全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(5): 466-473(2012)
收稿日期: 2011-09-05; 修回日期: 2012-07-22
基金项目: 国家质检总局课题(2009IK256; 2011IK169); 国家“973”课题(2011CB932800); 宁波检验检疫局科研项目(甬 K07-2011);
国家标准制修订计划项目(20100455-T-469)
通讯作者: 段维军,高级农艺师,主要从事植物检疫研究; Tel: 0574-87022951, Fax: 0574-87113584, E-mail: weijunduan@yahoo. com. cn
第一作者: 郭立新(1976 - ),女,湖南双峰人,硕士,主要从事植物检疫研究; E-mail: guolx7649@ tom. com。
啤酒花潜隐类病毒的实时荧光 RT-PCR检测
郭立新1, 段维军2*, 张祥林3, 邓丛良4, 闻伟刚2, 李世访5
( 1 北仑出入境检验检疫局, 宁波 315800; 2宁波出入境检验检疫局, 宁波 315012;
3新疆出入境检验检疫局, 乌鲁木齐 830063; 4北京出入境检验检疫局, 北京 101312;
5中国农业科学院植物保护研究所, 北京 100193)
摘要:根据啤酒花潜隐类病毒(HpLVd)各分离物基因序列,设计并合成 1 对特异性引物和 1 条 TaqMan-MGB探针,建立了
对 HpLVd的实时荧光 RT-PCR检测方法。 通过对反应体系的优化,确定了 HpLVd 的实时荧光 RT-PCR 最佳反应条件:
Mg2 +终浓度为 5. 5 mmol / L,引物终浓度为 0. 7 μmol / L,探针终浓度为 0. 5 μmol / L。 灵敏度对比试验结果显示,实时荧光
RT-PCR的灵敏度较普通 RT-PCR通过琼脂糖凝胶电泳高 10 倍,在 25 μL反应体系中,总 RNA含量达到 20 pg就能通过实
时荧光 RT-PCR检测出来。 此方法也能成功检测田间样品上的啤酒花潜隐类病毒。
关键词:啤酒花潜隐类病毒; 实时荧光 RT-PCR; 检测; TaqMan-MGB探针
Detection of Hop latent viroid by real-time fluorescent RT-PCR assay 　 GUO Li-xin1,
DUAN Wei-jun2, ZHANG Xiang-lin3, DENG Cong-liang4, WEN Wei-gang2, LI Shi-fang5 　 ( 1Beilun Entry-
exit Inspection and Quarantine Bureau, Ningbo 315800, China; 2Ningbo Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Ningbo
315012, China; 3Xinjiang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Wulumuqi 830063, China; 4Beijing Entry-exit Inspec-
tion and Quarantine Bureau, Beijing 101312, China; 5 Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences,
Beijing 100193, China)
Abstract: A pair of primers and a TaqMan-MGB probe based on the conserved nucleotide sequence of seve-
ral Hop latent viroid (HpLVd) isolates were designed and synthesized. A novel real-time fluorescent RT-PCR
was established to detect HpLVd. Optimal Mg2 + , primer, and probe concentration were 5. 5 mmol / L, 0. 7
μmol / L, and 0. 5 μmol / L, respectively by optimization of real-time fluorescent RT-PCR reaction system.
The method, detecting as little as 20 pg of total RNA in 25 μL reaction mixture, was ten times more sensitive
than the normal RT-PCR. The real-time RT-PCR assay was applied successfully to detect HpLVd in field sam-
ples.
Key words: Hop latent viroid; real-time fluorescent RT-PCR; detection; TaqMan-MGB probe
中图分类号: S432. 41　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2012)05-0466-08
　 　 啤酒花潜隐类病毒 ( Hop latent viroid,
HpLVd)隶属于 Cocadviroid 属,分布于英国[1 ~ 3]、
德国[4]、韩国[5]、波兰[6]、日本[7]、捷克[8]、巴西[9]、
美国[10]、中国新疆[11]等国家和地区的啤酒花上。
该类病毒侵染啤酒花后不表现明显的症状,但感染
cv. Omega 品种后出现萎黄、生长缓慢等现
象[1,12,13]。 啤酒花受该类病毒侵染后,一些次生代
谢产物成分发生改变,从而影响啤酒花品质,降低
啤酒花产量。 Adams 等[2]报道,不同啤酒花品种
受 HpLVd侵染后,a-酸的含量降低 20% ~ 50% ;受
　
　 5 期 　 　 郭立新,等:啤酒花潜隐类病毒的实时荧光 RT-PCR检测
HpLVd侵染的啤酒花球果产量降低 11% [1]。
迄今为止,国内外检测啤酒花潜隐类病毒的方
法有分子杂交法[7,14]和 RT-PCR法[7,10,11,14]。 分子
杂交法的前提是要制备探针,较为复杂,且检测步
骤繁琐。 RT-PCR 技术虽然简单易行,但需进行
PCR后处理,易发生交叉污染,造成假阳性现象。
利用 TaqMan 探针进行实时荧光 RT-PCR 反应是
在常规 RT-PCR 反应体系中添加了 1 条 TaqMan
探针,实现 RT-PCR 扩增与探针检测同时进行,整
个检测过程完全闭管。 该方法已应用于病毒[15 ~ 17]
和类病毒的检测[18,19]。 Guo 等[15]设计了 TaqMan-
MGB探针,建立了苹果茎沟病毒(ASGV)的实时
荧光检测方法。 Salmon等[16,17]建立了苹果茎痘病
毒(ASPV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)的实时
荧光 RT-PCR检测方法。 Boonham 等[18]建立了马
铃薯纺锤块茎类病毒 ( PSTVd)的实时荧光 RT-
PCR方法,并对世界各地大量分离物进行了成功
检测。 Luigi等[19]设计了 TaqMan 探针,建立了桃
潜隐花叶类病毒(PLMVd)的实时荧光 RT-PCR 检
测方法,并进行了定量研究。 至今尚无应用该技术
对啤酒花潜隐类病毒进行检测的报道。 啤酒花潜
隐类病毒已列入我国进境植物检疫性有害生物名
录,随着国际贸易日益频繁,我国进境啤酒花种苗
呈增长态势,这对啤酒花潜隐类病毒的检测提出了
更高要求,为此,本文开展了啤酒花潜隐类病毒的
TaqMan探针实时荧光 RT-PCR 检测技术研究,以
期获得简单、准确、灵敏、快捷的检测方法。
1　 材料与方法
1. 1　 材料
1. 1. 1　 样品来源　 本研究共收集新疆不同地区的
啤酒花叶片及球果 29 份(表 1);感染锦紫苏类病
毒 1 号(Coleus blumei viroid 1,CbVd-1)、锦紫苏类
病毒 5 号(Coleus blumei viroid 5,CbVd-5)的锦紫
苏叶片 1 份,命名为 J;感染啤酒花潜隐类病毒的
啤酒花阳性样品 1 份,命名为 M17;感染啤酒花矮
化类病毒(Hop stunt viroid,HpSVd)、葡萄黄点类
病毒 1 号 ( Grapevine yellow speckle viroid 1,
GYSVd-1) 及葡萄黄点类病毒 2 号 ( Grapevine
yellow speckle viroid 2,GYSVd-2)的葡萄总 RNA 1
份,命名为 D1;感染桃潜隐花叶类病毒 ( Peach
latent mosaic viroid,PLMVd)的桃总 RNA 1 份,命
名为 D2。 样品 J 和 M17 由中国农业科学研究院
植物保护研究所李世访提供,样品 D1 和 D2 由北
京出入境检验检疫局植物检疫实验室邓丛良提供。
1. 1. 2　 分子生物学试剂　 RNeasy Plant Mini Kit、
QuantiTect Probe RT-PCR Kit 购自 Qiagen 公司,
TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV) 购自大连
宝生物公司,MgCl2 购自 Promega 公司。 RT-PCR
引物[14]由大连宝生物公司合成。
1. 2　 主要仪器
ABIPRISM 7900HT扩增仪。
1. 3　 方法
1. 3. 1　 总 RNA的提取　 分别对啤酒花样品、锦紫
苏叶片,使用 RNeasy Plant Mini Kit 进行植物总
RNA提取,具体操作见试剂盒说明书。 用核酸蛋
白分析仪测 OD260及 OD280,计算核酸的浓度和
纯度。
1. 3. 2 　 TaqMan-MGB 探针与引物的设计和合成
从 GenBank调出椰子死亡类病毒属(Cocadviroid)
4 种类病毒的基因序列,利用 DNAMAN 6. 0. 40 软
件进行比对分析,找出 HpLVd的保守基因序列,使
用软件 Primer Express 3. 0 设计引物和 TaqMan-
MGB 探针。 引物 H LV-F: 5′-CGT GGA ACG
GCT CCT TCT T-3′;引物 H LV-R:5′-AGA GTT
GTA TCC ACC GGG TAG TTT-3′,探针 H LV-P:
5′-CAC CAG CCG GAG TT-3′,探针 5′端含有
FAM报告荧光染料,3′端含有不发荧光的淬灭基
团并具有 MGB 分子。 引物由英潍捷基(上海)贸
易有限公司合成,探针由 ABI公司合成。
1. 3. 3　 探针特异性检测　 以 M17、J、D1 和 D2 总
RNA为模板,水为空白对照,按试剂盒说明书进行
实时荧光 RT-PCR反应,反应条件为:50℃ 30 min;
95℃ 15 min;然后 94℃ 15 s,60℃ 60 s,共 40 个
循环。
1. 3. 4　 实时荧光 RT-PCR反应体系的优化
(1)Mg2 +浓度优化　 以 M17 总 RNA为模板,
在 1. 3. 3 体系中其他成分浓度不变,加入镁离子,
使其终浓度从 4. 0 mmol / L至 7. 0 mmol / L,以 0. 5
mmol / L递增。
(2)引物浓度优化　 以 M17 总 RNA 为模板,
在1. 3. 3体系中其他成分浓度不变,固定优化后的
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植物病理学报 42 卷
Table 1　 Sources of hop used in the study
Sample name Hop cultivar Source location
Q2 Tsingdao flower No. 6 Company, No. 109 Regiment, Qitai Farm
Q4 Tsingdao flower No. 5 Plot, No. 2 Company, Junhu Farm
Q7 Tsingdao flower No. 18 Plot, No. 2 Company, Wuyi Farm
Q11 Tsingdao flower No. 1 Plot, No. 15 Company, No. 141 Regiment, Shihezi
Q15 Tsingdao flower No. 2 Plot, No. 15 Company, No. 141 Regiment, Shihezi
Q22 Tsingdao flower No. 1 Plot, No. 6 Company, No. 1 Battalion, No. 142 Regiment, Shihezi
Q25 Tsingdao flower No. 2 Plot, No. 6 Company, No. 1 Battalion, No. 142 Regiment, Shihezi
Z1 SA-1 No. 1 Plot, No. 1 Company, No. 109 Regiment, Qitai Farm
Z4 SA-1 No. 1 Plot, No. 4 Company, No. 222 Regimental Farm
Z7 SA-1 No. 2 Plot, No. 4 Company, No. 222 Regimental Farm
Z10 SA-1 No. 1 Plot, No. 1 Company, No. 222 Regimental Farm
Z11 SA-1 No. 4 Plot, No. 2 Company, Junhu Farm
Z16 SA-1 No. 4 Plot, No. 2 Company, Junhu Farm
Z19 SA-1 No. 20 Plot, No. 2 Company, Wuyi Farm
K1 Kemite No. 2 Plot, No. 1 Company, No. 109 Regiment, Qitai Farm
K2 Kemite No. 2 Plot, No. 1 Company, No. 109 Regiment, Qitai Farm
K4 Kemite No. 2 Plot, No. 1 Company, No. 109 Regiment, Qitai Farm
M2 Marco Polo No. 3 Plot, No. 4 Company, No. 222 Regimental Farm
M3 Marco Polo No. 3 Plot, No. 4 Company, No. 222 Regimental Farm
M6 Marco Polo No. 3 Plot, No. 1 Company, No. 222 Regimental Farm
M8 Marco Polo No. 1 Company, Wuyi Farm
W1 Unknown No. 1 Plot, No. 108 Regiment, Qitai Farm
W4 Unknown No. 2 Plot, No. 108 Regiment, Qitai Farm
F1 Kirinflow No. 1 Plot, No. 2 Company, Junhu Farm
F4 Kirinflow No. 1 Plot, No. 2 Company, Junhu Farm
F8 Kirinflow No. 10 Plot, No. 2 Company, Wuyi Farm
Y1 Yulebite No. 9 Plot, No. 2 Company, Wuyi Farm
Y2 Yulebite No. 9 Plot, No. 2 Company, Wuyi Farm
Y3 Yulebite No. 9 Plot, No. 2 Company, Wuyi Farm
镁离子浓度,将引物终浓度从 0. 4 μmol / L 至 1. 0
μmol / L,以 0. 1 μmol / L递增。
(3)探针浓度优化　 以 M17 总 RNA 为模板,
在 1. 3. 3 体系中其他成分浓度不变,固定优化后的
镁离子和引物浓度,将探针终浓度从 0. 1 μmol / L
至 0. 8 μmol / L,以 0. 1 μmol / L递增。
1. 3. 5　 灵敏度对比试验 　 以 M17 总 RNA 为模
板,用 RNase Free dH2O 稀释总 RNA 进行相对灵
敏度检测,在 25 μL 反应体系中,总 RNA 分别为
200 ng、20 ng、2 ng、200 pg、20 pg、2 pg、0. 2 pg、
0． 02 pg,利用优化后的体系进行实时荧光 RT-PCR
反应。 同时对稀释的 RNA 按试剂盒说明书进行
普通 RT-PCR检测,水为空白对照,锦紫苏为阴性
对照,M17 为阳性对照。 PCR产物用 2%的琼脂糖
凝胶电泳检测。
1. 3. 6　 田间样品检测 　 以田间采集的啤酒花总
RNA为模板,水为空白对照,锦紫苏为阴性对照,
M17 为阳性对照,利用优化后的体系进行实时荧
光 RT-PCR反应。
2　 结果与分析
2. 1　 探针特异性检测
从图 1 可知,本研究所设计的引物和探针有较
强特异性,7 种类病毒中仅能检出啤酒花潜隐类病
毒,不能检出 CbVd-1、CbVd-5、HpSVd、GYSVd-1、
GYSVd-2、PLMVd和水。
864
　
　 5 期 　 　 郭立新,等:啤酒花潜隐类病毒的实时荧光 RT-PCR检测
2. 2　 实时荧光 RT-PCR反应体系的优化
2. 2. 1　 Mg2 +浓度优化 　 从图 2 可知,当 Mg2 +终
浓度为 5. 5 mmol / L时,ΔRn值达最大、Ct值最小,
经过 3 次重复试验,确定最佳镁离子终浓度为 5. 5
mmol / L。
2. 2. 2　 引物浓度优化　 由图 3 可知,当引物终浓
度为 0. 7 μmol / L 时,ΔRn 值达最大、Ct 值最小。
经过 3 次重复试验,最后确定 0. 7 μmol / L 为引物
最佳浓度。
2. 2. 3　 探针浓度优化　 由图 4 可知,当探针终浓
度为 0. 7 μmol / L 时,ΔRn 值最大。 探针终浓度为
0. 5 μmol / L 时,ΔRn 值次之,但此时 Ct 值最小。
经 3 次重复试验,在扩增效率差异不明显的情况
下,从经济实惠的角度考虑,选定 0. 5 μmol / L 为
最佳探针浓度。
Fig. 1　 Specificity of the real-time fluorescent RT-PCR assay for HpLVd
Rn: Value of fluorescent signals. The RNA of J, D1, D2 and water produced no detectable fluorescence.
Fig. 2　 Mg2 + concentration optimization
ΔRn: Increased value of fluorescence signals.
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植物病理学报 42 卷
Fig. 3　 Primer concentration optimization
ΔRn: Increased value of fluorescence signals.
Fig. 4　 Probe concentration optimization
ΔRn: Increased value of fluorescence signals.
2. 2. 4　 优化后的反应体系　 通过优化镁离子、引
物、探针浓度得出最佳反应体系,即在 25 μL 反应
体系中加入 12. 5 μL 2xQuantiTect Probe RT-PCR
Master Mix(含终浓度 4. 0 mmol / L 的 Mg2 + ),1. 5
μL MgCl2 (25 mmol / L),0. 875 μL 引物 HLV-F
(20 μmol / L),0. 875 μL 引物 HLV-R(20 μmol /
L),0. 625 μL探针 HLV-P(20 μmol / L),0. 25 μL
QuantiTect RT Mix,1 μL RNA (20 ng / μL ~ 200
ng / μL),RNase Free dH2O补至 25 μL。
2. 3　 灵敏度对比试验及标准曲线的构建
灵敏度试验结果表明,HpLVd 的实时荧光
RT-PCR 检测低限是 20 pg(图 5) 。 琼脂糖凝胶
电泳观察,可看到明显的浓度梯度谱带,其可观
察到的低限为 200 pg(图 6) 。 由此可知,实时
荧光 RT-PCR 的灵敏度比普通 RT-PCR 琼脂糖
凝胶电泳观察高 10 倍。
　 　 通过对已知浓度梯度的总 RNA 进行实时
荧光 RT-PCR 检测发现,模板浓度越高,Ct 值越
小,3 个平行试验结果显示,RNA 模板浓度与 Ct
值极其相关(R2 = 0. 996 8) ,结果见图 7。
074
　
　 5 期 　 　 郭立新,等:啤酒花潜隐类病毒的实时荧光 RT-PCR检测
Fig. 5　 Relative sensitivity of the real-time fluorescent RT-PCR assays for HpLVd
ΔRn: Increased value of fluorescent signals. No detectable fluorescence for the RNA of 2 pg, 0. 2 pg and 0. 02 pg.
Fig. 6　 Relative sensitivity of agarose gel electrophoresis for the RT-PCR products
1 -8: 200 ng, 20 ng, 2 ng, 200 pg, 20 pg, 2 pg, 0. 2 pg, 0. 02 pg of total RNA; 9: Water;
10: Negative control; 11: Positive control; M: DL 2 000.
Fig. 7　 Standard curve obtained for the total RNA quantification
174
　
植物病理学报 42 卷
Fig. 8　 Detection of HpLVd from field samples using real-time fluorescent RT-PCR assay
ΔRn: Increased value of fluorescent signals. The RNA of J and water produced no detectable fluorescence.
2. 4　 田间样品检测
从图 8 可知,田间采集到的 29 份啤酒花样品
通过实时荧光 RT-PCR反应,均检出 HpLVd(Ct值
为 15. 160 ~ 32. 729),而水和阴性对照荧光强度没
有变化,阳性对照 Ct值为 22. 164。
3　 讨论
本研究建立的 HpLVd实时荧光 RT-PCR检测
方法,在 25 μL 反应体系中,总 RNA 含量达到 20
pg就能检测出来,这与 Guo等[15]建立的 ASGV实
时荧光 RT-PCR 检测方法、Salmon 等[16,17]建立的
ASPV 和 ACLSV 实时荧光检测方法所得结论一
致。 Luigi等[19]建立的 PLMVd 实时荧光 RT-PCR
检测方法,其检测低限是 1 fg 的靶 RNA。 Boon-
ham等[18]利用实时荧光 RT-PCR技术检测 PSTVd
时发现其灵敏度比分子杂交高 1000 倍。 Guo
等[15]在检测 ASGV 时发现,实时荧光 RT-PCR 法
比普通 RT-PCR法灵敏度高 10 倍,与本研究所得
结论一致。
实时荧光 RT-PCR技术与分子杂交、普通 RT-
PCR法相比,具有操作简便、快速、特异、灵敏等优
点,能弥补以往 HpLVd检测方法存在的不足之处,
具有较好的应用前景。 目前实时荧光 RT-PCR 技
术已广泛用于病毒检测,但关于类病毒的检测报道
较少。 本研究建立的 HpLVd实时荧光 RT-PCR检
测方法,为啤酒花潜隐类病毒的检测鉴定提供了更
加准确可靠、灵敏快速的检测技术,可为其他类病
毒检测提供借鉴。
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责任编辑:于金枝
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