全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４４(５): ５１２￣５２０(２０１４)
收稿日期: ２０１４￣０２￣２６ꎻ 修回日期: ２０１４￣０６￣２７
基金项目: 林业公益性行业专项资助项目(２０１１０４０５４)
通讯作者: 张力群ꎬ教授ꎬ博导ꎬ主要从事细菌分子遗传学与植物病害生物防治研究ꎻＴｅｌ:０１０￣６２７３１４６４ꎬＥ￣ｍａｉｌ: ｚｈａｎｇｌｑ＠ｃａｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎻ
贺 伟ꎬ教授ꎬ博导ꎬ主要从事林木病害致病机制研究ꎻＴｅｌ:０１０￣６２３３８１２７ꎬＥ￣ｍａｉｌ: ｈｅｗｅｉ＠ｂｊｆｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
第一作者: 杨 莉ꎬ女ꎬ四川甘洛人ꎬ在读博士ꎬ主要从事植物病害致病机制和细菌分子遗传学的研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｙａｎｇｐｉ１７＠１６３.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１４.０５.００９
ＩＩＩ型分泌系统是欧美杨溃疡病菌
Ｌｏｎｓｄａｌｅａ ｑｕｅｒｃｉｎａ重要的致病因子
杨 莉１ꎬ 张力群２∗ꎬ 贺 伟１∗ꎬ 常聚普３ꎬ 郭利民３
( １北京林业大学教育部森林培育与保护重点实验室ꎬ北京 １０００８３ꎻ
２中国农业大学农业部植物病理学重点开放实验室ꎬ北京 １００１９３ꎻ ３濮阳市林业科学院ꎬ 濮阳 ４５７０００)
摘要:欧美杨溃疡病是由 Ｌｏｎｓｄａｌｅａ ｑｕｅｒｃｉｎａ(原称 Ｂｒｅｎｎｅｒｉａ ｑｕｅｒｃｉｎａꎬＥｒｗｉｎｉａ ｑｕｅｒｃｉｎａ)引起的一种细菌性病害ꎬ２００５ 年首
次在我国河南发现ꎬ对我国杨树产业造成了严重影响ꎮ 菌株 Ｎ￣５￣１是从河南濮阳自然发病杨树枝条上分离到的致病菌株ꎮ
根据 Ｎ￣５￣１菌株全基因组测序的初步结果分析ꎬ发现 Ｎ￣５￣１具有完整的 ＩＩＩ 型分泌系统(Ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍꎬＴ３ＳＳ)ꎮ
该系统与植物病原菌 Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ ＣＦＢＰ１４３０和 Ｄｉｃｋｅｙａ ｄａｄａｎｔｉｉ ３９３７的 Ｔ３ＳＳ高度相似ꎬ共由 ２６个基因编码ꎬ共约 ２３
ｋｂꎬ其中 ９个为保守的 ｈｒｃ基因ꎮ 将 Ｌ. ｑｕｅｒｃｉｎａ Ｎ￣５￣１ 菌株 Ｔ３ＳＳ 中保守的结构基因 ｈｒｃＶ 进行缺失突变ꎬ生物测定发现
ΔｈｒｃＶ突变体对“中林 ４６杨”(Ｐｏｐｕｌｕｓ ×ｅｕｒａｍｅｒｉｃａｎａ ‘Ｚｈｏｎｇｌｉｎ ４６’)２ 年生枝条的致病力明显下降ꎬ而互补菌株 ＨＢｈｒｃＶ
致病力与野生菌株保持一致ꎮ 表明该菌中 Ｔ３ＳＳ是病原细菌重要的致病性因子ꎮ 菌株 Ｎ￣５￣１中 ｈｒｃＶ基因的突变导致诱导
烟草过敏性坏死反应能力丧失ꎬ但并没有影响菌株的生长速率、游动性和生物膜的形成ꎮ 本研究首次证明了 Ｌ. ｑｕｅｒｃｉｎａ
Ｎ￣５￣１菌株的 Ｔ３ＳＳ是重要的致病因子ꎮ
关键词:欧美杨溃疡病ꎻ Ｌｏｎｓｄａｌｅａ ｑｕｅｒｃｉｎａꎻ Ⅲ型分泌系统
Ｔｙｐｅ Ⅲ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｉｓ ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｐｏｐｌａｒ ｃａｎｋｅｒ
ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｌｏｎｓｄａｌｅａ ｑｕｅｒｃｉｎａ　 ＹＡＮＧ Ｌｉ１ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｌｉ￣ｑｕｎ２∗ꎬ ＨＥ Ｗｅｉ１∗ꎬ ＣＨＡＮＧ Ｊｕ￣ｐｕ３ꎬ ＧＵＯ
Ｌｉ￣ｍｉｎ３ 　 ( １ Ｔｈｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ꎬ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎꎬ ａｎｄ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔ
Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８３ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｔｈｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ Ｍｉｎｉｓ￣
ｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ ａｎｄ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９３ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ３ ＰｕＹａｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅꎬ Ｐｕｙａｎｇ ４５７０００ꎬ Ｃｈｉｎａ )
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｐｏｐｌａｒ ｃａｎｋｅｒ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｌｏｎｓｄａｌｅａ ｑｕｅｒｃｉｎａ (ｆｏｒｍｅｒｌｙ Ｂｒｅｎｎｅｒｉａ ｑｕｅｒｃｉｎａ ｏｒ Ｅｒｗｉｎｉａ ｑｕｅｒｃｉｎａ) ｗａｓ
ｆｏｕｎｄ ｉｎ Ｈｅｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ Ｃｈｉｎａ ｉｎ ２００５. Ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｌｏｃａｌ ｐｏｐｌａｒ ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｓｅｒｉｏｕｓｌｙ. Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎ
Ｎ￣５￣１ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐｏｐｌａｒ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｏｆ ｃａｎｋｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ. Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔꎬ ａ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ (Ｔ３ＳＳ) ｃｌｕｓｔｅｒꎬ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｔｈａｔ ｉｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ
Ｄｉｃｋｅｙａ ｄａｄａｎｔｉｉ ３９３７ ａｎｄ Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ ＣＦＢＰ１４３０ꎬ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ
Ｎ￣５￣１. Ｔｈｅ Ｔ３ＳＳ ｏｆ Ｎ￣５￣１ ｈａｄ ａｂｏｕｔ ２３ ｋｂ ｉｎ ｓｉｚｅ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ２６ ｇｅｎｅｓꎬ ９ ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｈｒｃ
ｇｅｎｅｓ. Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ Ｔ３ＳＳ ｉｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ Ｎ￣５￣１ꎬ ａ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ３ＳＳ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｇｅｎｅ
ｈｒｃＶ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｍｕｔａｎｔ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ. Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙ ｏｎ ｐｏｐｌａｒ ｂｒａｎｃｈｅｓ (Ｐｏｐｕｌｕｓ ×ｅｕｒａｍｅｒ￣
ｉｃａｎａ ‘Ｚｈｏｎｇｌｉｎ ４６’) ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ΔｈｒｃＶ ｍｕｔａｎｔ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｌｅｓｓ ｖｉｒｕｌｅｎｔ (ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎｄｅｘ ３３.３) ｔｈａｎ
ｉｔｓ ｐａｒｅｎｔꎬ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｍｕｔａｎｔ ＨＢｈｒｃＶ ｒｅｓｔｏｒｅｄ ｔｈｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅ ｌｅｖｅｌ (ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎｄｅｘｅｓ
ｗｅｒｅ ８５.６ ａｎｄ ８３.３ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ) . Ｔｈｅ ｈｒｃＶ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｂｏｌｉｓｈｅｄ ｔｈｅ ＨＲ ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎ ｔａｂａｃｃｏꎬ ｂｕｔ ｄｉｄ
　
　 ５期 杨 莉ꎬ等:ＩＩＩ型分泌系统是欧美杨溃疡病菌 Ｌｏｎｓｄａｌｅａ ｑｕｅｒｃｉｎａ重要的致病因子
ｎｏｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｒｏｗｔｈꎬ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｂｉｏｆｉｌｍ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ. Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ Ｔ３ＳＳ ｉｓ ａｎ ｅｓｓｅｎ￣
ｔｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｌ. ｑｕｅｒｃｉｎａ Ｎ￣５￣１.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｃａｎｋｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｐｏｐｌａｒꎻ Ｌｏｎｓｄａｌｅａ ｑｕｅｒｃｉｎａꎻ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ
中图分类号: Ｓ７６３.１３　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０５￣０５１２￣０９
　 　 １９６７ 年 Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ 和 Ｓｃｈｒｏｔｈ 首次报道了细
菌 Ｂｒｅｎｎｅｒｉａ ｑｕｅｒｃｉｎａ在美国加利福尼亚引起橡树
落花落果病( ｄｒｉｐｐｙ ｎｕｔ ａｎｄ ｄｒｉｐｐｙ ｂｕｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ
ｏａｋｓ) [１]ꎮ 随后 Ｓｏｒｉａ等报道 Ｂ. ｑｕｅｒｃｉｎａ 在西班牙
引起栎树落花落果病[２]ꎮ ２００５ 年我国河南濮阳首
次发现欧美杨溃疡病ꎮ 该病害的症状起初表现为
杨树树干形成层被破坏ꎬ随后树木皮层开裂ꎬ从裂
缝中流出大量汁液ꎬ树干韧皮部局部坏死ꎬ最后感
病树木病部枝条和树干顶梢枯死ꎬ严重影响树木的
健康生长ꎬ并导致树木材积和其他可利用部分减
少ꎮ 从河南濮阳自然发病的“中林 ４６”杨(Ｐｏｐｕｌｕｓ
×ｅｕｒａｍｅｒｉｃａｎａ ‘Ｚｈｏｎｇｌｉｎ ４６’)上经过分离纯化及
柯赫氏法则的验证ꎬ得到 ２ 株致病细菌菌株 Ｎ￣５￣１
和４￣４ꎮ 经 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列比对、生理生化特性测
定等ꎬ鉴定 Ｎ￣５￣１ 和 ４￣４ 均为 Ｂｒｅｎｎｅｒｉａ ｑｕｅｒｃｉｎａꎬ
这是我国首次分离到该病原细菌[３]ꎮ
　 　 目前对该病原菌的研究主要集中在系统发育
和快速检测ꎮ Ｈａｕｂｅｎ 等通过核酸序列比对ꎬ揭示
了肠杆菌科(Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ)欧文氏属(Ｅｒｗｉ￣
ｎｉａ)细菌在进化上存在分支ꎬ把该属中的一些细菌
单独列出归为 Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 和 Ｂｒｅｎｎｅｒｉａ 属ꎬ其
中 Ｅｒｗｉｎｉａ ｑｕｅｒｃｉｎａ、Ｅ. ａｌｎｉ、Ｅ. ｎｉｇｒｉｆｌｕｅｎｓ、Ｅ. ｐａｒａ￣
ｄｉｓｉａｃａ、Ｅ. ｒｕｂｒｉｆａｃｉｅｎｓ和 Ｅ. ｓａｌｉｃｉｓ 归为 Ｂｒｅｎｎｅｒｉａ
属[４]ꎮ ２０１２ 年 Ｂｒａｄｙ 等通过 １６Ｓ ｒＤＮＡ、 ｇｙｒＢ、
ｒｐｏＢ、ｉｎｆＢ和 ａｔｐＤ 基因的多位点序列分析(ｍｕｌｔｉ￣
ｌｏｃｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓꎬＭＬＳＡ)ꎬ以及 ＤＮＡ￣ＤＮＡ
分子杂交等研究发现 Ｂ. ｑｕｅｒｃｉｎａ 与 Ｂｒｅｎｎｅｒｉａ 属
其他细菌亲缘关系较远ꎬ将 Ｂ. ｑｕｅｒｃｉｎａ 独立为一
个新属ꎬ命名为 Ｌｏｎｓｄａｌｅａ[５]ꎮ Ｂ. ｑｕｅｒｃｉｎａ 更名为
Ｌ. ｑｕｅｒｃｉｎａꎮ 在快速检测方面ꎬＰｏｚａ￣Ｃａｒｒｉｏｎ 等设
计出 Ｂ. ｑｕｅｒｃｉｎａ 的特异性引物ꎬ建立了通过 ＰＣＲ
快速检测 Ｂ. ｑｕｅｒｃｉｎａ的方法[ ６ ]ꎮ 但到目前为止对
该细菌致病机制的研究尚未见报道ꎮ 　
　 　 在许多革兰氏阴性病原细菌中ꎬＩＩＩ 型分泌系统
(Ｔｙｐｅ Ⅲ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍꎬＴ３ＳＳ)被认为是重要的致
病性因子ꎮ Ｔ３ＳＳ的针状结构连接了细菌细胞和宿
主细胞ꎬ效应分子通过针状装置注入宿主细胞ꎬ破坏
或干扰宿主细胞内正常的生理代谢或抗性反应ꎬ从
而发挥其毒性作用[７]ꎮ Ｔ３ＳＳ通常由 ３０~４０ ｋｂ大小
的基因编码ꎬ以致病岛(ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｓｌａｎｄ)的形式
存在于细菌的质粒或染色体中[８]ꎮ ｈｒｃＶ是 Ｔ３ＳＳ中
保守的结构基因ꎬ参与了针状结构的编码ꎮ 在 Ｒａｌ￣
ｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ、 Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ.
ｏｒｙｚｉｃｏｌａ、 Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｃｉｔｒｕｌｌｉ ｘｊＬ１２ 等植物病原菌
中ꎬｈｒｃＶ与致病性有密切的关系ꎬ对 ｈｒｃＶ 的突变导
致了 Ｔ３ＳＳ的破坏及致病性的下降[９~１１]ꎮ 本文首次
报道了 Ｌ. ｑｕｅｒｃｉｎａ的 Ｔ３ＳＳꎬ并对 ｈｒｃＶ进行了突变ꎬ
探讨了 Ｎ￣５￣１中 Ｔ３ＳＳ与致病性的关系ꎬ以期为探索
欧美杨溃疡病病菌的致病机制奠定基础ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 供试菌株、质粒及培养条件
　 　 所用菌株、质粒及性状见表 １ꎮ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ 用 ＬＢ培养基 ３７℃培养 １６ ｈꎻ Ｌ. ｑｕｅｒｃｉｎａ Ｎ￣５￣
１菌株及其衍生菌株用 ＬＢ 培养基 ３０℃培养２４ ｈꎮ
所用抗生素终浓度分别为:卡那霉素(Ｋｍ)５０ μｇ /
ｍＬ、氯霉素(Ｃｍ)２０ μｇ / ｍＬ、庆大霉素(Ｇｍ)３０ μｇ /
ｍＬ、利福平(Ｒｉｆ)２０ μｇ / ｍＬꎮ ５￣溴￣４￣氯￣３￣吲哚￣β￣Ｄ￣
半乳糖苷(Ｘ￣Ｇａｌ)使用终浓度为 ４０ μｇ / ｍＬꎮ
１.２　 方法
１.２.１　 ＤＮＡ操作　 细菌基因组提取用 ＣＴＡＢ 法ꎮ
质粒的提取、酶切、连接、转化等方法均参照«分子
克隆实验指南»第 ３ 版[１２]ꎮ 核苷酸及其编码的氨
基酸序列通过 ＮＣＢＩ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ.
ｇｏｖ) 中的 Ｂｌａｓｔ 软件和 ＤＮＡＭＡＮ ７.０ 软件分析ꎮ
引物均购自北京天一辉远生物技术有限公司ꎮ
１.２.２　 Ｔ３ＳＳ ｈｒｃＶ 基因缺失突变体的构建　 根据
菌株 Ｎ￣５￣１的 ｈｒｃＶ基因(ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍ￣
ｂｅｒ:ＫＣ７７１２４６)侧翼序列设计缺失突变所需的 ２
对引物 ＨｒｃＶ３７ / Ｈｒｃｖ４９０和 Ｈｒｃｖ９４４ / ＨｒｃＶ１４３１(表
１)ꎮ 以野生菌 Ｎ￣５￣１ 基因组为模版ꎬ通过 ＰＣＲ 扩
增ꎬ得到长度为 ５１３ ｂｐ 和 ５０７ ｂｐ 的 ｈｒｃＶ 上下游
序列ꎬ 将这 ２ 个片段分别用 Ｓａｌ Ⅰ / ＢａｍＨ Ⅰ和
３１５
　
植物病理学报 ４４卷
ＢａｍＨ Ⅰ / ＸｂａⅠ双酶切、纯化后与用相应的酶切过
的自杀载体 ｐＥＸ１８Ｋｍ 连接ꎬ得到缺失突变载体
ｐＥＸ１８￣ｈｒｃＶꎮ 与野生菌株基因组上完整的 ｈｒｃＶ基
因相比ꎬｐＥＸ１８￣ｈｒｃＶ的 ｈｒｃＶ序列在阅读框内部缺
少了 ４０４ ｂｐꎮ
　 　 以转化了质粒 ｐＥＸ１８￣ｈｒｃＶ的Ｅ. ｃｏｌｉ ＤＨ５α作为
供体菌ꎬ野生菌株 Ｎ￣５￣１为受体菌ꎬ含 ｐＲＫ６００质粒的
Ｅ. ｃｏｌｉ ＤＨ５α为助手菌ꎬ通过三亲交配ꎬ将供体菌中
ｐＥＸ１８￣ｈｒｃＶ质粒导入野生菌株中ꎬ经过二次重组ꎬ在
含有 ５％蔗糖的Ｒｉｆ抗性平板上筛选得到 ｈｒｃＶ的缺失
突变体ꎮ 利用引物 ＨｒｃＶ３７/ ＨｒｃＶ１４３１对突变体进行
ＰＣＲ检测ꎬ电泳检查缺失突变体是否构建正确ꎮ
１.２.３　 ｈｒｃＶ基因互补载体的构建及互补菌株的获
得　 根据 ｈｒｃＶ 基因上下游序列设计互补引物
ＨｒｃＶＨＢｓ / ＨｒｃＶＨＢｘꎬ用野生菌株 Ｎ￣５￣１ 基因组为
模板ꎬ通过 ＰＣＲ扩增互补片段ꎮ 用 Ｓａｌ Ⅰ / Ｘｂａ Ⅰ
双酶切后纯化ꎬ１６℃过夜连接到 ｐＢＢＲ１ＭＣＳ￣２ 穿
梭质粒上ꎬ构建互补载体 ｐＢＢＲ￣ｈｒｃＶꎮ 通过三亲交
配将互补载体转入缺失突变体DｈｒｃＶ 中ꎬ获得互补
菌株 ＨＢｈｒｃＶꎮ
１.２.４　 生物检测野生菌株、突变体及互补菌株的
致病性　 将野生菌株 Ｎ￣５￣１、突变体 ΔｈｒｃＶ、突变体
互补菌株 ＨＢｈｒｃＶ 接种到液体 ＬＢ ３０℃摇培 ２４ ｈ
后ꎬ将菌液浓度稀释到 １０７ＣＦＵ / ｍＬꎬ接种到 ２ 年生
中林 ４６ 杨苗干上ꎮ 苗干被截成 ３０ ｃｍ 长枝段ꎬ用
自来水冲洗干净后ꎬ再用 ７０％酒精表面消毒ꎬ晾干
后用经过消毒的刀在枝条上划长约 １.０ ｃｍ 的伤
口ꎬ深及木质部表层ꎮ用移液器吸取０ .２ｍＬ的菌
Ｔａｂｌｅ １　 Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓꎬ ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
Ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ｓｏｕｒｃｅ ｏｒ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
Ｓｔｒａｉｎ
Ｌｏｎｓｄａｌｅａ ｑｕｅｒｃｉｎａ
Ｎ￣５￣１ Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅꎻ ＲｉｆＲ [３]
△ｈｒｃＶ ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ｈｒｃＶ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｌ. ｑｕｅｒｃｉｎａ Ｎ￣５￣１ꎻ ＲｉｆＲ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＨＢｈｒｃＶ △ｈｒｃＶ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐＢＢＲ￣ｈｒｃＶ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｈｒｃＶ ｇｅｎｅꎻ ＲｉｆＲꎻ ＫｍＲ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＤＨ５α Φ８０ｌａｃＺ△Ｍ１５△( ｌａｃＺＹＡ￣ａｒｇＦ)Ｕ１６９ ｈｓｄＲ１７ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｔｈｉ￣Ｉ [１３]
Ｐｌａｓｍｉｄ
ｐＥＸ１８Ｇｍ ｏｒｉＴ＋ ｓａｃＢ＋ꎬ ｇｅｎｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ＭＣＳ ｆｒｏｍ ｐＵＣ１８ꎻ ＧｍＲ [１４]
ｐＥＸ１８Ｋｍ ｏｒｉＴ＋ ｓａｃＢ＋ꎬ ｇｅｎｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ＭＣＳ ｆｒｏｍ ｐＵＣ１８ꎻ ＫｍＲ Ｔｈｉｓ ｌａｂ
ｐＥＸ１８￣ｈｒｃＶ ｐＥＸ１８Ｋｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｕｐ￣ｓｔｒｅａｍ ａｎｄ ｄｏｗｎ￣ｓｔｒｅａｍ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｒｃＶ ｇｅｎｅꎻＫｍＲ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐＢＢＲ１ＭＣＳ￣２ Ｂｒｏａｄ ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒꎻ ＫｍＲ [１５]
ｐＢＢＲ￣ｈｒｃＶ ｐＢＢＲ１ＭＣＳ￣２ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｈｒｃＶ ｇｅｎｅꎻ ＫｍＲ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐＲＫ６００ ＣｏｌＥ１ ｏｒｉＶꎻ ＲＰ４ꎻ ｔｒａ＋ꎻ ＲＰ４ ｏｒｉＴꎻ ｈｅｌｐｅｒ ｐｌａｓｍｉｄ ｉｎ ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ ｍａｔｉｎｇｓꎻ ＣｍＲ [１６]
Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′￣３′) ( ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ) ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ
ＨｒｃＶ３７ ５′￣ＡＧＴＣＧＡＣＴＣＧＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣ￣３′ ＳａｌⅠ
Ｈｒｃｖ４９０ ５′￣ＡＴＧＧＡＴＣＣ ＧＡＡＧＣＣＧＣＣＧＡＴＣＡＴＧＴＴＧ￣３′ ＢａｍＨⅠ
Ｈｒｃｖ９４４ ５′￣ＡＴＧＧＡＴＣＣ ＴＡＣＣＡＧＧＡＴＣＴＧＣＧＡＣＧＣＴＴＣ￣３′ ＢａｍＨⅠ
ＨｒｃＶ１４３１ ５′￣ＡＣＴＴＣＴＡＧＡＣＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＧＡＧＣＣＡＧＧ￣３′ ＸｂａⅠ
ＨｒｃＶＨＢｓ ５′￣ＡＡＧＴＣＧＡＣＧＡＴＡＧＧＴＣＡＴＣＴＧＣＴＧＣＡＡＧＴＣ￣３′ ＳａｌⅠ
ＨｒｃＶＨＢｘ ５′￣ＡＣＴＴＣＴＡＧＡＴＴＴＴＴＣＣＡＡＣＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＴＣ￣３′ ＸｂａⅠ
　 ＫｍＲꎬ ＣｍＲꎬ ＧｍＲ ａｎｄ ＲｉｆＲ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｋａｎａｍｙｃｉｎꎬ ｃｈｌｏｒｏｍｐｈｅｎｉｃａｌꎬ ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ ａｎｄ ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
４１５
　
　 ５期 杨 莉ꎬ等:ＩＩＩ型分泌系统是欧美杨溃疡病菌 Ｌｏｎｓｄａｌｅａ ｑｕｅｒｃｉｎａ重要的致病因子
液滴加于伤口处ꎬ保鲜膜包裹保湿ꎬ被接种的杨树
枝条在光照培养箱中保湿培养ꎮ 培养条件:光照
１２ ｈꎬ３０℃ꎻ黑暗 １２ ｈꎬ２５℃ꎬ相对湿度均为 ９０％ꎬ４８
ｈ后去掉保鲜膜ꎮ 每个菌株接 ９ 个枝段ꎬ每枝段接
一个点ꎬ试验重复 ３ 次ꎬ无菌水接种为阴性对照ꎮ
培养 １０ ｄ 后观察、记录发病情况ꎮ 按发病的严重
程度ꎬ将病情分为 ３级ꎬ０ 级接种伤口无发病症状ꎬ
木质部无病斑出现ꎻ１级接种点树皮变软、凹陷ꎬ无
明显脓液流出ꎬ 病斑长度 ０.１ ~ １.０ ｃｍꎻ２ 级被接种
的树皮伤口流出乳白色菌脓ꎬ病斑长度 １.１ ~ ３.０
ｃｍꎻ３ 级从接种伤口流出的菌脓变成褐色ꎬ病斑长
度 ３.１~５.０ ｃｍꎮ 根据公式:病情指数＝ １００×∑(各
级病枝数×各级代表值) / (调查总枝条数×最高级
代表值)计算病情指数ꎬ并用 ＤＰＳ ６.５５软件进行差
异显著性分析ꎮ
１.２.５　 激发 ＨＲ反应能力的检测　 将突变体、互补
菌株、野生菌株用 ＬＢ培养至对数生长期ꎬ分别取 １
ｍＬꎬ离心弃上清ꎬ用无菌水清洗细胞 ３ 遍ꎬ将各菌
株用无菌水稀释至 １０８ ＣＦＵ / ｍＬꎬ取 ５０ μＬ 注射到
ＮＣ８９烟草叶片中ꎬ２４ ｈ 后检查各个处理的 ＨＲ 反
应情况ꎮ 无菌水为阴性对照ꎮ
１.２.６　 生长速率、生物膜及游动性检测
　 　 (１)生长速率的检测　 将野生菌株、缺失突变
体和互补菌株接种于 ＬＢ 液体培养基中过夜培养
至稳定生长期ꎬ用新鲜 ＬＢ液体培养基将各菌株稀
释到 ＯＤ６００ ＝０.３ꎬ以体积比 １ ∶ １ ０００的比例将浓度
相同的各菌株接种于 ５０ ｍＬ的 ＬＢ液体培养基中ꎬ
３０℃、１５０ ｒ / ｍｉｎ 摇培ꎬ每隔 ３ ｈ 取一次样ꎬ每个菌
株 ３个重复ꎬ测定各菌株在 ６００ ｎｍ的吸光值ꎮ
　 　 (２)生物膜的检测[１７] 　 待测菌株接种于 ＬＢ
液体培养基中过夜培养至稳定生长期ꎬ以体积比
１ ∶ １００稀释到新鲜的 ＬＢ 液体培养基中ꎬ取 ２ ｍＬ
置于洁净的普通玻璃试管(１０ ｍＬ)ꎬ３０℃静置培养
４８ ｈꎬ将培养液缓慢倒掉ꎬ加入 ０.１％的结晶紫染色
３０ ｍｉｎꎬ用无菌水冲洗掉结晶紫的浮色ꎬ可观察到
试管壁上一圈紫色痕迹即是固液交界处形成的坚
固的生物膜ꎮ 加入 ２.５ ｍＬ ９５％的乙醇充分溶解与
生物膜结合的结晶紫ꎬ取 １ ０００ μＬ测量 ＯＤ５７０ꎮ
　 　 (３)游动性检测[１７] 　 将野生菌株、缺失突变体
和互补菌株接种于 ＬＢ 液体培养基中过夜培养至
稳定生长期ꎬ吸取 ３ μＬ滴于含有 ０.２％琼脂的半固
体 ＬＢ培养基上ꎬ无菌风吹干ꎬ３０℃静置培养 ２４ ｈꎬ
测量各菌株迁移直径ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 Ｔ３ＳＳ基因簇的分析
　 　 通过已获得的 Ｌ. ｑｕｅｒｃｉｎａ Ｎ￣５￣１ 全基因组序
列(约 ３.８ Ｍｂꎬ６１个 Ｃｏｎｔｉｇｓꎬ待发表)分析ꎬ绘制出
了 Ｌ. ｑｕｅｒｃｉｎａ Ｎ￣５￣１的 Ｔ３ＳＳ 基因簇物理图谱(图
１)ꎮ 菌株 Ｎ￣５￣１的 Ｔ３ＳＳ 基因簇共由 ２６ 个基因组
成ꎬ约 ２３ ｋｂꎬ存在于染色体上ꎬ其中 ｈｒｃＣ、ｈｒｃＪ、
ｈｒｃＱ、ｈｒｃＲ、ｈｒｃＳ、ｈｒｃＴ、ｈｒｃＵ、ｈｒｃＶ、ｈｒｃＮ 是高度保
守的 ｈｒｃ 基因ꎬ共同编码了 Ｔ３ＳＳ 的针状装置ꎮ 其
余 １７ 个基因包括具有调控功能的 ｈｒｐＳ、 ｈｒｐＹ、
ｈｒｐＸ、ｈｒｐＬ、ｈｒｐＶ基因ꎬ Ｔ３ＳＳ的外泌蛋白编码基因
ｈｒｐＴ、ｈｒｐＮ、ｈｒｐＧ、ｈｒｐＦ、ｈｒｐＥ、ｈｒｐＤ、ｈｒｐＢ、ｈｒｐＪ、ｈｒ￣
ｐＱ、ｈｒｐＯ、ｈｒｐＰꎬＨｒｐ￣ｐｉｌｉｎ编码基因 ｈｒｐＡꎮ
　 　 基因簇比较分析结果显示ꎬ在基因簇整体水平
上 Ｎ￣５￣１ 菌株的 Ｔ３ＳＳ 基因簇与 Ｄｉｃｋｅｙａ ｄａｄａｎｔｉｉ
３９３７和 Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ ＣＦＢＰ１４３０ 的高度相似
(图 １￣Ａ )ꎬ与 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｔｏｍａｔｏ
ＤＣ３０００ 相似性次之ꎬ与 Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ
ＧＭＩ１０００则差异较大[１８~２１](图 １￣Ｂ)ꎮ ５ 个菌株的
Ｔ３ＳＳ中共同存在高度保守的 ９ 个 ｈｒｃ 基因ꎬ并且
在菌株 Ｎ￣５￣１、３９３７和 ＣＦＢＰ１４３０中ꎬ这 ９个 ｈｒｃ基
因在基因簇中具有同样的位置和编码方向(图 １￣
Ａ)ꎮ 而菌株ＤＣ３０００、ＧＭＩ１０００与Ｎ￣５￣１相比ꎬ大多结
构基因的位置都发生了位移ꎬ在 ＧＭＩ１０００ 中只有
ｈｒｃＣ、ｈｒｃＶ、ｈｒｃＱ、ｈｒｃＲ和 ｈｒｃＳ ５个 ｈｒｃ基因在基因簇
中的位置与菌株 Ｎ￣５￣１中是一致的(图 １￣Ｂ)ꎮ
　 　 除了高度保守的结构基因ꎬ菌株 Ｎ￣５￣１ 的
Ｔ３ＳＳ基因簇中具有 １６ 个与菌株 ３９３７ 同源的 ｈｒｐ
基因ꎬ但菌株 Ｎ￣５￣１比菌株 ３９３７ 多了 ｈｒｐＢꎮ 菌株
ＣＦＢＰ１４３０除了具有与 Ｎ￣５￣１ 同源的 １７ 个 ｈｒｐ 基
因外ꎬ还有 ｈｒｐＫ、 ｈｒｐＷ 共 １９ 个 ｈｒｐ 基因ꎮ 菌株
ＤＣ３０００有 １９个 ｈｒｐ 基因ꎬ其中 １５ 个与 Ｎ￣５￣１ 菌
株的 ｈｒｐ同源ꎬ而 ｈｒｐＫ１、ｈｒｐＺ１、ｈｒｐＨ、ｈｒｐＲ是 Ｎ￣５￣
１菌株中不具有的基因ꎮ 菌株 Ｎ￣５￣１的 Ｔ３ＳＳ 具有
的 ｈｒｐ基因与 ＧＭＩ１０００的 ｈｒｐ基因差异较大ꎬ后者
只有 １２ 个 ｈｒｐ 基因ꎬ且其中只有 ８ 个与 Ｎ￣５￣１ 中
的 ｈｒｐ基因同源ꎮ 从 ｈｒｐ 基因的顺序和编码方向
来看ꎬ菌株 Ｎ￣５￣１、３９３７和 ＣＦＢＰ１４３０ ｈｒｐ 基因簇的
基因顺序和编码方向保持一致(图１￣Ａ) ꎮ与菌株
５１５
　
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. １　 Ｇｅｎｅｔｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ
ｉｎ Ｌｏｎｓｄａｌｅａ ｑｕｅｒｃｉｎａ Ｎ￣５￣１ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｈｒｃ / ｈｒｐ ｃｌｕｓｔｅｒ
ｏｆ Ｄｉｃｋｅｙａ ｄａｄａｎｔｉｉ ３９３７ꎬ Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ ＣＦＢＰ１４３０ꎬ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｔｏｍａｔｏ ＤＣ３０００ ａｎｄ Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ＧＭＩ１０００
Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ａｒｅ ｓｈｏｗｎ ｂｙ ａｒｒｏｗｓ. Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｍａｒｋｅｄ ｗｉｔｈ ｓａｍｅ ｃｏｌｏｒｓ ｏｒ ｓａｍｅ ｃｏｌｏｒｅｄ ｇｒｉｄｌｉｎｅｓ. Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅｓ
ａｒｅ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｌｏｒ ｓｈａｄｅｓ. Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｎａｍｅｓ ａｒｅ ｓｈｏｗｎ.
６１５
　
　 ５期 杨 莉ꎬ等:ＩＩＩ型分泌系统是欧美杨溃疡病菌 Ｌｏｎｓｄａｌｅａ ｑｕｅｒｃｉｎａ重要的致病因子
Ｎ￣５￣１相比ꎬ菌株 ＤＣ３０００ 的 ｈｒｐ 基因簇被分为两
部分ꎬ两部分基因簇在整体水平发生了位置交换
(图 １￣Ｂ)ꎮ 而菌株 Ｎ￣５￣１ 与菌株 ＧＭＩ１０００ 的 ｈｒｐ
基因簇相比ꎬ不管在基因的顺序或者基因的编码方
向上都有很大的差异(图 １￣Ｂ)ꎮ
　 　 在菌株 Ｄ. ｄａｄａｎｔｉｉ、Ｅ. ａｍｙｌｏｖｏｒａ 和 Ｐ. ｓｙｒｉｎ￣
ｇａｅ的 Ｔ３ＳＳ 中ꎬ涉及调控的基因有 ｈｒｐＸ、 ｈｒｐＹ、
ｈｒｐＳ、ｈｒｐＲ和 ｈｒｐＬꎬＨｒｐＬ有调控其他 Ｔ３ＳＳ 结构基
因以及效应子的作用ꎬ并且 ＨｒｐＬ 受 ＨｒｐＲ、ＨｒｐＳ、
ＨｒｐＸ、 ＨｒｐＹ 这 种 σ５４ 调 控[２２~２６]ꎮ 而 在
Ｒ􀆰 ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ中ꎬｈｒｐＧ、ｈｒｐＢ 编码的蛋白 ＨｒｐＧ、
ＨｒｐＢ才是 Ｔ３ＳＳ 的调控子[２７~２９]ꎮ 菌株 Ｎ￣５￣１ 中
ｈｒｐＬ 与 ３９３７、ＣＦＢＰ１４３０ 和 ＤＣ３０００ 菌株中 ｈｒｐＬ
基因的同源性分别是 ７３％、５７％和 ４９％ꎬ而 ｈｒｐＸ、
ｈｒｐＹ、ｈｒｐＳ与菌株 ３９３７ 中相应基因的同源性分别
为 ７３％、７８％和 ７６％ꎬ与 ＤＣ３０００ 和 ＧＭＩ１０００ 菌株
中 ｈｒｐＸ、ｈｒｐＹ、ｈｒｐＳ基因同源性稍有下降ꎮ 由此推
测ꎬ菌株 Ｎ￣５￣１的 Ｔ３ＳＳ中可能具有与菌株 ３９３７相
似的调控系统ꎮ
２.２　 Ｔ３ＳＳ缺失突变体及互补菌株的获得
　 　 通过 ＰＣＲ、酶切、连接构建的缺失载体 ｐＥＸ１８￣
ｈｒｃＶꎬ经三亲交配将质粒导入到野生菌株 Ｎ￣５￣１
中ꎬ质粒中 ｈｒｃＶ上下臂与野生菌株发生同源重组ꎬ
经过二次重组后ꎬ运用 ５％的蔗糖以及抗性筛选获
得了缺失突变体△ｈｒｃＶꎻ以引物 ＨｒｃＶ３７ / ＨｒｃＶ１４３１
进行 ＰＣＲ 扩增菌株 Ｎ￣５￣１ 和突变体的基因组
ＤＮＡꎬ电泳检查证明缺失突变体在 ｈｒｃＶ 基因阅读
框内缺失了约 ４００ ｂｐ的碱基(图 ２)ꎮ
２.３　 Ｔ３ＳＳ与致病性的关系
　 　 野生菌株 Ｎ￣５￣１、ｈｒｃＶ突变体和互补菌株分别接
种杨树枝条ꎬ４ ｄ后杨树枝条开始发病ꎬ可以看到接种
野生菌株和互补菌株的杨树枝条伤口流出大量乳白
色粘稠状脓液ꎬ伤口周围树皮软腐、凹陷ꎬ而接种 ｈｒｃＶ
突变体的杨树枝条并没有脓液流出ꎬ周围树皮组织也
没有明显的腐烂(图 ３￣Ａ)ꎮ 突变体△ｈｒｃＶ的病情指
数为 ３３.３ꎬ致病性比野生菌株 Ｎ￣５￣１和互补菌株 ＨＢ￣
ｈｒｃＶ明显下降ꎬ而野生菌株 Ｎ￣５￣１和互补菌株 ＨＢ￣
ｈｒｃＶ的致病性表现相似ꎬ病情指数分别为 ８３.３和 ８５.６
(图 ３￣Ｂ)ꎮ ｈｒｃＶ突变体的致病性与野生菌株和互补
菌株相比ꎬ达到极显著差异ꎮ
Ｆｉｇ. ２ 　 Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ＰＣＲ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｈｒｃＶ ｇｅｎｅ
ｉｎ ｓｔｒａｉｎ Ｎ￣５￣１ ( ｌａｎｅ ２ ) ａｎｄ ｉｔｓ
△ｈｒｃＶ ｍｕｔａｎｔ ( ｌａｎｅ ３)
Ｆｉｇ. ３ 　 Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙ ｏｎ ｐｏｐｌａｒ ｂｒａｎ￣
ｃｈｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ Ｎ￣５￣１ ａｎｄ ｉｔｓ
ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ΔｈｒｃＶ ａｎｄ ＨＢｈｒｃＶ
Ａ: Ｐｏｐｌａｒ ｂｒａｎｃｈｅｓ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ Ｎ￣５￣１ (ａ)ꎬ
ｉｔｓ ｈｒｃＶ￣ｄｅｌｅｔｅｄ ｍｕｔａｎｔ △ｈｒｃＶ (ｂ)ꎬ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｍｕｔａｎｔ ＨＢ￣
ｈｒｃＶ (ｃ) ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ＬＢ ｍｅｄｉｕｍ (ｄ). Ｂ: Ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎｄｅｘ ｏｆ
ｐｏｐｌａｒ ｂｒａｎｃｈｅｓ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｌ . ｑｕｅｒｃｉｎａ ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ Ｎ￣
５￣１ꎬ ｉｔｓ ｈｒｃＶ￣ｄｅｌｅｔｅｄ ｍｕｔａｎｔ △ｈｒｃＶꎬ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｍｕｔａｎｔ
ＨＢｈｒｃＶ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ (ＬＢ ｍｅｄｉｕｍ). Ａｌｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｐｅｒ￣
ｆｏｒｍｅｄ ｉｎ ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅꎬ ａｎｄ ｅｒｒｏｒ ｂａｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ.
Ａｓｔｅｒｉｓｋｓ (“∗∗”ꎬ Ｐ<０􀆰 ０１ꎻ “∗∗∗”ꎬ Ｐ<０.００１) ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｔａｔｉｓｔｉ￣
ｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ Ｎ￣５￣１ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｅ￣
ｒｉｖａｔｉｖｅｓ.
７１５
　
植物病理学报 ４４卷
２.４　 激发烟草 ＨＲ能力的检测
　 　 在同一 ＮＣ８９ 烟草叶片上接种 ｈｒｃＶ 突变体
△ｈｒｃＶ、互补菌株 ＨＢｈｒｃＶ、野生菌株 Ｎ￣５￣１和无菌水
阴性对照ꎬ对其引发 ＨＲ反应能力进行检测ꎮ 结果如
图 ４ꎬ突变体△ｈｒｃＶ基本丧失了在 ＮＣ８９烟草上引起
ＨＲ反应的能力ꎬ而互补菌株和野生菌株则均能在此
叶片上引起 ＨＲ反应ꎮ 这表明 Ｔ３ＳＳ直接影响 Ｎ￣５￣１
在 ＮＣ８９普通烟草上引起 ＨＲ反应的能力ꎮ
Ｆｉｇ. ４ 　 Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｎ ｔｏｂａｃｃｏ
ｌｅａｆ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｔｒａｉｎｓ Ｎ￣５￣１ꎬ ΔｈｒｃＶꎬ
ＨＢｈｒｃＶꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｗａｔｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌ
２.５　 生长速率、生物膜及游动性检测
　 　 通过对野生菌株、ｈｒｃＶ 缺失突变体和互补菌
株生长速率、生物膜及游动性的检测ꎬ未见这 ３ 个
菌株的生长速率、生物膜、游动性有明显的差异
(数据未显示)ꎮ
３　 讨论
　 　 由 Ｌｏｎｓｄａｌｅａ ｑｕｅｒｃｉｎａ引起的欧美杨溃疡病是
一种新型细菌性病害ꎬ该病害严重影响了我国北方
丰产速生杨树产业的发展ꎮ 本课题组首次在我国
分离出该病原细菌ꎬ而由该细菌引起的杨树溃疡病
也是首次在我国发现ꎮ
　 　 Ｌ. ｑｕｅｒｃｉｎａ 曾被称为 Ｂｒｅｎｎｅｒｉａ ｑｕｅｒｃｉｎａ 和
Ｅｒｗｉｎｉａ ｑｕｅｒｃｉｎａꎮ 在与其亲缘关系较近的 Ｂｒｅｎｎｅ￣
ｒｉａ属中ꎬＢ. ｓａｌｉｃｉｓ、Ｂ. ｒｕｂｒｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ. ｎｉｇｒｉｆｌｕｅｎｓ、Ｂ.
ａｌｎｉ和 Ｂ. ｐａｒａｄｉｓｉａｃａｌ均为林木病原菌ꎮ Ｂ. ｓａｌｉｃｉｓ
引起柳树树皮溃疡[３０]ꎬＭａｅｓ 等认为该细菌为柳树
内生细菌ꎬ具有固氮作用ꎬ因此可能引起柳树体内
氮素失调ꎬ从而造成柳树溃疡病的发生[３１]ꎮ Ｍａｅｓ
等通过放射自显影的方法ꎬ发现该细菌是通过柳树
叶片 的 接 触 进 行 传 播[３２]ꎮ Ｈｕｖｅｎｎｅ 等 发 现
Ｂ􀆰 ｓａｌｉｃｉｓ还具有群体感应(ｑｕｏｒｕｍ￣ｓｅｎｓｉｎｇꎬＱＳ)调
控特征ꎬ通过群体密度调控纤维素酶的表达ꎬ降解
柳树细胞壁ꎬ造成柳树溃疡病的发生[３３]ꎮ 胡桃树
皮溃疡病病原 Ｂ. ｒｕｂｒｉｆａｃｉｅｎｓ能产生一种水溶性的
红色色素ꎬ这种色素被认为与此细菌的毒性有
关[３０]ꎮ ＭｃＣｌｅａｎ等通过转座子 Ｔｎ５ 随机突变筛选
到色素变化且致病性下降的菌株 Ｂｒ￣２１２ 和 Ｂｒ￣
５１２ꎬ２个突变体均不能引起烟草 ＨＲ 反应ꎬ通过序
列比对发现 ２个突变体所突变的基因都与 Ｎ￣乙酰
高丝氨酸内酯(Ｎ￣ａｃｙｌｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｌａｃｔｏｎｅꎬＡＨＬ)群
体感应信号分子合成基因具有很高的同源性ꎬ且
Ｂ. ｓａｌｉｃｉｓ和 Ｂ. ｎｉｇｒｉｆｌｕｅｎｓ 产生的 ＱＳ 信号分子可
以使这 ２个突变体恢复色素产生能力ꎬ证明了该细
菌的致病性受 ＱＳ 系统调控且其产生的信号分子
可能与 Ｂ. ｓａｌｉｃｉｓ和 Ｂ. ｎｉｇｒｉｆｌｕｅｎｓ相同[３４]ꎮ 到目前
为止ꎬ欧美杨溃疡病菌 Ｌ. ｑｕｅｒｃｉｎａ 的传播途径以及
致病机制尚不清楚ꎬ本研究通过基因组分析比较ꎬ发
现 Ｎ￣５￣１中并不具有以 ＡＨＬ 为信号分子的 ＱＳ 系
统ꎬ这与柳树树皮溃疡病原 Ｂ. ｓａｌｉｃｉｓ、胡桃树皮溃疡
病原 Ｂ. ｒｕｂｒｉｆａｃｉｅｎｓ 不同ꎮ 早期分类学中ꎬ与 Ｌ.
ｑｕｅｒｃｉｎａ同属于 Ｅｒｗｉｎｉａ 属的 Ｄｉｃｋｅｙａ ｄａｄａｎｔｉｉ ３９３７
( ＝Ｅ. ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ ３９３７)的主要致病因子是通过Ⅱ
型分泌系统(ＴｙｐｅⅡｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍꎬＴ２ＳＳ)分泌的
果胶酶和嗜铁素[３５ꎬ３６]ꎮ 本研究通过基因组序列分
析发现ꎬ在 Ｎ￣５￣１中具有完整的 Ｔ２ＳＳ和 Ｔ３ＳＳꎬ但通
过 Ｔ２ＳＳ分泌的果胶酸裂解酶(ｐｅｃｔａｔｅ ｌｙａｓｅ)却只有
２种 ＰｅｌＡ和 ＰｅｌＤꎬ比 Ｄ. ｄａｄａｎｔｉｉ ３９３７ 中的果胶酸
裂解酶少了很多种ꎮ Ｔ３ＳＳ也是 Ｄ. ｄａｄａｎｔｉｉ ３９３７菌
株重要的致病因子之一[３７]ꎮ 本研究通过 Ｔ３ＳＳ基因
簇的比较分析ꎬ揭示了菌株 Ｎ￣５￣１与菌株 ３９３７具有
高度相似的 Ｔ３ＳＳ 结构ꎬ且通过遗传学方法证明了
Ｔ３ＳＳ与Ｎ￣５￣１致病性的关系ꎮ
　 　 遗传学试验显示菌株 Ｎ￣５￣１ ｈｒｃＶ 突变体在杨
树上的致病性显著下降ꎬ而互补菌株则与野生菌株
致病性基本保持一致ꎬ因此推测该细菌 Ｔ３ＳＳ 与致
病性有直接关系ꎬ是该细菌引起的杨树溃疡病的致
病因子之一ꎮ 当 Ｔ３ＳＳ 结构被破坏后ꎬＮ￣５￣１ 丧失
了诱导 ＨＲ反应的能力ꎬ但该菌株的生长速率、生
物膜和游动性并没有受到影响ꎮ 植物病原菌的致
病性可能涉及多个基因ꎬ本研究仅分析了病原细菌
８１５
　
　 ５期 杨 莉ꎬ等:ＩＩＩ型分泌系统是欧美杨溃疡病菌 Ｌｏｎｓｄａｌｅａ ｑｕｅｒｃｉｎａ重要的致病因子
Ｔ３ＳＳ结构基因与致病性的关系ꎬ要阐明欧美杨溃
疡病病原细菌的致病机制ꎬ还需对其他可能的致病
基因和因素开展研究ꎮ
参考文献
[１] 　 Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ Ｄ Ｃꎬ Ｓｃｈｒｏｔｈ Ｍ Ｎ. Ａ ｎｅｗ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ
Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｄｒｉｐｐｙ ｎｕｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｌｉｖｅ ｏａｋｓ
[Ｊ] . Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ １９６７ꎬ ５７: ２５０－２５３.
[２] 　 Ｓｏｒｉａ Ｓꎬ Ｌóｐｅｚ Ｍ Ｍꎬ Ｌóｐｅｚ Ｌóｐｅｚ Ｍ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ｐｒｅｓｅｎ￣
ｃｉａꎬ ｓｉｎｔｏｍａｔｏｌｏｇíａ ｙ ｄａñｏｓ ｄｅ Ｅｒｗｉｎｉａ ｑｕｅｒｃｉｎａ ｅｎ
Ｅｓｐａñａ ｙ ｓｕ ｐｏｓｉｂｌｅ ｒｅｌａｃｉｏｎ ｃｏｎ ｌａ ‘ｓｅｃａ ｄｅ ｌａ ｅｎｃｉｎａ’
[Ｊ] . Ｅｃｏｌｏｇíａꎬ １９９７ꎬ １１: ２９５－３０１.
[３] 　 Ｒｅｎ Ｆ Ｊ. Ｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｐｕｌｕｓ×ｅｕｒａｍｅｒｉ￣
ｃａｎａ ｃａｎｋｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [Ｄ] . Ｂｅｉｊｉｎｇ: Ｂｅｉ￣
ｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ (北京:北京林业大学)ꎬ
２０１１.
[４] 　 Ｈａｕｂｅｎ Ｌꎬ Ｍｏｏｒｅ Ｒ Ｂꎬ Ｖａｕｔｅｒｉｎ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅ￣
ｔｉｃ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ￣
ａｃｅａｅ [ Ｊ] . Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ １９９８ꎬ ２１: ３８４－３９７.
[５] 　 Ｂｒａｄｙ Ｃ Ｌꎬ Ｃｌｅｅｎｗｅｒｃｋ Ｉꎬ Ｄｅｎｍａｎ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ. Ｐｒｏｐｏｓａｌ
ｔｏ ｒｅｃｌａｓｓｉｆｙ Ｂｒｅｎｎｅｒｉａ ｑｕｅｒｃｉｎａ ( Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ ａｎｄ
Ｓｃｈｒｏｔｈ １９６７) Ｈａｕｂｅｎ ｅｔ ａｌ. １９９９ ｉｎｔｏ ａ ｎｅｗ ｇｅｎｕｓꎬ
Ｌｏｎｓｄａｌｅａ ｇｅｎ. ｎｏｖ.ꎬ ａｓ Ｌｏｎｓｄａｌｅａ ｑｕｅｒｃｉｎａ ｃｏｍｂ.
ｎｏｖ.ꎬ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｌｏｎｓｄａｌｅａ ｑｕｅｒｃｉｎａ ｓｕｂｓｐ. ｑｕｅｒ￣
ｃｉｎａ ｃｏｍｂ. ｎｏｖ.ꎬ Ｌｏｎｓｄａｌｅａ ｑｕｅｒｃｉｎａ ｓｕｂｓｐ. ｉｂｅｒｉｃａ
ｓｕｂｓｐ. ｎｏｖ. ａｎｄ Ｌｏｎｓｄａｌｅａ ｑｕｅｒｃｉｎａ ｓｕｂｓｐ. ｂｒｉｔａｎｎｉｃａ
ｓｕｂｓｐ. ｎｏｖ.ꎬ ｅｍｅｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ
Ｂｒｅｎｎｅｒｉａꎬ ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｃｋｅｙａ ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈｉａｅ ａｓ
Ｄｉｃｋｅｙａ ｄａｄａｎｔｉｉ ｓｕｂｓｐ. ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈｉａｅ ｃｏｍｂ. ｎｏｖ.ꎬ
ａｎｄ ｅｍｅｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｃｋｅｙａ ｄａｄａｎｔｉｉ
[ Ｊ] . Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ￣
ａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２０１２ꎬ ６２: １５９２－１６０２.
[６] 　 Ｐｏｚａ￣Ｃａｒｒｉóｎ Ｃꎬ Ａｇｕｉｌａｒ Ｉꎬ Ｇａｌｌｅｇｏ Ｆ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ｂｒｅｎｎｅ￣
ｒｉａ ｑｕｅｒｃｉｎａ ａｎｄ Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐｐ. ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｓｐａｎｉｓｈ ｏａｋ
ｔｒｅｅｓ: ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ
ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ [Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２００８ꎬ ５７: ３０８－３１９.
[７] 　 Ｇａｌáｎ Ｊ Ｅꎬ Ｃｏｌｌｍｅｒ Ａ. Ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｍａｃｈｉｎｅｓ:
Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｅｖｉｃｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎｔｏ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌｓ
[Ｊ] . Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ １９９９ꎬ ２８４: １３２２－１３２８.
[８] 　 Ｈａｃｋｅｒ Ｊꎬ Ｂｌｕｍ￣Ｏｅｈｌｅｒ Ｇꎬ Ｍｕｈｌｄｏｒｆｅｒ Ｉꎬ ｅｔ ａｌ. Ｐａｔｈｏ￣
ｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｓｌａｎｄｓ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ: ｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎬ ｆｕｎｃｔｉｏｎ
ａｎｄ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ [Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉ￣
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ １９９７ꎬ ２３: １０８９－１０９７.
[９] 　 Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ Ａꎬ Ｂｅｅｒ Ｓꎬ Ｂｏｎａｓ Ｕꎬ ｅｔ ａｌ. Ｕｎｉｆｉｅｄ ｎｏ￣
ｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｂｒｏａｄｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｈｒｐ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｐｈｙｔｏ￣
ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ [ Ｊ ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ
１９９６ꎬ ２０: ６８１－６８３.
[１０] Ｇａｏ Ｄ Ｊꎬ Ｈａｎ Ｚ Ｈꎬ Ｗａｎｇ Ｍ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｐａＰ ｇｅｎｅ ｉｎ Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｃｉｔｒｕｌｌｉ ( ｉｎ
Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
(农业生物技术学报)ꎬ ２０１１ꎬ １９: ７４６－７５２.
[１１] Ｗａｎｇ Ｌꎬ Ｍａｋｉｎｏ Ｓꎬ Ｓｕｂｅｄｅｅ Ａꎬ ｅｔ ａｌ. Ｎｏｖｅｌ ｃａｎｄｉ￣
ｄａｔｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｒｉｃｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａ ａｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ
[Ｊ] . Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００７ꎬ
７３: ８０２３－８０２７.
[１２] Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊꎬ Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ Ｗ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ: ａ ｌａｂｏ￣
ｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ (３ｒｄ ｅｄ.) [Ｍ] . Ｎｅｗ Ｙｏｒｋꎬ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ: Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙꎬ ２００１.
[１３] Ｈａｎａｈａｎ Ｄ. Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍｉｄｓ [Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ
１９８３ꎬ １６６: ５５７－５８０.
[１４] Ｈｏａｎｇ Ｔ Ｔꎬ Ｋａｒｋｈｏｆｆ￣Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ Ｒ Ｒꎬ Ｋｕｔｃｈｍａ Ａ Ｊꎬ ｅｔ
ａｌ. Ａ ｂｒｏａｄ￣ｈｏｓｔ￣ｒａｎｇｅ Ｆｌｐ￣ＦＲＴ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ
ｓｉｔｅ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｌｙ￣ｌｏｃａｔｅｄ ＤＮＡ ｓｅ￣
ｑｕｅｎｃｅｓ: ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｍａｒｋｅｄ Ｐｓｅｕｄｏ￣
ｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｍｕｔａｎｔｓ [Ｊ]. Ｇｅｎｅꎬ １９９８ꎬ ２１２: ７７－８６.
[１５] Ｋｅｓｓｌｅｒ Ｂꎬ Ｌｏｒｅｎｚｏ Ｌꎬ Ｔｉｍｍｉｓ Ｋ Ｎ. Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ
ｉｎｔｅｇｒａｔｅ ｌａｃＺ ｆｕｓｉｏｎｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｏｆ ｇｒａｍ￣ｎｅｇ￣
ａｔｉｖｅ ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ: ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｍ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ
ＴＯＬ ｐｌａｓｍｉｄ ｓｔｕｄｉｅｄ ｗｉｔｈ ａｌｌ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ
ｍｏｎｏｃｏｐｙ [Ｊ]. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓꎬ １９９２ꎬ
２３３: ２９３－３０１.
[１６] Ｋｏｖａｃｈ Ｍ Ｅꎬ Ｅｌｚｅｒ Ｐ Ｈꎬ Ｈｉｌｌ Ｄ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ. Ｆｏｕｒ ｎｅｗ
ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｒｏａｄ￣ｈｏｓｔ￣ｒａｎｇｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ
ｐＢＢＲ１ＭＣＳꎬ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ｃａｓｓｅｔｔｅｓ [Ｊ] . Ｇｅｎｅꎬ １９９５ꎬ １６６: １７５－１７６.
[１７] Ｂａｈａｒ Ｏꎬ Ｇｏｆｆｅｒ Ｔꎬ Ｂｕｒｄｍａｎ Ｓ. Ｔｙｐｅ ＩＶ ｐｉｌｉ ａｒｅ
ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅꎬ ｔｗｉｔｃｈｉｎｇ ｍｏｔｉｌｉｔｙꎬ ａｎｄ ｂｉｏｆｉｌｍ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ ｓｕｂｓｐ. ｃｉｔｒｕｌｌｉ [Ｊ] . Ｍｏ￣
ｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ￣Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ ２００９ꎬ ２２: ９０９－９２０.
[１８] Ｂａｒｎｙ Ｍ Ａꎬ ＧｕＪｎｅｂｒｅｔｉｅｒｅ Ｍ Ｈꎬ Ｍａｒｃａｉｓ Ｂꎬ ｅｔ ａｌ.
Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｌａｒｇｅ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｅｒｗｉｎｉａ
９１５
　
植物病理学报 ４４卷
ａｍｙｌｏｖｏｒａ ＣＦＢＰ１４３０ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ [Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏ￣
ｂｉｏｌｏｇｙꎬ １９９０ꎬ ４: ７７７－７８６.
[１９] Ｂｏｕｃｈｅｒ Ｃ Ａꎬ Ｍａｒｔｉｎｅｔ Ａꎬ Ｂａｒｂｅｒｉｓ Ｐ Ａꎬ ｅｔ ａｌ. Ｖｉｒｕ￣
ｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ａｒｅ ｃａｒｒｉｅｄ ｂｙ ａ ｍｅｇａｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ
ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｏｔａｎａｃｅａｒｕｍ [ Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓꎬ １９８６ꎬ ２０５: ２７０－２７５.
[２０] Ｂａｕｅｒ Ｄ Ｗꎬ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ Ａ Ｊꎬ Ｂｅｅｒ Ｓ Ｖꎬ ｅｔ ａｌ. Ｅｒｗｉｎｉａ
ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ ｈｒｐ ｇｅｎｅｓꎬ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｓｏｆｔ
ｒｏｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ
ｒｅｓｐｏｎｓｅ [ Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ￣Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ
１９９４ꎬ ７:５７３－５８１.
[２１] Ｒｏｉｎｅ Ｅꎬ Ｗｅｉ Ｗꎬ Ｙｕａｎ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ｈｒｐ ｐｉｌｕｓ: ａｎ
ｈｒｐ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｐｐｅｎｄａｇｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｔｏｍａｔｏ ＤＣ３０００ [ Ｊ ] .
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ
ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａꎬ １９９７ꎬ ９４: ３４５９－３４６４.
[２２] Ｙａｎｇ Ｓ Ｈꎬ Ｐｅｎｇ Ｑꎬ Ｙａｎｇ Ｃ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ. Ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＨｒｐＬ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｃｒｏｔｒｏ￣
ｐｈｉｃ ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎ Ｄｉｃｋｅｙａ ｄａｄａｎｔｉｉ ３９３７ [ Ｊ] . Ｐｌｏｓ
Ｏｎｅꎬ ２０１０ꎬ １０: ３４７２－３４８２.
[２３] Ｗｅｉ Ｚ Ｍꎬ Ｂｅｅｒ Ｓ Ｖ. ｈｒｐＬ ａｃｔｉｖａｔｅｓ Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ
ｈｒｐ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓ ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ＥＣＦ
ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｓｉｇｍａ ｆａｃｔｏｒｓ [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ￣
ｇｙꎬ １９９５ꎬ １７７: ６２０１－６２１０.
[２４] Ｗｅｉ Ｚꎬ Ｋｉｍ Ｊ Ｆꎬ Ｂｅｅｒ Ｓ Ｖ. Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｒｐ ｇｅｎｅｓ
ａｎｄ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ ｂｙ
ＨｒｐＸ / ＨｒｐＹꎬ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｗｏ￣ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍꎬ ａｎｄ
ＨｒｐＳ [ Ｊ ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ￣Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ
２０００ꎬ １３: １２５１－１２６２.
[２５] Ｈｕｔｃｈｅｓｏｎ Ｓ Ｗꎬ Ｂｒｅｔｚ Ｊꎬ Ｓｕｓｓａｎ Ｔꎬ ｅｔ ａｌ. Ｅｎｈａｎｃｅｒ￣
ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＨｒｐＲ ａｎｄ ＨｒｐＳ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｔｏ ｒｅｇｕｌａｔｅ
ｈｒｐ￣ｅｎｃｏｄｅｄ Ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｙｒｉｎｇａｅ ｓｔｒａｉｎｓ [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙꎬ ２００１ꎬ
１８３: ５５８９－５５９８.
[２６] Ｆｏｕｔｓ Ｄ Ｅꎬ Ａｂｒａｍｏｖｉｔｃｈ Ｒ Ｂꎬ Ａｌｆａｎｏ Ｊ Ｒꎬ ｅｔ ａｌ.
Ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ
ｐｖ. ｔｏｍａｔｏ ＤＣ３０００ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＨｒｐＬ
ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｉｇｍａ ｆａｃｔｏｒ [ Ｊ ] . Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ
Ａｍｅｒｉｃａꎬ ２００２ꎬ ９９: ２２７５－２２８０.
[２７] Ｂｒｉｔｏ Ｂꎬ Ｍａｒｅｎｄａ Ｍꎬ Ｂａｒｂｅｒｉｓ Ｐꎬ ｅｔ ａｌ. ｐｒｈＪ
ａｎｄ ｈｒｐＧꎬ ｔｗｏ ｎｅｗ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｓｉｇｎａｌ￣
ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃａｓｃａｄｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ＰｒｈＡ ｉｎ
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ [Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ
１９９９ꎬ ３１: ２３７－２５１.
[２８] Ｃｕｎｎａｃ Ｓꎬ Ｂｏｕｃｈｅｒ Ｃꎬ Ｇｅｎｉｎ Ｓ. Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ ｃｉｓ￣ａｃｔｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ＨｒｐＢ￣ｍｅ￣
ｄｉａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ
ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙꎬ ２００４ꎬ １８６: ２３０９－２３１８.
[２９] Ｇｅｎｉｎ Ｓꎬ Ｇｏｕｇｈ Ｃ Ｌꎬ Ｚｉｓｃｈｅｋ Ｃꎬ ｅｔ ａｌ. Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ
ｔｈｅ ｈｒｐＢ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅ￣
ｎｉｃｉｔｙ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ [ Ｊ ] .
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ １９９２ꎬ ６: ３０６５－３０７６.
[３０] Ｗｏｎｇ Ｗ Ｃꎬ Ｐｒｅｅｃｅ Ｔ Ｆ. Ｅｒｗｉｎａ ｓａｌｉｃｉｓ ｉｎ ｃｒｉｃｋｅｔ ｂａｔ
ｗｉｌｌｏｗｓ: ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｏｏｄ
[Ｊ]. Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ １９７８ꎬ １２: ３２１－３３２.
[３１] Ｍａｅｓ Ｍꎬ Ｂａｅｙｅｎ Ｓꎬ Ｄｅ Ｃｒｏｏ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ. Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ
ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ Ｂｒｅｎｎｅｒｉａ ｓａｌｉｃｉｓ ｉｎ ｗｉｌｌｏｗ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｉｏｎ
ｔｏ ｗａｔｅｒｍａｒｋ ｄｉｓｅａｓｅ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ
２００２ (Ｓｐｅｃｉａｌ Ｉｓｓｕｅ ２)ꎬ ５２８－５３０.
[３２] Ｍａｅｓ Ｍꎬ Ｈｕｖｅｎｎｅ Ｈꎬ Ｍｅｓｓｅｎｓ Ｅꎬ ｅｔ ａｌ. Ｂｒｅｎｎｅｒｉａ
ｓａｌｉｃｉｓꎬ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｕｓｉｎｇ ｗａｔｅｒｍａｒｋ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ
ｗｉｌｌｏｗꎬ ｒｅｓｉｄｅｓ ａｓ ａｎ ｅｎｄｏｐｈｙｔｅ ｉｎ ｗｏｏｄ [Ｊ] . Ｅｎｖｉｒｏｎ￣
ｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００９ꎬ １１: １４５３－１４６２.
[３３] Ｈｕｖｅｎｎｅ Ｈꎬ Ｍｅｓｓｅｎｓ Ｅꎬ Ｍａｅｓ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. Ｗｉｌｌｏｗ ｗｏｏｄ
ｓａｐ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｈｅ ｄｅｎｓｉｔｙ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ
Ｂｒｅｎｎｅｒｉａ ｓａｌｉｃｉｓ [ Ｊ] . Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ
２００９ꎬ １１: １４６３－１４７２.
[３４] ＭｃＣｌｅａｎ Ａ Ｅꎬ Ｄａｎｉｅｌ Ａ Ｋ. Ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｏｃｉ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｒｕ￣
ｂｒｉｆａｃｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｗａｌｎｕｔ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｂｒｅｎｎｅｒｉａ
ｒｕｂｒｉｆａｃｉｅｎｓ [Ｊ] . Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ꎬ ２００９ꎬ ９９: １４５－１５１.
[３５] Ｆｒａｎｚａ Ｔꎬ Ｓａｕｖａｇｅ Ｃꎬ Ｅｘｐｅｒｔ Ｄ. Ｉｒｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｙｓａｎｔｈｅｍｉ ３９３７: Ｒｏｌｅ ｏｆ
ｔｈｅ Ｆｕｒ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ [Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ￣Ｍｉｃｒｏｂｅ
Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ １９９９ꎬ １２: １１９－１２８.
[３６] Ｒｏｂｅｒｔ￣Ｂａｕｄｏｕｙ Ｊꎬ Ｎａｓｓｅｒ Ｗꎬ Ｃｏｎｄｅｍｉｎｅ Ｇꎬ ｅｔ ａｌ.
Ｐｅｃｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｙｓａｎｔｈｅｍｉꎬ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｒｏｌｅ ｉｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ [ Ｊ ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ￣Ｍｉｃｒｏｂｅ
Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ ２０００ꎬ ５: ２２１－２６８.
[３７] Ｙａｎｇ Ｃ Ｈꎬ Ｇａｖｉｌａｎｅｓ￣Ｒｕｉｚ Ｍꎬ Ｏｋｉｎａｋａ Ｙꎬ ｅｔ ａｌ. ｈｒｐ
Ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ ３９３７ ａｒｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ
ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ [Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ￣Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃ￣
ｔｉｏｎｓꎬ ２００２ꎬ ５: ４７２－４８０.
责任编辑:于金枝
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