 ＤＮＡ、ＲＮＡ 及蛋
白质的合成[２３ꎬ ２４]ꎮ 因此ꎬＳＳ￣毒素不仅是大蒜白斑
病重要的致病因子ꎬ而且对大蒜产品食用安全造成
严重威胁ꎮ
本文是首次对 Ｓ.ｓｏｌａｎｉ主要毒素组分的化学结
３８４
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. ５ １Ｈ￣ＮＭＲ (Ａ) ａｎｄ １３Ｃ￣ＮＭＲ (Ｂ) ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ＳＳ￣ｔｏｘｉｎ (ＤＭＳＯ￣ｄ６)
Ｆｉｇ. ６ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＳＳ￣ｔｏｘｉｎ
构进行系统报道ꎬ并发现 Ｓ. ｓｏｌａｎｉ 和 Ｓ. ｂｏｔｒｙｏｓｕｍ
产生的主要致病毒素相同ꎬ这有利于深入了解匍柄
霉属真菌的致病机理ꎻ同时在次生代谢水平上为探
讨真菌间的进化关系提供了思路ꎮ
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[２４] Ｈａｒａｇｕｃｈｉ Ｈꎬ Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ Ｍꎬ Ｙａｎｏ Ｙꎬ ｅｔ ａｌ. Ｍｏｄｅ ｏｆ
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责任编辑:李晖
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