全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$云南省应用基础研究计划"
!"##23"#0
#
作者简介$马璐琳"
#0*)&
#!男!博士!副研究员!主要从事观赏植物分子生物学研究
4(56-7
$
56787-/
!
.9:8+;95
"
通信作者$王继华!博士!研究员!主要从事观赏植物病理学研究
4(56-7
$
<6/
=,
:")")
!
.9:8+;95
中国桔梗
1
2
3$4%45
基因的克隆及表达分析
马璐琳!贾文杰!段
!
青!王祥宁!蒋亚莲!郭
!
燕!李进昆!王继华"
"云南省农业科学院 花卉研究所!云南省花卉育种重点实验室!云南省花卉工程技术研究中心!国家观赏园艺工程技术研究中
心!昆明
)"!")
#
摘
!
要$利用
>?(@A>
结合
>3A4
技术!从中国桔梗"
!"#$
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*
+#)(,
-
"+./
#花朵中分离克隆了
#
个类黄酮
(%B
!
)B(
羟基化酶"
C76D9/9-E(%B
!
)B(:
F
EG9H
F
76.I
!
2%B)BJ
#基因的全长
;KL3
序列!命名为
!
*
0%1)12
"
MI/N6/O
登录号
PQ$"%##
#
!
*
0%1)12
基因全长
#*1*R
S
!包含
#
个编码
)%!
个氨基酸长为
#)00R
S
的开放阅读框蛋白序列比
对显示!
!
*
0%1)12
基因蛋白与其他物种的
2%B)BJ
蛋白有很高的相似性!包含有
AT@
基序(
"
螺旋区和血红素结
合区等保守性序列!以及一段类似于风铃草
2%B)BJ
蛋白的
0
个氨基酸的特殊区半定量
>?(@A>
结果显示!
!
*
0%1)12
的表达量随着花朵发育和花色素的出现而呈递增趋势!在花发育第四阶段的蓝色花蕾中达到最高!而在
叶中不表达研究推测!
!
*
0%1)12
基因可能在中国桔梗蓝色花色素的生化合成途径中起重要作用
关键词$中国桔梗&类黄酮
(%B
!
)B(
羟基化酶基因&基因克隆&基因表达分析
中图分类号$
Q*1)
&
Q*1
文献标志码$
3
&"()*(!+,
-
.)//#"(0(*
1
/#/"21
2
3$4%45
3)()#(1*$#
6
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2
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7
*&(89
U3V87-/
!
PW3 XI/
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X3LMZ-/
=
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PW3LMT67-6/
!
MY[T6/
!
VWP-/O8/
!
X3LMP-:86
"
"
279I.I6G;:W/.\-\8\I
!
T8//6/3;6EI5
F
9C3
=
G-;87\8G67];-I/;I.
!
T8//6/279=
I^
F
V6R+
!
279=
-/IIG-/
=
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>I.I6G;:AI/\GI9CT8//6/
!
L6\-9/674/
=
-/IIG-/
=
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!
8^/5-/
=
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#
04/5.*65
$
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F
!
6/I!
)B(:
F
EG9H
F
76.I
"
2%B)BJ
#
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!
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*
0%1)12
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/85RIG-/MI/N6/O
$
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#
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*
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-
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F
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SS
G96;:I.+?:IC877I/
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_
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S
!
<-\:6/[>29C
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S
I/;9EIE)%!65-/96;-E.+U87\-
S
7I.I
_
8I/;I67-
=
/5I/\.:9=
2%B)BJ<6.:-
=
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F
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76G<-\:2%B)BJ9C9\:IG
S
76/\.
!
6/E;9/\6-/IE.IDIG67O/9=
)
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*
59\-C
!
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!
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6/E6.
S
I;-67.I
_
8I/;I<-\:065-/96;-E.7-OIE\:I3#4
5
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_
86/\-(
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F
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GI..-9/7IDI79C\:I!
*
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!
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S
5I/\9C!7
*
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-
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I6G6/;I9C6/\:9;
F
6/-/.-/C79!
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F
-/;GI6.IE
!
6/E
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S
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\:6\\:I!
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=
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76
F
6/-5
S
9G\6/\G97I-/R78I6/\:9;
F
6/-E-/R-9.
F
/\:I\-;
S
6\:<6
F
9C!7
*
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-
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1
8".!/
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*
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-
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&
C76D9/9-E(%B
!
)B(:
F
EG9H
F
76.I
&
=
I/I;79/-/
=
&
=
I/IIH
S
GI..-9/6/67
F
.-.
!!
花色是观赏植物最重要的观赏特征之一!但自
然界中普遍缺少蓝色花系的花!如世界四大鲜切花
都缺少蓝色花色品种!因此培育蓝色花卉品种一直
是花卉育种中花色研究和改良的热点之一
花瓣表皮细胞液泡中飞燕草色素的存在与否是
判断蓝色花出现的一个主要指标+#(!,!类黄酮
(%B
!
)B(
羟基化酶"
C76D6/9/I(%B
!
)B(:
F
EG9H
F
76.I
!
2%B)BJ
#是
飞燕草色素合成过程中的关键酶!被称为)蓝色基
因*+%($,月季(康乃馨(菊花(百合等很多花卉都缺
少蓝色花色系!主要原因就是不含或者仅含很少量
的
2%B)BJ
通过基因工程导入外源
0%1)12
基因
从而提高飞燕草色素及其衍生物在花瓣中的含量!
为一些观赏植物产生新异的蓝色花提供了可能!因
此
0%1)12
基因的分离及其调控机理的研究成为蓝
色花分子育种的研究重点之一近年来世界各国的
研究者已从多种植物中分离到了
0%1)12
基因 !如
矮牵牛+),(龙胆+,(蔓长春花+*,(瓜叶菊+1,(马鞭
草+0,(蝴蝶兰+#",(万代兰+##,(非洲紫罗兰+#!,(乌
头+#%,(淫羊藿+#$,等!其中有的
0%1)12
基因已被应
用于蓝色花色花卉品种的分子育种+#)(#,!如通过转
基因技术育成的蓝色康乃馨(蓝色月季等+#*,
中国桔梗"
!"#$
%
&()
*
+#)(,
-
"+./
#为桔梗科
桔梗属多年生草本植物!别名包袱花(铃铛花(僧帽
花!原产中国!广布华南至东北中国桔梗除做药用
和食用外!其蓝紫色的冠帽形花朵!清幽淡雅!别具
情趣!也是很好的园林观赏植物+#1,
本研究以云南广泛分布的野生中国桔梗为材
料!从其花朵中分离到一个
#
个
0%1)12
基因全长
;KL3
序列!并对该基因在花朵不同发育时期及叶(
花不同组织部位的表达模式进行了分析!为进一步
研究利用
0%1)12
基因奠定一定研究基础
#
!
材料和方法
9+9
!
植物材料
野生中国桔梗由云南省农业科学院花卉研究所
于云南野外采集并保存!种植于花卉研究所实验基
地于盛花期分别采摘
)
个不同发育时期的花朵
"
#+
没有蓝色色素的花蕾&
!+
显示少量蓝色的花蕾&
%+
显示一半蓝色的花雷&
$+
完全蓝色的花蕾&
)+
刚开
放的蓝色花#"图
)
!
3
#及叶部组织!液氮中速冻后置
于
&1"`
冰箱保存备用
9+:
!
方
!
法
9;:;9
!
1
2
3$4%45
基因的克隆
!
植物组织总
>L3
的提取按照
?G-a97
试剂"
W/D-\G9
=
I/
#说明书操作完
成
;KL3
第一链的合成按照
3Ub
反转录酶
"
?6^ 6>6
#说明书操作完成根据
MI/N6/O
中已公
布的其他植物
0%1)12
基因的氨基酸保守序列设计
简并引物
2J(2
(
2J(2#
和
2J(>
"表
#
#!以中国桔
梗蓝色花蕾的
;KL3
为模板克隆其
0%1)12
基因中
间同源片段
@A>
反应体系中各组分的浓度参考
9#
:
酶"
?6^ 6>6
#说明书反应条件为
0$`
预变性
%5-/
!
0$`
变性
%".
&
)"`
#
))`
退火
$).
!
*!`
延伸
#5-/
!
%%
个循环&
*!`
延伸
#"5-/

@A>
完
成后!扩增结果经
"+1c
的琼脂糖凝胶电泳!凝胶成
像系统观察拍照!按照
KL3
回收试剂盒"北京全式
金生物技术有限公司#说明书进行目的条带的回收!
按照
S
UK#1?bI;\9G
"
?6^ 6>6
#说明书进行目的条
带的连接转化
9+#)/#(?#
感受态细胞"北京全式
金生物技术有限公司#!挑选阳性克隆送交上海杰李
生物技术有限公司测序根据测序得到的
0%1)12
基因中间同源片段序列分别设计
%B(>3A4
和
)B(
>3A4
引物"表
#
#!按照
%B(287 >3A4A9GI]IbIG+!+"
"
?6^ 6>6
#和
)B(287>3A4 -^"
?6^ 6>6
#
说明书分别进行
%B(;KL3
末端扩增和
)B
端扩增
将已克隆到的中国桔梗
0%1)12
基因中间同源
片段(
%B(;KL3
末端扩增和
)B
端扩增结果进行拼
接!再根据拼接得到的核苷酸序列设计扩增完整
[>2
框的特异引物
@#(2J(2
和
@#(2J(>
"表
#
#进
行
@A>
扩增"
@A>
反应条件及体系同上#!目的条
带测序后通过
LANW
"
:\S
$%%
<<<+/;R-+/75+/-:+
=
9D
%
NV3]?
#对其序列进行比对分析!利用
KL3(
56/
软件对该基因及其他植物
0%1)12
基因的
[2>
框氨基酸进行相似性比对分析
9;:;:
!
1
2
3$4%45
基因表达分析
!
将中国桔梗花
朵
)
个不同发育时期及叶部组织的
;KL3
按一定
比例稀释后作为半定量
>?(@A>
模板!根据中国桔
梗
;&$,)
基因"
MI/N6/O
登录号
P2*1#%"%
#设计内
参引物
@(3;\-/(2
和
@(3;\-/(>
"表
#
#进行
@A>
扩
增反应条件为
0$`
预变性
%5-/
&
0$`
变性
%"
.
!
)"`
退火
$).
!
*!`
延伸
#5-/
!
!1
个循环&
*!
`
延伸
#"5-/
扩增产物经电泳检测!根据电泳结
果调整
@A>
反应
;KL3
模板量!使扩增产物亮度
一致再以调整好的各时期"或不同组织部位#的
;KL3
为模板!根据克隆获得的中国桔梗
2%B)BJ
全
长
;KL3
序列设计特异引物
@!(2J(2
和
@!(2J(>
"表
#
#进行
@A>
扩增"反应条件参照内参基因#
扩增产物经电泳检测!通过凝胶成像系统进行拍摄
并分析其表达情况
#$
#
期
!!!!!!!!!!!!!
马璐琳!等$中国桔梗
!
*
0%1)12
基因的克隆及表达分析
表
9
!
引物序列
?6R7I#
!
@G-5IG.I
_
8I/;I.
用途
KI.;G-
S
\-9/
引物名称
@G-5IG/65I
引物序列"
)B
#
%B
#
@G-5IG.I
_
8I/;I
"
)B
#
%B
#
!
*
0%1)12
保守区
!
*
0%1)12;9/.IGDIEGI
=
-9/
2J(2 A
"
3
%
?
%
A
%
M
#
A3
"
3
%
M
#
M3
"
?
%
A
#
3?MM?
"
?
%
A
%
M
#
??
"
A
%
?
#
M
2J(2# A
"
3
%
?
%
M
#
3?
"
3
%
?
%
A
%
M
#
MAAA3
"
3
%
?
%
M
#
3?
"
3
%
M
#
??
"
3
%
?
%
A
%
M
#
3
2J(> M?
"
3
%
?
%
A
%
M
#
M?
"
3
%
?
%
A
%
M
#
MA
"
3
%
?
%
A
%
M
#
M3
"
3
%
M
#
3?M
"
A
%
?
#
?3
%
?
%
A
%
M
%B(>3A4
第一轮
?:IC-G.\G98/E
@(%B98\IG 3?AMMMA3A33M33M333?M
%B>3A498\IG 3?AAM?AM??AA3A?3M?M3???
第二轮
?:I.I;9/EG98/E
@(%B-//IG M33M33?AAM3A3?3AA333
%B>3A4-//IG AMAMM3?AA?AA3A?3M?M3???A3A?3?3MM
)B(>3A4
第一轮
?:IC-G.\G98/E
@()B98\IG A??M3A3?MA??AMA??M33
)B>3A498\IG A3?MMA?3A3?MA?M3A3MAA?3
第二轮
?:I.I;9/EG98/E
@()B-//IG 3??M33A333AAMMAA3?3M
)B>3A4-//IG AMAMM3?AA3A3MAA?3A?M3?M3?A3M?AM3?M
[>2
扩增
35
S
7-C-;6\-9/9C[>2
@#(2J(2 3333A33MA?33MA?3?M
@#(2J(> A33A33AA33A?A333A3
>?(@A>
@!(2J(2 MA??3?MAMM3?M3??3A
@!(2J(> ?AA3???A??A??M?MAA
@(3;\-/(2 MAM?MM??3??A???A3A
@(3;\-/(> 3A3A?M?3A??AA???AM
!
!
结果与分析
:;9
!
1
2
3$4%45
基因全长
6<=0
序列的克隆
以中国桔梗花朵
;KL3
为模板进行
>?(@A>
扩增首先用简并引物
2J(2
和
2J(>
进行第一次
@A>
扩增!用其
@A>
产物为模板!再用
2J(2#
和
2J(>
进行第二次扩增!琼脂糖电泳检测到
*""R
S
左右的产物!测序后得到了
*!0R
S
的中国桔梗
0%1
)12
基因中间同源片段"图
#
!
3
#
通过
%B(>3A4
与
)B(>3A4
扩增!电泳检测到
大小分别约为
*""R
S
和
*)"R
S
左右的扩增产物!
与预计大小相符!测序后得到了长度分别为
0R
S
"图
#
!
N
#和
*$0R
S
"图
#
!
A
#的中国桔梗
0%1)12
基
因
%B
端和
)B
端序列
将以上克隆到的
%
段序列拼接后得到一个长度
为
#*1*R
S
的中国桔梗
0%1)12
全长
;KL3
序列
根据拼接后的
;KL3
全长序列设计包括完整
[>2
在内的引物扩增到长为
#*!%R
S
的序列"图
#
!
K
#
该序列与拼接后序列的碱基完全一致!
[>2
编码
)%!
个氨基酸!命名为
!
*
0%1)12
"
MI/N6/O
登录号
PQ$"%##
#
利 用
KL356/
软件对多个不同植物
0%1)12
图
#
!
!
*
0%1)12
基因中间序列(
>3A4
和全长
;KL3
序列扩增
U+KV!"""
&
3+#+@A>
产物!
+
空白对照&
N+#+%B(>3A4
产物! 和
%+
单引物对照!
$+
空白对照&
A+#+)B(>3A4
产物! 和
%+
单引物对照!
$+
空白对照&
K+#+
全长产物!
+
空白对照
2-
=
+#
!
35
S
7-;6\-9/9C\:I5-EE7I.I
_
8I/;I
!
>3A4
S
G9E8;\.6/EC877I/
=
\:9C!
*
0%1)12;KL3
U+KV!"""
&
3
$
#+@A>
S
G9E8;\.
&
!+N76/O;9/\G97
&
N
$
#+%B>3A4(
S
G9E8;\.
&
!
!
%+]-/
=
7I
S
G-5IG;9/\G97
&
$+N76/O;9/\G97
&
A
$
#+)B>3A4(
S
G9E8;\.
&
!
!
%+]-/
=
7I
S
G-5IG;9/\G97
&
$+N76/O;9/\G97
&
K
$
#+2%B)BJ
=
I/I
&
!+N76/O;9/\G97
!$
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
基因编码的氨基酸序列比对发现!
!
*
0%1)12
基因
具有与已知
0%1)12
基因氨基酸序列一致的保守序
列区!包括细胞色素
@$)"
"
AT@$)"
#酶系的基序
)
@@M@
*序列+,!
A
端血红素的结合区 "
JN>
#
)
2M3M>>WA3M
*序列+#0,(
"
螺旋区)
3M?K?
*高
度保守序列+!",等"图
!
#除此以外!不同植物的
2%B)BJ
蛋白序列还具有另外一些高度保守的氨基
酸区域!对这些未知区域功能的进一步研究将有助
于全面了解
0%1)12
基因在蓝色花色素代谢途径中
的作用和分子机理+1,
通过序列比对发现!中国桔梗
!
*
0%1)12
编码
的氨基酸与其他
2%B)BJ
蛋白氨基酸序列具有高度
的相似性!其中与风铃草(南非半边莲的
2%B)BJ
蛋
白相似性最高!分别为
1"c
和
*)c
"图
%
#另外!
图
!
!
@
=
2%B)BJ
与不同植物
2%B)BJ
蛋白氨基酸比对
阴影部分为完全相同的氨基酸&方框所示依次为细胞色素
@$)"
酶系"
AT@
#)
@@M@
*基序(
"
螺旋区和
A
端血红素结合区
2-
=
+!
!
35-/96;-E.I
_
8I/;I67-
=
/5I/\9C@
=
2%B)BJ6/E9\:IG2%B)BJCG95E-CCIGI/S
76/\.
]:6EIEGI
=
-9/..:9<-EI/\-;6765-/96;-E
&
N9H-/E-;6\I.
$)
@@M@
*
59\-C
!
"
(:I7-H59\-C6/E:6I5(R-/E-/
=
GI
=
-9/9CA
F
\9;:G95I@$)"
"
AT@
#
%$
#
期
!!!!!!!!!!!!!
马璐琳!等$中国桔梗
!
*
0%1)12
基因的克隆及表达分析
与风铃草
2%B)BJ
氨基酸序列比较结果发现!
!
*
0%1
)12
编码的氨基酸序列中还包含一段类似于风铃草
2%B)BJ
蛋白中的
0
个氨基酸序列的特殊区"图
$
#
序列相似性分析的结果初步说明分离得到了中国桔
梗
0%1)12
基因全长
:;:
!
1
2
3$4%45
基因的时空表达分析
半定量
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结果显示$
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0%1)12
基因在
中国桔梗
)
个不同发育时期的花朵中均有表达!但
表达趋势差异较大!第
#
和第
)
时期几乎不表达!随
着花瓣发育进程和蓝色花色素的积累!表达量逐渐
增加!在第
$
时期达到最高"图
)
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3
#!而在叶组织中
几 乎不表达"图
)
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#
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基因的表达模式
图
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表达分析
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在中国桔梗花和叶的表达结果
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似!说明
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*
0%1)12
基因是花器官特异表达的基
因!随着花朵的开放!
!
*
0%1)12
基因伴随着飞燕草
色素的逐渐合成和花朵蓝色的出现在花朵发育后期
高度转录!表明飞燕草色素的积累可能受其转录调
控!
!
*
0%1)12
基因的表达可能在调节中国桔梗蓝
色花朵形成中发挥重要作用
%
!
讨
!
论
序列比对结果发现!在所有已知的
0%1)12
基
因中!中国桔梗
!
*
0%1)12
基因与风铃草中的
0%1
)12
基因的氨基酸序列相似度最高"相似系数为
1"c
#!其次是南非半边莲"相似系数为
*)c
#!这可
能与中国桔梗(风铃草和南非半边莲都属于桔梗科
"中国桔梗属于桔梗科桔梗属!风铃草属于桔梗科风
铃草属!南非半边莲属于桔梗科半边莲属#!它们的
进化关系较其他物种要近有关这在一定程度上确
证了一些研究者认为植物中的
0%1)12
基因可以用
来进行植物分类系统进化树的分析!其结果与恩格勒
植物分类系统顺序是一致的结论+1!#,另外!区别于
其他物种
0%1)12
基因的是!中国桔梗
!
*
0%1)12
基
因编码的氨基酸序列中具有类似于风铃草
2%B)BJ
蛋
白中的包含
0
个氨基酸的)
]^ VK]]3]3
*特殊区段!
仅有
!
个氨基酸发生了变化!有研究发现$风铃草
0%1)12
基因在烟草中的表达可以促使烟草中积累
占总花色素
00c
的飞燕草色素!明显高于矮牵牛(
大花草原龙胆等其他植物的
0%1)12
基因在烟草中
的色素累积量!推测可能与风铃草
2%B)BJ
特有的
0
个氨基酸序列区有关+!!,然而!目前已知的多种植
物中的
0%1)12
基因都缺少这个特殊区段!并且矮
牵牛+),(大花草原龙胆+,(蔓长春花+*,和赛亚麻+!%,
等中的
0%1)12
基因通过遗传转化证明都在一定程
度上促进了飞燕草色素的积累!其中三色堇
0%1)12
基因是蓝色月季成功育出的关键因素之一+#),因
此!中国桔梗
@
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2%B)BJ
中具有的类似于风铃草
2%B
)BJ
中的
0
个氨基酸特殊区是否真能催化合成更多
的飞燕草色素还需要在以后的工作中进一步验证
以往的研究证明!不同物种的
0%1)12
基因在
花朵发育不同时期和不同组织的时空表达模式有所
不同瓜叶菊
0%1)12
基因在花朵第
#
时期表达量
最高!其他发育时期没有检测到该基因的表达!但在
叶片中有表达!推测可能是由于瓜叶菊叶背和叶柄
基部存在蓝色着色点!色素在叶片中的合成与色素
的抗氧化功能有关+1,细茎石斛
0%1)12
基因在其
花萼和花瓣的表达量远远低于其在花柱基部的表达
量!这可能是由于细茎石斛花被呈白色而花柱基部
具有红紫色斑点的原因造成的+!$,而中国桔梗
!
*
0%1)12
基因与大花草原龙胆+,(蔓长春花+*,(蝴
蝶兰+#",(赛亚麻+!%,(万代兰+##,(川乌头+#%,等植物的
0%1)12
基因的表达模式相一致!都是在花朵发育第
$
时期表达量达到最高!其他发育时期微弱表达或
不表达!并且只在花朵部位特异表达!其他如根(茎(
叶等部位不表达这种表达上的差异可能是由于不
同的物种
0%1)12
基因本身以及合成飞燕草色素苷
的其他调节基因存在一定差异造成的+!),&另外!不
同植物花朵的花型(着色程度及发育情况等的差异
可能也是造成这种表达差异的原因但大部分
0%1
)12
基因是在花朵中特异表达的基因!受花朵发育
调控!随着花朵的发育并伴随色素合成及花瓣着色
而表达由于
0%1)12
的表达可以通过花朵的显色
直观表现出来!所以
0%1)12
不仅是蓝色花色研究
的重要基因!对于揭示花卉发育的分子机制也具有
重要的价值+1,
参考文献!
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