全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(3): 262鄄269(2011)
收稿日期: 2010鄄08鄄09; 修回日期: 2011鄄02鄄20
基金项目: 现代农业产业技术体系建设专项资金项目(nycytx鄄024); 公益性行业(农业)科研专项(nyhyzx07鄄019); 福建省自然科学基金
资助项目(2008J0048)
通讯作者: 陈如凯, 教授, 主要从事甘蔗遗传育种、作物生理遗传与分子育种研究; Tel: 0591鄄83768288, E鄄mail: fafu948@126. com
第一作者: 高三基 ( 1973 - ), 男, 福建龙海人, 副研究员, 博士; 主要从事甘蔗病原分子生物学与基因工程研究; E鄄mail:
gsanji@163. com。
甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因克隆及其
实时荧光 RT鄄PCR检测
高三基, 杨 帆, 陈平华, 王恒波, 徐景升, 陈如凯*
(福建农林大学农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室, 福州 350002)
摘要: 甘蔗黄叶病毒( Sugarcane yellow leaf virus, SCYLV)引起的甘蔗黄叶病是一种新的全球性病毒病害。 本文以
YLSCPF1 和 YLSCPR591 为引物,采用 RT鄄PCR方法克隆了甘蔗黄叶病毒福建分离物(CHN鄄FJ1)外壳蛋白(CP)基因,编码
196个氨基酸。 分析不同地理来源的 SCYLV病毒分离物 cp基因核苷酸及其推导编码的氨基酸序列,同源性达 95%以上。
根据 cp基因的保守序列,设计 1 对特异性引物和 TaqMan 探针,建立了 SCYLV 的 TaqMan 实时荧光 RT鄄PCR 方法。 结果
表明,检测下限为初始质粒模板 DNA 1 000 拷贝 / 滋L(约 3. 61 fg / 滋L),比常规 PCR方法的灵敏度提高 100 倍。 检测甘蔗花
叶病毒、宿根矮化病菌和黑穗病菌,没有典型的扩增曲线和无 Ct 值。 应用实时荧光 RT鄄PCR、常规 RT鄄PCR 和组织印迹免
疫杂交(TBIA)对田间甘蔗叶片样品进行检测,阳性检出率分别为 100% 、61. 5%和 69. 2% ,表明该方法比常规 RT鄄PCR 和
TBIA具有更高的灵敏度,适合于对 SCYLV的检测。
关键词: 甘蔗黄叶病毒; 外壳蛋白; 序列分析; 实时荧光 RT鄄PCR
Cloning and detection of coat protein gene of Sugarcane yellow leaf virus by
real鄄time fluorescent RT鄄PCR摇 GAO San鄄ji, YANG Fan, CHEN Ping鄄hua, WANG Heng鄄bo, XU
Jing鄄sheng, CHEN Ru鄄kai 摇 (Fjian Agriculture and Forestry University, Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improve鄄
ment, Ministry of Agriculture, Fuzhou 350002, China)
Abstract: Sugarcane yellow leaf disease induced by Sugarcane yellow leaf virus (SCYLV) is a global viral
disease. The coat protein gene (cp) that deduced 196 amino acids from CHN鄄FJ1 isolate was cloned by RT鄄
PCR with the primers YLSCPF1and YLSCPR591. Sequence analysis showed that identity of nucleotides and
deduced amino acids shared above 95% among the isolates from different geographical origins. The primers
and TaqMan probe located on the conservative sequence of cp were designed for real鄄time fluorescent RT鄄
PCR. The studies demonstrated that the detection limit was 1 000 copies / 滋L (3. 61 fg / 滋L) of positive clo鄄
ning plasmid, was 100鄄fold higher than that of regular RT鄄PCR. Typical amplification curve and Ct value did
not appear in detection of Sugarcane mosaic virus (SCMV), the pathogens of sugarcane ratoon stunning di鄄
sease (Leifsonia xyli subsp. xyli) and sugarcane smut (Ustilago scitaminea Syd. ) . The detection of leaf sam鄄
ples from field were conducted by real鄄time fluorescent RT鄄PCR, regular RT鄄PCR as well as tissue blot immu鄄
noassay (TBIA) and positive results reached 100% , 61. 5% and 69. 2% , respectively. The real鄄time fluores鄄
cent RT鄄PCR was more sensitive and reliable method for detection of SCYLV as compared with regular RT鄄
PCR and TBIA.
Key words: Sugarcane yellow leaf virus; coat protein; sequence analysis; real鄄time fluorescent RT鄄PCR
摇
摇 3 期 摇 摇 高三基,等:甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因克隆及其实时荧光 RT鄄PCR检测
中图分类号: S432. 41; S435. 661摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 0412鄄0914(2011)03鄄0262鄄08
摇 摇 甘蔗黄叶病毒 ( Sugarcane yellow leaf virus,
SCYLV)属于黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属(Po鄄
lerovirus),病毒粒子二十面对称体,直径 24 ~
29 nm,由蛋白质外壳及其包裹着的一条单链、正
义的 RNA构成,病毒基因组大小近 6. 0 kb,有 6 个
已明确的开放阅读框(ORF0 ~ ORF5)和 3 个非编
码区,RNA 3忆端无 Poly(A)尾序[1,2],其中 ORF3
编码病毒外壳蛋白(CP)。 SCYLV 自然寄主为甘
蔗属中的热带种(Saccharum officinarum)、大茎野
生种 ( Saccharum robustum)、中国种 ( Saccharum
sinensis)和割手密(Saccharum spontaneum),实验
寄主包括蔗茅属(Erianthus sp. )、小麦、燕麦、大
麦、水稻、玉米和高粱[3 ~ 5]。 自然条件下,SCYLV
的传播主要依赖甘蔗蚜虫(Melanaphis sacchari)以
持久性方式传播,玉米叶蚜(Rhopalosiphum mai鄄
dis)、水稻根际蚜虫(Rhopalosiphum rufiabdomina鄄
lis)和甘蔗绵蚜(Ceratovacuna lanigera Zehntner)
也是 SCYLV传播媒介,长距离扩散则随感病植株
的无性繁殖材料传播[3,5,6]。 目前,多数甘蔗种植
国家或地区都有甘蔗感染 SCYLV 的报道,我国的
主要蔗区也有发生[7,8]。
为防止 SCYLV 随植物材料在国内外传播扩
散,建立快速、准确、高效的病毒检测技术十分必
要。 目前,鉴定甘蔗 SCYLV 常用方法有血清学技
术和 RT鄄PCR方法。 血清学方法,如酶联免疫吸附
法(ELISA)和组织印迹免疫杂交(TBIA),具有操
作简单、高通量的优点,但需要制备高质量的血清。
RT鄄PCR方法需要进行 PCR 后处理,接触溴化乙
锭(EB)等有毒试剂。 随着分子检测技术的发展,
实时荧光 RT鄄PCR ( real鄄time fluorescent RT鄄PCR)
以其高灵敏度、高特异性和高准确度的优点,被广
泛应用于植物病害的检测。 本研究在克隆甘蔗黄
叶病毒福建分离物外壳蛋白基因并进行序列分析
的基础上,建立了以 TaqMan 为探针的实时荧光
RT鄄PCR检测方法,以期为甘蔗黄叶病抗病鉴定和
甘蔗引种检疫提供技术参考。
1摇 材料与方法
1. 1摇 材料
从福建农林大学农业部甘蔗遗传育种重点开
放实验室试验田 (福州)采集甘蔗品系福农 96鄄
0907(FN96鄄0907),植株最高可见肥厚带叶( + 1
叶)为实验材料,用于克隆甘蔗黄叶病毒外壳蛋白
基因。 另外,从田间取 13 个甘蔗品种(系)植株叶
片作为实时荧光 RT鄄PCR方法验证材料,并分别以
感病 FN96鄄0907 及其健康植株叶片(种植在检疫
温室)作为阳性和阴性对照。 本文所用黑穗病菌
DNA为本实验室保存,甘蔗宿根矮化病(RSD)病
菌 DNA 由美国农业部 Houma 甘蔗育种站潘永保
博士提供,SCYLV鄄IgG 多克隆抗体由美国明尼苏
达大学 Lockhart教授惠赠,常规 RT鄄PCR检测所用
引物序列由美国糖业公司 Irey博士提供。
1. 2摇 试剂
TRIZOL襆 RNA提取试剂购自 Ivitrigen 公司,
M鄄MULV 逆转录酶及相关 cDNA 合成试剂购自
Promega公司,pMD18鄄T 载体、常规 PCR 试剂、EX
Taq酶以及实时荧光 PCR试剂(Premix EX TaqTM,
产品号 DRR039A)购自 TaKaRa 公司。 碱性磷酸
酶羊抗兔 IgG 购自 Sigma公司,脱脂奶粉购自武汉
博士德生物工程公司,硝酸纤维膜购自 Amersham
公司。 引物和 TaqMan 探针由上海闪晶分子生物
技术研究所合成。
1. 3摇 方法
1. 3. 1摇 甘蔗黄叶病毒 cp 基因克隆及序列分析
甘蔗叶片总 RNA提取根据 TRIZOL襆 RNA提取试
剂说明书完成,甘蔗黄叶病毒 cp 基因的克隆参考
wang等[9]的方法。 利用 SCYLV鄄CP 基因同源性
设计 1 对引物用于 RT鄄PCR 基因克隆,上游引物
YLSCPF1 序列为 5忆鄄 ATGAATACGGGCGCTAAC鄄
3忆,下游引物 YLSCPR591 序列为 5忆鄄 CTATTTGG鄄
GATTCTGGAAAAG鄄 3忆。 以 YLSCPR591 为引物
进行 RT 反应,获得 cDNA 进一步 PCR 扩增目的
片段,PCR 产物纯化后连接到 pMD18鄄T 载体上,
随后 pMD18鄄CP重组子经过酶切及核苷酸测序验
证。 将 cp基因核苷酸及其编码的氨基酸序列进行
Blast分析,然后用 DNAMAN 软件构建不同地理
来源 SCYLV病毒分离物的同源性树状图。
1. 3. 2摇 实时荧光 RT鄄PCR引物与探针设计摇 采用
Primer premier 5 和 Oligo 6 软件,在其保守区域设
计特异性引物和 TaqMan 荧光探针。 探针 5忆端标
记的荧光报告基团是 FAM (6鄄羧基荧光素),3忆端
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摇
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标记荧光淬灭基团为 TAMRA(6鄄羧基四甲基罗丹
明),TaqMan探针 SCYLV鄄2Probe 序列为 5忆鄄FAM鄄
CGCAACTCCAGGTGCAATCGC鄄TAMRA鄄3忆, 引
物序列分别为 SCYLV鄄2F:5忆鄄 TTCAGTATAACT鄄
CATGCTCCTCCG鄄3忆;SCYLV鄄2R:5忆鄄 ACTTTCT鄄
TGGCGTTCCTCTTG鄄3忆,扩增片段长度为 130 bp。
1. 3. 3摇 实时荧光 RT鄄PCR反应摇 反转录反应体系
及反应条件:反应体系为 25 滋L,含 1. 0 滋L RNA
(约 2. 0 滋g / 滋L)、1. 0 滋L SCYLV鄄2R 引物 (10
滋mol / L)和 8. 0 滋L DEPC 水加入到无 RNase 的
PCR管中,70益 15 min 后,冰浴 2 min。 随后加入
5. 0 滋L 5 伊 反转录反应缓冲液 (含 Mg2 + ),10
mmol / L dNTPs 1. 0 滋L, 10 U / 滋L RNase 抑制剂
0. 5 滋L, 200 U / 滋L M鄄MLV 反转录酶 1. 0 滋L,用
无 RNase水补足至 25 滋L。 cNDA 扩增反应条件:
42益 1 h,75益 8 min。 反应结束后,cDNA 直接进
行实时荧光 PCR检测,或者放于 -20益保存备用。
荧光 PCR反应体系及反应条件:采用 TaKaRa
公司 Premix Ex TaqTM实时荧光 PCR试剂盒对 cD鄄
NA或质粒 DNA 进行实时荧光 PCR 扩增,反应体
系为 25 滋L,含 Premix Ex TaqTM 12. 5 滋L, 10
滋mol / L上、下游引物各 1. 0 滋L、10 滋mol / L Taq鄄
Man探针 1. 0 滋L;cDNA模板 1. 0 滋L;用无 RNase
水补足至 25 滋L。 然后用 MiniOpticonTM荧光检测
系统(Bio鄄Rad公司,美国)按下列反应参数进行检
测:95益 10 s预变性,95益 5 s,60益 30 s 扩增 45
个循环,在 60益进行单点荧光检测。
1. 3. 4摇 实时荧光 RT鄄PCR反应的灵敏度分析摇 含
有完 整 SCYLV鄄CP 基 因 序 列 的 质 粒 DNA
(pMD18T鄄CP),经过单酶切、胶回收后测定核酸浓
度,作为定量的外标准品。 取终浓度为 10 ~ 108 拷
贝 / 滋L不同稀释倍数的外标准品进行标准曲线的
绘制和灵敏度测验。
1. 3. 5摇 实时荧光 RT鄄PCR反应的特异性及重复性
测试摇 以 SCYLV鄄2R 为引物,分别以感 SCYLV、
SCMV 甘蔗叶片总 RNA 以及健康植株叶片总
RNA(阴性对照)为模板,在逆转录酶作用下反转
录成 cDNA。 反转录获得的 cDNA 连同甘蔗叶片
总 DNA、 RSD 病 菌 DNA、 黑 穗 病 菌 DNA、
pMD18T鄄CP阳性质粒(阳性对照)和 ddH2O(空白
对照)为模板,进行实时荧光 PCR 检测,以验证方
法的特异性。 另外,分别选择 107、105、103 拷贝 /
滋L 3 个不同浓度 pMD18鄄CP 质粒标准品,进行
TaqMan实时荧光 RT鄄PCR 反应,每个浓度质粒标
准品设 4 个重复反应,以验证方法的重现性。
1. 3. 6 摇 常规 RT鄄PCR 及 TBIA 检测 摇 常规 RT鄄
PCR 及 TBIA检测参照 Gao等[8,10]的实验方法。
2摇 结果与分析
2. 1摇 cp基因的克隆及序列分析
以 YLSCPF1 和 YLSCPR591 为特异性引物,
以感病 FN96鄄00907(病毒分离物 CHN鄄FJ1)叶片总
RNA为模板,RT鄄PCR 扩增出 591 bp 的特异性条
带。 RT鄄PCR产物经过回收、连接、转化大肠杆菌
和酶切鉴定获得重组子 pMD18T鄄CP。 测序结果表
明获得 SCYLV 病毒基因组 cp 全长基因,核苷酸
序列(GenBank 登录号 DQ302757)编码 196 个氨
基酸残基。 核苷酸序列及其编码的氨基酸与已发
表的其他分离物的同源性分别达 95%和 96%以
上,与来自美国(A 和 Haw1)、巴西(BRA1)、印度
( IND)、澳大利亚(Aus1)、台湾(Taw1)、哥伦比亚
(COL4)等国家或地区的部分病毒分离物同源性
达 100% ,表明 SCYLV病毒的 CP基因具有较高同
源性(图 1)。
2. 2摇 实时荧光 RT鄄PCR灵敏度分析
应用 Primer Premier 5 和 Oligo 6 生物信息学
软件设计了 1 对特异性引物 ( SCYLV鄄2F 和
SCYLV鄄2R ) 和 TaqMan 荧 光 探 针 ( SCYLV鄄
2Probe)用于实时荧光 RT鄄PCR检测。 将经单酶切
纯化后的 pMD18T鄄CP 重组质粒 DNA 以 10 倍梯
度稀释成 10 ~ 108拷贝 / 滋L,然后进行实时荧光
PCR检测。 从扩增曲线和标准曲线(图 2)可见,
pMD18T鄄CP质粒标准品的浓度从 10 ~ 108拷贝 /
滋L具有良好的线性关系,相关系数 R2 = 0. 999,在
Ct值为 35 以内得到方法的检出限约为 1 000 拷
贝 / 滋L(约 3. 61 fg / 滋L)。 随后将实时荧光 PCR检
测产物用 4%琼脂糖电泳检测并用溴化乙锭染色,
从图 3 可见,浓度为 108 到 105 拷贝 / 滋L 的 4 个标
准品都能扩增出明显的靶带(130 bp),104 拷贝 / 滋L
靶带微弱、模糊,表明仅能检测到 105 拷贝 / 滋L DNA
模板,约 0. 361 pg。 另外,以 YLS111 和 YLS462 为
引物,采用常规 PCR 检测不同浓度梯度 pMD18T鄄
CP重组质粒 DNA,PCR产物用 1%琼脂糖电泳检
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摇 3 期 摇 摇 高三基,等:甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因克隆及其实时荧光 RT鄄PCR检测
Fig. 1摇 Homology trees based on nucleotide and amino acid sequence of
coat protein of CHN鄄FJ1 isolate of SCYLV and selected isolates from
different geographical origins
Homology tree of nucleotides and amino acid sequence of coat protein showed in A and B, respectively.
测,模板最低限也仅达 105 拷贝 / 滋L,片段的大小
为 352 bp(图 4)。 可见,荧光 PCR 较普通 PCR 通
过琼脂糖凝胶电泳观察的灵敏度高 2 个数量级。
2. 3摇 实时荧光 RT鄄PCR特异性及重现性的测试
以 SCYLV鄄2R 为引物,分别以感染 SCYLV、
SCMV甘蔗叶片总 RNA 和健康植株叶片总 RNA
为模板逆转录成 cDNA,随后连同叶片总 DNA、
RSD病菌 DNA、黑穗病菌 DNA、pMD18T鄄CP质粒
(阳性对照)和 ddH2O在相同条件下进行实时荧光
PCR检测,结果仅有感 SCYLV 植株总 RNA 逆转
录后 cDNA 和 pMD18T鄄CP 质粒有典型的扩增曲
线,Ct值分别为 11 和 21,其他 cDNA或 DNA模板
均没有获得荧光积累。表明本方法具有良好的特
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摇
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Fig. 2摇 Dynamic (A) and standard cure (B) of pMD18T鄄CP
plasmid by real鄄time fluorescent PCR
1 -8: Template varied from 108 to 10 copies; 9: Negative control; 10: ddH2O (Blank control) .
Fig. 3摇 Agarose gel electrophoresis detection for products of real鄄time fluorescent PCR
M: 20 bp DNA ladder marker; 1 -8: Template varied from 108 to 10 copies; 9: Negative control; 10: ddH2O.
Fig. 4摇 Agarose gel electrophoresis detection for products of
regular PCR using YLS111 and YLS462 primers
M: DL 2 000 bp DNA ladder marker; 1 -8: Template varied from 108 to 10 copies; 9: Negative control; 10: ddH2O.
异性。 分别以 103、105 和 107 拷贝 / 滋L 3 种不同
浓度的 SCYLV鄄CP质粒标准品为模板,进行实时
荧光 PCR 检测,结果 3 种不同浓度的 pMD18T鄄
CP质粒标准品的 Ct 值变异系数均小于 2% (表
1),说明本方法具有很好的重现性。
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摇 3 期 摇 摇 高三基,等:甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因克隆及其实时荧光 RT鄄PCR检测
Table 1摇 Test of reproducibility of the real鄄time fluorescent PCR
Plasmid concentration
(copies / 滋L)
Replicate
1 2 3 4
Mean 依 Std CV / %
107 12. 19* 12. 51 11. 95 12. 35 12. 25 依0. 24 1. 95
105 21. 36 22. 06 21. 18 21. 93 21. 63 依0. 43 1. 98
103 29. 32 29. 79 29. 43 28. 59 29. 28 依0. 50 1. 72
“*冶: The figures were Ct value in this table.
2. 4摇 田间样品的检测
应用本研究建立的 TaqMan实时荧光 RT鄄PCR
方法,结合常规 RT鄄PCR技术(引物为 YLSF111 和
YLSR462)和血清学 TBIA检测技术对福建省福州
市 13 个田间甘蔗叶片样品进行 SCYLV 检测。 由
表 2 可见,实时荧光 RT鄄PCR方法检测结果均为阳
性(Ct 值 < 35),而常规 RT鄄PCR 和 TBIA 阳性检
出率分别为 61. 5%和 69. 2% 。 这说明 TaqMan 实
时荧光 RT鄄PCR 比常规 RT鄄PCR 和 TBIA 检测技
术的灵敏度高。
3摇 讨论
由于病毒基因型或株系的划分受到样本数量
和地理来源等因素的限制,SCYLV 至今没有统一
的分类标准。 但是,随着越来越多不同国家或地区
的 SCYLV分离物得到鉴定,也许会发现新的基因
型,这将有利于 SCYLV 基因型或株系的合理分
类。 最初,Abu 等[11, 12]研究发现至少有 3 种基因
型,即古巴(CUB)、法国 R佴union 岛(REU)、巴西鄄
秘鲁基因型(BRA鄄PER),这些病毒基因型有明显
的地理分布差异,且有不同的侵染能力和毒性[13]。
随后,Viswanathan 等[14]克隆了 22 个印度病毒分
离物的部分 ORF1 和 ORF2 序列以及全长 ORF3
序列,结合 GenBank 其他病毒分离物的相应序列
进行同源性和进化树分析,结果认为,印度本土的
甘蔗黄叶病毒明显区别于其他 3 种基因型,是一种
Table 2摇 Detection of Sugarcane yellow leaf virus form field sugarcane leaves
Variety Symptom Regular RT鄄PCR TBIA Real鄄time RT鄄PCR* Ct value
FN02鄄2010 S + + 鄄 + 24. 55
FN99鄄20169 S + 鄄 + + 27. 47
FN02鄄3924 S + 鄄 + + 32. 13
GF98鄄296 S - + + + 33. 12
GN99鄄591 S + 鄄 鄄 + 28. 95
GY6 S - + + + 24. 92
MT86鄄05 S + + + + 18. 14
MT96鄄6016 S - + + + 23. 50
RB76鄄5418 S - + + + 22. 98
Roc16 S - + 鄄 + 31. 69
YG16 S - 鄄 鄄 + 29. 68
YG18 S + + + + 13. 86
YZ99鄄91 S - 鄄 + + 23. 17
Positive control(FN96鄄0907) S + + + + 13. 13
Negative control(Virus鄄free plant) S - 鄄 鄄 鄄 鄄
Blank control(ddH2O) / 鄄 鄄 鄄 鄄
“*冶: The detection results showed positive as Ct value was less than 35 cycles. S + and S - indicated symptomatic and
asymptomatic leaves in sugarcane plants. “ + 冶 and “ 鄄冶 stand for positive and negative signal, respectively.
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新的基因型( IND)。 最近,Wang等[15]克隆了一个
接近全长的中国 SCYLV 病毒分离物 ( SCYLV鄄
CHN1)基因组序列,序列分析认为,该病毒基因组
核苷酸序列明显不同于已报道的 SCYLV 基因型
序列,是另一种新的病毒基因型。 笔者分析了来自
我国桂、粤、滇、琼、闽蔗区的 10 个不同 SCYLV 病
毒分离物的 ORF1 至 ORF5 核苷酸序列,包括
CHN鄄FJ1 分离物,它们之间的同源性为 98. 6% ~
99. 5% ,属于 BRA鄄PER基因型(另文发表)。 本实
验设计的检测引物和探针与 GenBank 中绝大多数
SCYLV分离物的序列完全匹配,上游引物及探针
序列与所有病毒分离物完全一致,下游引物的 5忆
端序列仅前 2 个核苷酸与 CHN1 分离物(中国)和
SCYLV鄄CB系列分离物(印度)的核苷酸有差异,
因此可以推测本研究建立的实时荧光 RT鄄PCR 方
法可以检测到覆盖多数 SCYLV病毒基因型。
摇 摇 实时荧光 RT鄄PCR与常规 RT鄄PCR相比,具有
快速、灵敏、精确、特异、高通量等优点,在其他作物
病毒病原检测中得到广泛应用。 本实验建立的
Taqman 探针实时荧光 RT鄄PCR 检测技术以甘蔗
pMD18T鄄CP重组质粒为标准品,在 35 个循环内可
检测到约 3. 61 fg / 滋L 的 pMD18T鄄CP 质粒 DNA,
比常规 RT鄄PCR 的灵敏度高 100 倍。 Korimbocus
等[16]应用 Taqman探针实时荧光 RT鄄PCR 对甘蔗
SCYLV病毒检测,结果表明实时荧光 RT鄄PCR 检
测灵敏度比常规高 100 倍。 Gonc觭alves 等[17]利用
分子信标(molecular beacons)为探针的荧光定量
检测技术可检测到最低含量 100 fg 来自感病植株
或蚜虫的纯化病毒,检测灵敏度比常规高 10 倍。
Zhu 等[18] 报道应用 SYBR Green 荧光定量 RT鄄
PCR检测不同抗病性甘蔗品种叶片病毒含量,发
现 SCYLV滴度的差异至少 104 倍;有病害症状的
成熟叶片 SCYLV 滴度比无症状的叶片高 103 至
104 倍,对新生长叶片而言,有无病害症状的叶片
间差异达 30 倍左右。
对田间甘蔗样品检测也证实了实时荧光 RT鄄
PCR比常规 RT鄄PCR 和血清学 TBIA 检测技术具
有更高的灵敏度。 Korimbocus等[16]也有类似研究
结果,利用传统的 RT鄄PCR 和 TBIA 检测技术,20
个甘蔗样品中,有 8 个甘蔗品种检测为阴性,而实
时荧光 RT鄄PCR 检测呈阳性,Ct 值小于 40 循环
数。 不同病毒检测方法的灵敏度和检测结果有所
差异,因此对病毒检测鉴定应采用血清学反应与分
子检测技术相结合。 本研究建立的 SCYLV 实时
荧光 RT鄄PCR检测方法,为甘蔗黄叶病的早期诊断
和病原鉴定提供了准确可靠、灵敏快速的检测
技术。
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于金枝
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