全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(5): 456-465(2012)
收稿日期: 2011-11-24; 修回日期: 2012-05-02
基金项目: 黑龙江省教育厅科学技术研究项目(11551058)
通讯作者: 张艳菊,教授,主要从事植物病原生物学研究; Tel: 0451-55190827, Fax: 0451-55190447, E-mail: yanjuzhang@yahoo. com. cn
第一作者: 刘 东(1985 - ),女,硕士,主要从事黄瓜枯萎病的研究; E-mail:dongdongwaiting@yahoo. cn。
黄瓜枯萎病菌毒力、营养体亲和性及 ISSR分析
刘 东, 代丽婷, 蒲子婧, 苗 笛, 马柏壮, 张艳菊*
(东北农业大学, 哈尔滨 150030)
摘要:本研究对来自哈尔滨、长春、沈阳、北京、西宁 5 个城市的 70 个尖孢镰刀菌黄瓜专化型菌株进行了毒力、营养体亲和
性及 ISSR分析。 毒力测定结果显示黄瓜枯萎病菌在东农 803 品种上存在明显的毒力分化。 在营养体亲和群的测定中有 8
个菌株没有产生 nit突变体,2 个菌株经测定为异核体自身不亲和性菌株,不能进行营养体亲和群的测定;其余 60 个菌株可
分为 5 个营养体亲和群。 利用筛选的 7 个引物对 70 个菌株进行了 ISSR分子标记,聚类分析可将 70 个菌株分为 3 个类群,
其中 IGⅠ的 41 个菌株均来自东北三省,IGⅡ的 21 个菌株均来自北京,IGⅢ的 8 个菌株全部来自西宁。 VCGs和 ISSRs与
菌株的地理来源及毒力存在一定的相关性。
关键词:黄瓜枯萎病菌; 毒力分化; 营养体亲和群; ISSR
Virulence, vegetative compatibility and ISSR analysis of Fusarium oxysporum f. sp.
cucumarinum　 LIU Dong, DAI Li-ting, PU Zi-jing, MIAO Di, MA Bai-zhuang, ZHANG Yan-ju
(Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)
Abstract: To study genetic diversity of Fusarium oxysporum f. sp. cucumarinum, 70 isolates from Harbin,
Changchun, Shenyang, Beijing and Xining were tested by virulence, vegetative compatibility and ISSR. The
results showed that evident virulence differentiation of pathogenic isolates was present in Dongnong 803 culti-
var. The test of vegetative compatibility of these isolates indicated that 8 isolates didn’ t produce nit mutants,
and 2 isolates were heterokaryon self-incompatibile and therefore could not preceed to the vegetative compati-
bility analysis. Finally, five vegetative compatibility groups were identified among the remnant 60 isolates.
The genetic diversity of the isolates was analyzed with 7 ISSR primers and resulted in three ISSR groups
( IG) . IGⅠincluded 41 isolates from three provinces of Northeastern China. IGⅡ included 21 isolates from
Beijing, and IGⅢ included 8 isolates from Xining. It suggested that VCGs and ISSRs were correlated with
groups defined by geographical origin and virulence.
Key words: Fusarium oxysporum f. sp. cucumarinum; virulence differentiation; vegetative compatibility
groups; ISSR
中图分类号: S436. 421. 13　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2012)05-0456-10
　 　 黄瓜枯萎病(Fusarium oxysporum f. sp. cu-
cumarinum Owen,尖孢镰刀菌黄瓜专化型)是世界
性土传病害,在黄瓜各生育期内均可发生,是影响
黄瓜生产的重要病害之一[1]。 国内外一些研究表
明黄瓜枯萎病菌存在生理小种分化现象,来源于美
国、以色列和日本的黄瓜枯萎病菌分别被鉴定为 1
号、2 号和 3 号生理小种[2],我国黄瓜枯萎病菌为 4
号生理小种[3 ~ 6]。 营养体亲和群(vegetative com-
patibility group, VCG)、RFLP ( restricted fragment
length polymorphism )、 SSR ( simple sequence
　
　 5 期 　 　 刘 东,等:黄瓜枯萎病菌毒力、营养体亲和性及 ISSR分析
repeat)、 ISSR ( inter-simple sequence repeat ) 和
AFLP( amplified fragment length polymorphism)等
现代生物技术为植物病原菌群体遗传学研究提供
了简便和可靠的手段。 VCG是依靠真菌生物遗传
学特征进行种下分类。 国内外已有许多研究证明,
病原菌的 VCG 与其专化型和生理小种密切相
关[7 ~ 9],并可以将致病菌与非致病菌区分开[7,8,10]。
Puhalla[11]首次应用 VCGs技术研究了尖孢镰刀菌
的致病性分化,近年来该技术已广泛用于尖孢镰刀
菌不同专化型菌株的分类研究。 ISSR 是由 Zietk-
iewicz 等创建的一种简单序列重复区间扩增多态
性分子标记,具有多态性高、检测位点多、样品用量
少、耗时短、可靠性强等优点,也广泛用于微生物遗
传多样性研究[12]。 Li 等[13]和 Wang 等[14]对不同
种镰刀菌及同种镰刀菌不同专化型菌株进行了 IS-
SR分析,结果显示 ISSR标记不仅能区分不同种镰
刀菌,还可以将同种镰刀菌的不同专化型区分开。
Baysal等[15]利用 ISSR 标记揭示了尖孢镰刀菌的
遗传多样性与毒力具有相关性。 本研究从病菌毒
力、营养体亲和性和 ISSR 分子标记 3 个方面对黄
瓜枯萎病菌遗传多样性进行研究,旨在揭示尖孢镰
刀菌的遗传多样性和演化关系,同时为黄瓜枯萎病
菌致病性分化和抗病育种研究提供理论依据。
1　 材料与方法
1. 1　 供试菌株的分离与鉴定
2008 年从哈尔滨、长春、沈阳、北京、西宁 5 个
城市采集黄瓜枯萎病株,在 PDA 培养基上采用组
织分离法分离病原菌,经纯化和单孢分离后,分别
接种 于 PSA 和 SNA 两 种 培 养 基 上, 参 考
Booth[16]、Nelson等[17]和 Leslie等[18],通过形态学
鉴定和致病性测定,共获得 70 个尖孢镰刀菌致病
菌株,其中来自哈尔滨的有 28 个菌株,长春 12 个
菌株,沈阳 1 个菌株,北京 21 个菌株,西宁 8 个菌
株。 将 70 个菌株分别接种于黄瓜(津春 4 号)、甜
瓜(伊丽莎白)、西瓜(新红宝)、丝瓜(八棱丝瓜)、
冬瓜(黑皮冬)、西葫芦(春野舌瓜)和苦瓜(长绿苦
瓜)7 种葫芦科作物上进行专化型鉴定,结果 70 个
菌株均强侵染黄瓜,弱侵染甜瓜和西瓜,不侵染其
他瓜类作物。 因此,70 个菌株被鉴定为尖孢镰刀
菌黄瓜专化型(表 1)。
1. 2　 菌株的毒力测定
1. 2. 1　 供试品种　 黄瓜品种东农 803 用于毒力测
定,由东北农业大学黄瓜课题组提供。
1. 2. 2　 供试培养基　 PL培养液:马铃薯 200 g,乳
糖 20 g,蒸馏水 1 000 mL。
1. 2. 3　 毒力测定方法　 采用Weng 等[3]胚根接种
法。 供试黄瓜种子用 5% 次氯酸钠溶液浸种 10
min,清水冲洗后置于恒温培养箱中 28℃催芽,待
胚根长至 0. 5 cm时进行接种。 将单孢分离的菌株
移入 PL培养液内,震荡培养 7 d 后,配制成 1. 5 ×
106个孢子·mL -1浓度的菌悬液接种体。 将芽长
0. 5 cm的黄瓜种子浸于菌悬液中 20 min,捞出沥
去菌液后,播种于盛有消毒的蛭石草炭营养土(3:
1)的营养钵(直径为 9 cm)中,置于 20℃ ~ 26℃温
室内培养。 以未经菌悬液浸泡接种为对照,每个处
理 12 株,重复 3 次。 接种后 15 d 调查发病情况。
病害调查采用 Weng 等[3]的 5 级分级标准,0 级:
无病症;1 级:胚轴或子叶上出现轻微症状,但生长
正常;2 级:胚轴或子叶有明显坏死斑,或者一片子
叶黄化,生长受一定影响;3 级:坏死斑引起局部性
萎蔫,或一片子叶枯死,或生长僵化;4 级:植株严
重萎蔫,倒伏或枯死。 计算病情指数。
病情指数 =
∑
n
i = 0
(各级病株数 ×各级值)
调查总株数 ×最高级值 ×100
1. 3　 营养体亲和群的测定
营养体亲和群的测定参照 Wang 等[7]方法
进行。
1. 3. 1　 供试培养基　 KPS:PSA 中加入 15 ~ 20 g
的氯酸钾;基础培养基:蔗糖 30 g,KH2PO4 1 g,
MgSO4·7H2O 0. 5 g,KCl 0. 5 g,FeSO4·7H2O 10
mg,琼脂 20 g,微量元素液 0. 2 mL,1 000 mL蒸馏
水;MM:基础培养基 + 2 g·L -1 NaNO3;MO2:基
础培养基 + 0. 5 g·L -1 NaNO2;MH:基础培养基
+0. 2 g·L -1次黄嘌呤;微量元素液:柠檬酸 5 g,
ZnSO4·H2O 5 g,Fe(NH4) 2 (SO4) 2·6H2O 1 g,
CuSO4 · 5H2O 0. 25 g, MnSO4 · H2O 50 mg,
H3BO4 50 mg,Na2MoO4·H2O 50 mg,H2O 95 mL。
754
　
植物病理学报 42 卷
Table 1　 Pathogenicity, vegetative compatibility and ISSR groups
of Fusarium oxysporum f. sp. cucumarinum
Code Origin Resistant KClO3 mutant
nit mutant
nit1 nitM
VCGs Disease index IGs
C1 Changchun 17 8 1 VCG1 64. 3 IGⅠ
C9 Changchun 6 2 1 VCG1 47. 5 IGⅠ
C10 Changchun 15 8 2 VCG1 50. 0 IGⅠ
C16 Changchun 16 13 2 VCG1 95. 0 IGⅠ
C19 Changchun 17 5 2 VCG1 36. 1 IGⅠ
C20 Changchun 7 3 1 VCG1 65. 6 IGⅠ
C23 Changchun 22 10 2 VCG1 43. 8 IGⅠ
H7 Harbin 3 1 1 VCG1 53. 6 IGⅠ
H10 Harbin 4 1 1 VCG1 57. 1 IGⅠ
H16 Harbin 8 4 1 VCG1 77. 8 IGⅠ
H21 Harbin 11 5 1 VCG1 65. 0 IGⅠ
H22 Harbin 13 6 2 VCG1 52. 5 IGⅠ
H24 Harbin 12 7 3 VCG1 66. 7 IGⅠ
H25 Harbin 8 3 3 VCG1 46. 4 IGⅠ
H39 Harbin 6 4 2 VCG1 25. 0 IGⅠ
H43 Harbin 8 4 2 VCG1 27. 5 IGⅠ
H75 Harbin 5 3 2 VCG1 20. 0 IGⅠ
J10 Beijing 6 3 1 VCG1 52. 5 IGⅡ
J50 Beijing 11 5 3 VCG1 41. 6 IGⅡ
S1 Shenyang 9 4 1 VCG1 72. 2 IGⅠ
J52 Beijing 10 5 1 VCG2 87. 5 IGⅡ
J53 Beijing 12 8 1 VCG2 57. 1 IGⅡ
J56 Beijing 14 10 1 VCG2 27. 5 IGⅡ
J35 Beijing 8 4 1 VCG2 46. 9 IGⅡ
X16 Xining 10 5 4 VCG2 69. 4 IGⅢ
X19 Xining 6 3 1 VCG2 78. 1 IGⅢ
X23 Xining 11 2 3 VCG2 30. 0 IGⅢ
X26 Xining 11 2 1 VCG2 50. 0 IGⅢ
X28 Xining 4 2 1 VCG2 52. 5 IGⅢ
J4 Beijing 7 3 1 VCG3 91. 7 IGⅡ
J14 Beijing 5 2 1 VCG3 62. 5 IGⅡ
J20 Beijing 16 8 2 VCG3 55. 6 IGⅡ
J24 Beijing 5 2 1 VCG3 92. 5 IGⅡ
J28 Beijing 9 4 1 VCG3 57. 5 IGⅡ
J41 Beijing 10 4 3 VCG3 75. 0 IGⅡ
H1 Harbin 10 5 2 VCG4 55. 6 IGⅠ
H27 Harbin 6 4 1 VCG4 47. 5 IGⅠ
854
　
　 5 期 　 　 刘 东,等:黄瓜枯萎病菌毒力、营养体亲和性及 ISSR分析
Continued
Code Origin Resistant KClO3 mutant
nit mutant
nit1 nitM
VCGs Disease index IGs
H28 Harbin 12 6 1 VCG4 40. 0 IGⅠ
H33 Harbin 11 5 2 VCG4 39. 3 IGⅠ
H36 Harbin 8 6 1 VCG4 53. 1 IGⅠ
H38 Harbin 6 3 1 VCG4 44. 4 IGⅠ
H40 Harbin 4 1 1 VCG4 54. 2 IGⅠ
H44 Harbin 3 2 1 VCG4 55. 0 IGⅠ
H45 Harbin 7 1 1 VCG4 57. 1 IGⅠ
H46 Harbin 15 9 2 VCG4 35. 0 IGⅠ
H47 Harbin 9 4 1 VCG4 66. 7 IGⅠ
H50 Harbin 13 6 2 VCG4 42. 5 IGⅠ
H51 Harbin 11 7 1 VCG4 36. 1 IGⅠ
H55 Harbin 4 1 1 VCG4 19. 4 IGⅠ
H56 Harbin 5 3 1 VCG4 37. 5 IGⅠ
C18 Changchun 13 4 4 VCG5 71. 4 IGⅠ
C24 Changchun 11 9 2 VCG5 45. 0 IGⅠ
C28 Changchun 5 1 1 VCG5 32. 5 IGⅠ
J9 Beijing 17 8 1 VCG5 27. 5 IGⅡ
J39 Beijing 15 8 2 VCG5 50. 0 IGⅡ
J44 Beijing 10 4 1 VCG5 42. 5 IGⅡ
J60 Beijing 5 2 1 VCG5 40. 0 IGⅡ
J78 Beijing 14 7 3 VCG5 40. 0 IGⅡ
J80 Beijing 4 2 1 VCG5 20. 0 IGⅡ
J90 Beijing 6 1 2 VCG5 28. 6 IGⅡ
X2 Xining 3 - - - 35. 0 IGⅢ
X8 Xining 10 - - - 37. 5 IGⅢ
X15 Xining 8 - - - 45. 0 IGⅢ
H42 Harbin 6 - - - 25. 0 IGⅠ
H48 Harbin 3 - - - 27. 5 IGⅠ
H53 Harbin 11 - - - 33. 3 IGⅠ
C11 Changchun 9 - - - 47. 5 IGⅠ
C22 Changchun 6 - - - 19. 4 IGⅠ
J1 Beijing 11 8 3 HSI 21. 9 IGⅡ
J32 Beijing 6 1 3 HSI 2. 5 IGⅡ
1. 3. 2　 nit突变体的获得与突变类型鉴定 　 将测
试菌株在 PSA上 25℃黑暗培养一周后,每个菌株
打取 15 个直径 8 mm 的菌片接种到 KPS 上,25℃
黑暗培养数天后,将扇形突变菌丝(图 1)接种到
MM上,25℃黑暗培养数天后,若无气生菌丝产生
即为 nit突变体。 将 nit突变体分别接种于MO2 和
MH上,25℃黑暗培养数天后,若两者均有气生菌
丝产生即为 nit1,若只有 MO2 上产生气生菌丝则
954
　
植物病理学报 42 卷
为 nitM。
Fig. 1　 Resistant KClO3 mutant
1. 3. 3　 自身营养体亲和性测试　 将菌株内的 nit1
和 nitM在 MM 培养基上进行两两互补测试,若两
者交界处有气生菌丝(图 2)产生,即为异核体自身
亲和性(HSC)菌株,反之为异核体自身不亲和性
(HSI)菌株。
Fig. 2　 Compatibility reaction
1. 3. 4　 营养体亲和群的测定　 从各异核体自身亲
和性(HSC)菌株内挑选出最具亲和力的 nit1 和
nitM各两株在 MM 培养基上做菌株间互补测定,
nit1 和 nitM间有气生菌丝产生则为同一营养体亲
和群。
1. 4　 ISSR分析
1. 4. 1　 DNA提取　 采用 Wang 等[14]报道的 SDS
法提取供试菌株基因组 DNA。
1. 4. 2　 ISSR反应体系和反应程序　 采用的 ISSR
扩增反应体系为:20 μL 体系中,0. 5 U Taq DNA
聚合酶,2. 0 mmol·L -1 MgCl2,0. 2 mmol·L -1
dNTPs,0. 4 μmol·L -1引物,30 ng 模板 DNA。 反
应程序为:94℃预变性 5 min;94℃变性 45 s,52℃
退火 45 s,72℃延伸 2 min,35 个循环;72℃最后延
伸 7 min[13]。 扩增产物 4℃保存。 扩增反应结束
后,在 1. 5%琼脂糖凝胶中分离扩增产物,用 GIS
凝胶成像分析系统拍照记录。
1. 4. 3　 引物筛选　 选取 5 个 DNA模板,利用合成
的 ISSR引物(上海生工合成),在 20 μL 反应体系
中进行扩增筛选,从 10 个引物中筛选扩增条带较
多、背景清晰的引物,用于全部 70 个 DNA 样品的
扩增(表 1)。
1. 4. 4 　 数据分析　 扩增结果用 NTSYS(2. 1 版)
软件统计分析,采用 UPGMA法构建系统发育树。
2　 结果与分析
2. 1　 毒力测定
70 个尖孢镰刀菌菌株接种东农 803 进行毒力
测定,结果显示 70 个菌株在东农 803 上存在毒力
差异。 接种 15 d后调查病情指数在 19. 4 到 95. 0
之间,70 个菌株中有 16 个菌株毒力较强(病情指
数大于 60),14 个菌株毒力较弱(病情指数小于
30);病情指数方差分析结果表明,各菌株间毒力
存在极显著差异,同一地区的菌株毒力强弱也存在
差异(表 2)。
2. 2　 营养体亲和群的测定
从 70 个菌株中共获得 639 个抗 KClO3 突变
体,381 个 nit突变体,其中 nit1 占 73. 8% ,nitM 占
26. 2% 。 8 个菌株没有获得 nit突变体,2 个菌株为
异核体自身不亲和性菌株,其余 60 个菌株均为异
核体自身亲和性菌株,经营养体亲和群测定共分为
5 个 VCGs。 VCG1 包含 20 个菌株,其中包括来自
哈尔滨的 10 个菌株,长春 7 个菌株,沈阳 1 个菌
株,和北京的 2 个菌株。 VCG2 包含 9 个菌株,其
中 5 个来自西宁,4 个来自北京。 VCG3 包含 6 个
菌株,均来自北京。 VCG4 包含 15 个菌株,均来自
哈尔滨。 VCG5 包含 10 个菌株,其中 7 个来自北
京,3 个来自长春(表 2)。
　 　 经对 70 个菌株的毒力与营养体亲和群的比较
分析,结果表明,5 个 VCGs 的平均病情指数存在
显著性差异。 VCG3 中菌株的毒力最强,平均病情
064
　
　 5 期 　 　 刘 东,等:黄瓜枯萎病菌毒力、营养体亲和性及 ISSR分析
Table 2　 Primers used for ISSR analysis of Fusarium oxysporum f. sp. cucumarinum
Primer Sequence Primer Sequence
807 (AG) 8T 828 (TG) 8A
811 (GA) 8C 852 (TC) 8RA
812 (GA) 8A 856 (AC) 8YA
817 (CA) 8A 860 (TG) 8RA
822 (TC) 8A 885 BHB(GA) 7
Note: R = (A, G); Y = (C, T); B = (C, G, T); H = (A, C, T) .
指数为 72. 5;其次为 VCG2、VCG1、VCG4,平均病
情指数分别为 55. 4、53. 0 和 45. 6;VCG5 中菌株毒
力最弱,平均病情指数为 39. 8。 菌株营养体亲和
性与毒力存在一定的相关性(表 3)。
2. 3　 ISSR分析
2. 3. 1　 70 个尖孢镰刀菌的 ISSR扩增结果　 经对
10 个引物的试验,筛选出 7 个多态性好、条带清
晰、反应稳定的引物(表 4)。 用这 7 个引物分别对
70 个菌株进行了扩增,共扩增出 58 条谱带,多分
布在 750 ~ 3 000 bp 区域,其中特征性条带为 50
条,占总带数的 86. 2% 。 不同引物扩增条带数不
同,平均每个引物产生 8. 3 个条带。 引物 885 扩增
条带数最多,多态性条带比例为 100% ;其次为引
物 811 与 812,多态性条带比例为 90% ;引物 860
与 817 扩增条带最少,多态性条带比例分别为
66． 7%和 60% (表 4)。
Table 3　 Vegetative compatibility groups and virulence of Fusarium oxysporum f. sp. cucumarinum
VCG
Number of isolate tested
Harbin Changchun Shenyang Beijing Xining
Total Average disease index
3 0 0 0 6 0 6 72. 5a(55. 6 ~ 92. 5)
2 0 0 0 4 5 9 55. 4b(27. 5 ~ 87. 5)
1 10 7 1 2 0 20 53. 0b(20. 0 ~ 95. 0)
4 15 0 0 0 0 15 45. 6c(19. 4 ~ 66. 7)
5 0 3 0 7 0 10 39. 8d(20. 0 ~ 71. 4)
Total 25 10 1 19 5 60 53. 3 (19. 4 ~ 95. 0)
Table 4　 Amplification of 70 Fusarium oxysporum f. sp. cucumarinum isolates with 7 ISSR primers
Primer Sequence Tm / ℃
Number of
amplified band
Number of
polymorphic band
Percentage of
polymorphic band / %
807 (AG) 8T 54 9 7 77. 8
811 (GA) 8C 52 10 9 90
812 (GA) 8A 52 10 9 90
817 (CA) 8A 48 5 3 60
856 (AC) 8YA 48 6 5 83. 3
860 (TG) 8RA 50 3 2 66. 7
885 BHB(GA) 7 52 15 15 100
Total 58 50 86. 2
Note: R = (A, G); Y = (C, T); B = (C, G, T); H = (A, C, T) .
164
　
植物病理学报 42 卷
2. 3. 2　 70 个尖孢镰刀菌的 ISSR聚类分析　 利用
NTSYS软件对 ISSR 数据进行分析,得到 70 个尖
孢镰刀菌聚类分析树状图(图 3)。 当相似系数为
0. 67 时(L 线),供试菌株可分为 3 个类群( IGⅠ、
IGⅡ和 IGⅢ)。 IGⅠ包含 41 个菌株,均来自东北
三省;IGⅡ包含 21 个菌株,均来自北京;IGⅢ包含
8 个菌株,全部来自西宁。 说明 ISSR 标记与菌株
的地理来源密切相关。 同时 VCG4 中全部菌株与
VCG1 中 90%的菌株均属于 IGⅠ,VCG3 中全部
菌株与 VCG5 中 70% 的菌株均属于 IGⅡ,说明
ISSRs与 VCGs具有一定相关性。
Fig. 3　 Dendrogram of 70 Fusarium oxysporum f. sp. cucumarinum isolates with ISSR-PCR
264
　
　 5 期 　 　 刘 东,等:黄瓜枯萎病菌毒力、营养体亲和性及 ISSR分析
　 　 当相似系数为 0. 73 时(M 线),IGⅠ可分为 5
个亚群:第 1 亚群包含 C1、C20、C24、C18、C16 和
S1 共 6 个菌株,除 S1 外均来自长春,病情指数自
64. 3 至 95. 0,毒力均较强;第 3 亚群中包含 6 个菌
株,分别为 H16、H42、H48、H53、C11、C22,所有菌
株毒力均偏弱,且都是没有获得 nit突变体的菌株;
第 2、4、5 三个亚群中共计 29 个菌株,均属于
VCG1 和 VCG4,且长春剩余的其他 5 个菌株均在
这 3 个亚组里,病情指数为 32. 5 至 50. 0,为中等
毒力。
当相似系数为 0. 81 时(N 线),IGⅡ可分为 5
个亚群:第 1 亚群有 4 个菌株,分别为 J39、 J44、
J60、和 J80,都属于 VCG5,菌株毒力中等;第 2 个
亚群中包含 7 个菌株,分别为 J4、 J10、 J14、 J20、
J24、J28、J41,毒力均强,并且除 J10 外其余 6 个菌
株均属于 VCG3;第 3 个亚群包含 J9、J35、J56、J78、
J90 共 5 个菌株,其中 J35 和 J56 属于 VCG2,J9、
J78 和 J90 属于 VCG5,均为毒力弱的菌株;第 4 亚
群有 J1 和 J32 共 2 个菌株,均为异核体自身不亲
和性菌株。 以上结果说明 ISSRs与菌株的毒力、地
理来源和 VCGs具有一定的相关性。
3　 结论与讨论
关于黄瓜枯萎病菌的生理分化现象,国内外已
有了一些较深入的研究报道。 Armstrong 等[2]采
用 MSU441034、MSU8519、PI390265 作为鉴别寄
主,对来源于美国弗罗里达、以色列和日本的黄瓜
枯萎病菌株进行了生理小种分化鉴定,将它们分别
定名为生理小种 1 号、2 号、3 号。 我国 Weng 等[3]
对来源于哈尔滨、北京、天津、兰州、南京和广州的
黄瓜枯萎病菌在 MSU441034、MSU8519、PI390265
以及我国抗病品种长春密刺和感病品种津春 2 号
等鉴别寄主上进行生理分化试验,发现这些菌株的
致病性差异不显著,属于同一个生理小种,但在鉴
别寄主上的抗性表现为 R、R、S,与国外病菌表现
不同,因此,将我国黄瓜枯萎病菌定名为 4 号生理
小种。 Luo等[5]和 Huang 等[6]分别对来自河北省
和全国 17 个省、市的黄瓜枯萎病菌生理小种的鉴
定结果与 Weng 等[3]的一致。 自 1995 年之后,我
国未见黄瓜枯萎病菌生理小种分化方面的研究报
道。
近年来我国培育了大量黄瓜新品种,在生产上
栽培的黄瓜品种发生了很大变化。 由于病菌与寄
主品种之间的互作,我国黄瓜枯萎病菌生理小种是
否发生了变化,不同地域的不同菌株是否存在地理
型差异等均鲜有报道[19]。 随着黄瓜栽培品种的更
替,栽培品种的抗源亲本都发生了变化,国际公认
的 MSU441034、MSU8519 和 PI390265 三个鉴别寄
主已经不再具有代表性,而且各国也鲜有这些鉴别
寄主的保存。 由于没有标准的鉴别寄主,所以本研
究没有完成供试菌株在标准鉴别寄主上的生理分
化研究,但通过黄瓜枯萎病菌在黄瓜品种东农 803
上的毒力研究发现,我国黄瓜枯萎病菌存在明显的
毒力分化。 有鉴于此,今后应对生产上推广的黄瓜
品种和重要育种抗源进行筛选,选择有代表性的鉴
别寄主并对枯萎病菌进行毒力分化研究,进一步明
确我国黄瓜枯萎病菌的生理小种种群,为抗病育种
和品种合理布局提供理论依据。
营养体亲和性能够反应真菌菌株间的亲缘关
系,属于一个 VCGs的菌株应具有一个或多个等位
基因,营养体亲和性的测定可以在人工控制的条件
下进行,省时省力,操作简单,结果可靠[20]。 采用
营养体亲和群鉴定方法可以区分病菌不同专化型
的菌株。 Wang等[7]通过对 30 个尖孢镰刀菌菌株
(包括 6 个专化型)的营养体亲和群的研究,发现
属于不同专化型的菌株属于不同的营养体亲和群;
同时,营养体亲和群也与菌株毒力水平相关。 Ahn
等[21]通过对韩国尖孢镰刀菌黄瓜专化型菌株的研
究,共鉴定出 6 个 VCGs,并发现菌株的毒力水平
与 VCGs相关。 本研究在确定供试菌株均为黄瓜
专化型的基础上进行了营养体亲和群的测定,结果
显示,我国尖孢镰刀菌黄瓜专化型至少存在 5 个
VCGs,并且 VCGs 与菌株的毒力及地理来源有一
定的相关性。 本文在测定营养体亲和群的过程中,
发现个别菌株属于异核体自身不亲和性菌株,有些
菌株没有产生 nit突变体,因此,不能进行营养体亲
和群的测定。 虽然营养体亲和群的测定条件是人
工控制的,但是,不能测试所有菌株是本研究中的
一大缺陷。 本研究所用菌株仅包含我国 5 个城市
的菌株,数量有限,因此,有必要增加不同地理来源
的菌株,加强对黄瓜枯萎病菌的深入研究。
ISSR是一种很有效的分子标记技术,已广泛
应用于检测 SSR 间 DNA 序列差异。 Baysal 等[15]
利用 ISSR标记揭示了尖孢镰刀菌的遗传多样性
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植物病理学报 42 卷
与毒力存在相关性。 本研究通过对供试菌株的 IS-
SR分析,明确了 ISSRs 与菌株的地理来源及毒力
均存在相关性,同时 ISSRs与 VCGs在菌株的地理
来源上存在很强的相关性,但在菌株毒力上两者的
相关性不明显。
本研究通过对来自 5 个城市 70 个黄瓜枯萎病
菌菌株的毒力、营养体亲和性及 ISSR 的分析,明
确了我国黄瓜枯萎病菌在黄瓜品种东农 803 上存
在明显的毒力分化,并且毒力与 VCGs及 ISSRs存
在一定的相关性,其中与 VCGs 的相关性更为密
切。 同时,ISSRs和 VCGs 与菌株的地理来源密切
相关。 本文研究结果说明,利用营养体亲和性和
ISSR分子标记技术可以对我国黄瓜枯萎病菌生理
小种进行初步鉴定,有重要参考价值。
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