全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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基金项目$国家星火计划"
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#&广东省自然科学基金"
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#&广东省科技计划"
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#&湛
江市科技攻关"
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#&湛江师范学院人才引进专项"
67#%"!
#
作者简介$欧阳乐军"
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#!男!博士!助理研究员!主要从事林木组织培养与生物技术研究
8)9:-;
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通信作者$曾富华!教授!主要从事植物分子生物学研究
尾巨桉胚状体诱导及愈伤组织差异研究
欧阳乐军!沙月娥!黄真池!曾富华"
"湛江师范学院!广东湛江
!$"$3
#
摘
!
要$以尾巨桉优良无性系无菌苗茎段为外植体!通过对多种不同浓度生长调节剂组合的优化!进行胚状体诱导
研究&并对胚性与非胚性愈伤组织进行形态解剖学观察(相关生理指标检测以及相关基因荧光定量
E5F
分析!以
揭示尾巨桉胚性愈伤组织非胚性化发生的机理!为建立尾巨桉体细胞胚胎再生体系提供参考结果表明$"
#
#胚性
愈伤组织在
G4H"*#9
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%
7I22H"*"#9
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%
7JK6
培养基中诱导得到胚状体!外植体经过
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%
7
蔗糖处理
#!A
有助于胚性愈伤组织产生胚状体!胚状体最高发生率为
#+*&L
"
!
#尾巨桉胚性与非胚性愈伤组织石蜡切片
观察发现!两者的细胞形态特征存在明显的差异!胚性愈伤组织细胞体积小!排列紧密!表现出典型的胚性细胞特
征!而非胚性细胞比较大!排列疏松!细胞呈不规则形状"
%
#生理生化指标检测结果表明!非胚性愈伤组织中蛋白
质含量(
4MK
(
EEM
及
52J
活性均显著低于胚性愈伤组织!非胚性愈伤组织中木质素(可溶性糖含量以及
E27
和
EMK
活性要高于胚性愈伤组织!二者的反肉桂酸
$)
单加氧酶基因(淀粉磷酸化酶基因(谷胱甘肽硫转移酶基因(葡
萄糖
)#)
磷酸腺苷酸转移酶基因(葡萄糖六磷酸异构酶基因(分支酸合酶基因以及苯丙氨酸解氨酶基因表达差异也
达到显著水平
关键词$尾巨桉&胚状体诱导&分化机理
中图分类号$
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N0$!*+
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N0$$*
文献标志码$
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34
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C/C.-.
&
D-YYCSC/U-:U-!!
尾巨桉是中国种植面积最大的桉树人工林树
种!其种苗培育一直通过组织培养扩繁的方式进
行*#+!但因不定芽分化困难!再生效率不高利用体
细胞胚再生途径进行种苗生产能增加扩繁效率!提
高种苗质量!降低种苗生产成本加之!尾巨桉胚性
细胞繁殖快!同步性好!具有很强的接受外源
KI2
的能力!是理想的外源基因转化感受态细胞*!+因
此!胚状体诱导在高效遗传转化体系的建立(离体种
子资源保存等许多方面都有广泛应用!社会(经济及
生态效益良好*%+非胚性愈伤组织"
/>
B:;=.
!
I85
#细胞壁木质素含量高!能形成物理屏障
作用阻碍农杆菌侵染!使其难以接受外源基因成功
转化*$+建立尾巨桉胚性愈伤组织"
C9WS
>
;=.
!
85
#高频发生体系是诱导尾巨桉胚状体发生的
前提!尽管桉树胚性愈伤组织及胚状体诱导比其他
组织培养途径的技术更复杂!诱导成功率低!但因胚
性细胞的特殊用途!仍成为桉树组织培养中具有发
展潜力的途径通过胚性愈伤组织和胚状体诱导成
苗并建立组培快繁的技术体系!进一步提高繁殖系
数!应是今后桉树苗木组培快繁的发展方向*+目
前!国外已有研究人员成功诱导获得桉树体细胞胚!
包括蓝桉(赤桉(柠檬桉(细叶桉等*+)0+!其中影响桉
树胚性愈伤组织的诱导和胚状体的发生影响因子有
基本培养基(激素和培养条件等但关于尾巨桉胚
状体诱导及分化机理的研究还未见报道
本实验室在前期研究工作中!通过多种植物生
长调节剂的组合运用!成功诱导得到尾巨桉胚性愈
伤组织*+本研究以尾巨桉胚性与非胚性愈伤组织
为材料!诱导获得尾巨桉胚状体!并通过对胚性与非
胚性愈伤组织在形态解剖学观察(生理生化指标检
测以及基因表达差异方面的研究!为揭示不同类型
愈伤组织形成与分化的机理以及建立尾巨桉胚状体
高频发生体系提供一定的借鉴与参考
#
!
材料和方法
<*<
!
材
!
料
供试材料为国家林业局桉树研究中心"湛江#提
供的尾巨桉"
!-"*+

,
&
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.
*$/01)
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#
KQ%!)!0
无菌苗!将粗壮幼苗嫩
茎切成长

"
399
不带芽点茎段作为外植体
<*=
!
实验方法
<*=*<
!
胚状体的诱导
!
将外植体用
"*9<;
%
7
灭
菌的蔗糖溶液于
$a
处理
#!
和
!$A
!在
G4H"*
9
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%
7I22H"*"#9
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%
7JK6H"9
?
%
7EbEH
%"
?
%
7
蔗糖
H&
?
%
7
琼脂的培养基中诱导!得到长
势较好的胚性愈伤组织!转移到胚状体诱导培养基
*
G4HL
椰子汁"
"*!!
#
9
滤膜过滤除菌#
H"
9
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%
7EbEH%"
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%
7
蔗糖
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%
7
琼脂
H
不同浓度
的
I22
"
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(
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(
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%
7
#和
JK6
"
"*"
9
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%
7
#组合+中!培养基在
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高压灭菌
!"9-/
!
培养条件为温度"
!c!
#
a
暗培养每
#$D
换
#
次
培养基!
!"D
后统计胚状体诱导情况数据利用
424
分析软件进行方差分析!百分率数据分析时经
过正弦平方根转换
胚状体发生率
d
"形成胚状体的愈伤组织块数%
接种愈伤组织总块数#
Z#""L
<*=*=
!
不同类型愈伤组织形态学差异分析
!
选取
诱导得到的胚性与非胚性愈伤组织!采用石蜡切片
法*#"+切成
#B9
% 方块作为材料!用番红
)
固绿法染
色染色后置显微镜下观察并拍照
<*=*>
!
不同类型愈伤组织木质素含量比较
!
称取
通过诱导得到的胚性与非胚性愈伤组织各
%*"
?
!用
研钵研碎!然后向研钵中倒入
%"97&!L
硫酸!参
照
e;:.等*##+紫外分光光度法测量木质素含量!
重复
%
次!
424
软件进行差异显著性分析
<*=*?
!
不同类型愈伤组织相关酶活性差异比较
!
称取
<*=*<
中诱导得到的胚性与非胚性愈伤组织各
+$%#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
"*$
?
于预冷的研钵中!加入
397
预冷的
"*"
9<;
%
7
磷酸缓冲液!磨成匀浆将匀浆转入
#"97
离心管!
#"""S
%
9-/
离心
#9-/
!取上清液定容至
#"97
!参照
F:
,
C.X:S-
等*#!+的方法测定提取液中
EMK
(
52J
(
4MK
和
EEM
的活性!可溶性蛋白含量
测定参照
2SS=D:
等*#%+的方法
<*=*@
!
不同类型愈伤组织可溶性蛋白质和可溶糖
含量的比较
!
分别称取
<*=*<
中诱导得到的胚性与
非胚性愈伤组织适量!按照张存旭*#$+的方法提取和
测定可溶性蛋白质和可溶性糖含量
<*=*A
!
不同愈伤组织相关基因表达差异分析
!
使
用
J:e:F:
公司的
FI2-.试剂盒分别提取
<*=*<
中诱导得到的尾巨桉胚性与非胚性愈伤组织
总
FI2
!按
JMPM_MFCTCSJS:2BC
^
E5FFJe-U
使用方法进行
BKI2
第一链的合成!荧光定量
E5F
采用
4P_F1SCC/
$
染料法!在
_VM)F2KFC:;)
J-9CE5F4
>
.UC9
上进行步骤与方法按照说明
书进行操作扩增得到的扩增曲线用于分析扩增效
率数据分析方法参照
EY:YY;
*
#
+
!用
M
[
U-BU进行数据统计分析
!
!
结果与分析
=*<
!
胚状体的诱导
胚状体诱导实验结果表明"表
#
#!不同质量浓
度的植物生长调节剂组合以及不同的处理方式对尾
巨桉胚状体的诱导率影响差异显著用
"*9<;
%
7
蔗糖溶液处理
#!A
的外植体!胚状体发生率最高
在
I22
浓度保持一致的情况下!随着
JK6
浓度升
高!胚状体发生率随之降低!说明低浓度的
JK6
相
对较适合尾巨桉胚状体的发生!当
JK6
浓度为
"*"#
9
?
%
7
!尾巨桉体胚诱导率最高可达到
#+*&L
"图版
$
!
2
"
R
#
=*=
!
不同类型愈伤组织形态学差异分析
常规的愈伤组织质量判断是通过肉眼观察判断
的!在组织形态学上!根据外观特征及其再生性(再
生方式等!愈伤组织分成胚性愈伤组织和非胚性愈
伤组织两大类经切片观察!尾巨桉淡红色胚性愈
伤组织细胞体积小!排列紧密!表现出典型的胚性细
胞特征"图版
$
!
1
(
Q
#&而非胚性细胞比较大!排列
疏松!细胞呈不规则形状"图版
$
!
V
(
f
#
=*>
!
尾巨桉胚性与非胚性愈伤组织木质素含量
比较
应用称重法测得两类愈伤组织木质素含量如图
#
所示!非胚性愈伤组织木质素含量平均为
#"*%L
!
远高于胚性愈伤组织木质素含量
#*+0L
!二者差异
达到极显著水平"图
#
#
=*?
!
尾巨桉胚性与非胚性愈伤组织的酶活性差异
比较
从图
!
可见!尾巨桉胚性愈伤组织中的
4MK
和
52J
以及
EEM
活性都要显著高于非胚性愈伤组
表
<
!
激素配比及蔗糖处理对胚状体诱导的影响
J:W;C#
!
8YYCBU.?
S?
=;:U>
<
?
C/C.-.
蔗糖处理时间
J-9CUSC:U9C/U
%
A
激素组合
1S?
=;:U%"
9
?
%
7
#
I22 JK6
接种愈伤数
I<*产生胚状体的愈伤数
I<*C9WS
>
<
?
C/C.-.
B:;=.
胚状体发生率
F:UC..<9:U-B
C9WS
>
<
?
C/C.-.
%
L
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"*" %% " "*"c"*"D
"*# %% " "*"c"*"D
"* %3 " "*"c"*"D
!!
注$不同小写字母表示处理间在
"*"
水平存在显著性差异"单因素方差分析!
74K
法多重比较#
I$
JACD-YYCSC/U/?
/-Y-B:/UD-YYCSC/BC:9?
USC:U9C/U.:U"*";CTC;
"
>
2IMb2X-UA74KUC.U
#
*
&$%#
&
期
!!!!!!!!!!!!!
欧阳乐军!等$尾巨桉胚状体诱导及愈伤组织差异研究
织!而
E27
和
EMK
活性均显著低于非胚愈伤组织
这说明与木质素合成相关的酶!如
E27
和
EMK
在
非胚性愈伤组织中升高!非胚性愈伤组织中木质素
含量高于高于胚性愈伤组织!这与前述测得的两类
愈伤中木质素含量差异结果是一致的
=*@
!
尾巨桉胚性与非胚性愈伤组织可溶性糖及蛋
白质含量的比较
测得两类愈伤组织蛋白质含量差异达到极显著
水平!非胚性愈伤组织蛋白质含量为
!*!09
?
%
?
!远
低于胚性愈伤组织的
*$%9
?
%
?
"图
%
#胚性愈伤
组织可溶性糖含量为
#*#0L
!低于非胚性愈伤组织
的含量
!*$#L
""图
%
#!差异达到显著水平!说明非
胚性愈伤组织淀粉分解较快!可溶性糖含量较高
=*A
!
尾巨桉胚性与非胚性愈伤组织的相关基因表
达差异
以胚性与非胚性愈伤组织总
FI2
逆转录所得
BKI2
为模板进行荧光定量
E5F
反应!能得到分布
较为均匀(线性关系较好的曲线!且同一类型愈伤基
因的扩增表达曲线重复性较好在非胚性愈伤组织
中!基因转录水平提高了的相关基因有反肉桂酸
$)
单加氧酶基因(淀粉磷酸化酶基因(谷胱甘肽硫转移
图
#
!
不同类型愈伤组织木质素含量
85*
胚性愈伤组织&
I85*
非胚性愈伤组织&下同
R-
?
*#
!
2/:;
>
.-.?
/-/B85*89WS
>
&
I85*I>
<
?
C/-B
B:;-
&
JAC.:9C:.WC;图
!
!
不同类型愈伤组织相关酶活性分析
R-
?
*!
!
2/:;
>
.-.C/@
>
9C.YS<9D-YYCSC/UB:;-
酶基因(葡萄糖六磷酸异构酶基因(分支酸合酶基因
以及苯丙氨酸解氨酶基因!相对胚性愈伤组织!上述
基因表达量分别提高了
!*0+
(
#3*!0
(
3*%!
(
#!*!0
(
0*0#
和
+*$
倍只有葡萄糖
)#)
磷酸腺苷酸转移酶
在胚性愈伤组织中的转录水平比非胚性愈伤组织中
的表达量相对提高了
!*+&
倍"图
$
#
%
!
讨
!
论
本研究通过应用不同浓度的
JK6
与
I22
组
合!诱导尾巨桉胚性愈伤组织及体胚发生已有研
究发现!
JK6
具有很强的细胞分裂素活性!很多难
以再生的植物应用
JK6
获得胚状体和再生植
株*#++
J-W<]
*
#&
+在利用
+)_2
诱导了尾叶桉的器官
发生再生!而利用
JK6
不仅通过器官发生途径再
生!还实现了胚状体再生国外在桉树植株再生的
图
%
!
不同类型愈伤组织蛋白质和可溶性糖含量差异
R-
?
*%
!
2/:;
>
.-.[
S:/D.<;=W;C.=
?
:SYS<9D-YYCSC/UB:;-
图
$
!
愈伤组织相关基因表达分析
#*
反肉桂酸
$)
单加氧酶基因&
!*
淀粉磷酸化酶基因&
%*
谷胱甘肽硫
转移酶基因&
$*
葡萄糖
)#)
磷酸腺苷酸转移酶基因&
*
葡萄糖六磷酸
异构酶基因&
+*
分支酸合酶基因&
*
苯丙氨酸解氨酶基因
R-
?
*$
!
V/D=BCDC[
SC..-:/:;
>
.-.?
C/C.
#*JS:/.)B-//:9:UC$)9?
C/:.C
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!*4U:SBA
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A<.
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%*1;=U:UA-&
$*1;=B<.C)
#)
[
A<.
[
A:UC:DC/
>
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;US:/.YCS:.C
&
*1;=B<.C)+)
[
A<.
[
A:UC-.<9CS:.C
&
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&
*E27
3$%#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
研究报道中!应用
"*"#
"
"*9
?
%
7JK6
诱导尾叶
桉(尾巨桉和蓝桉的愈伤组织最适合!取得较好的结
果本研究结果显示
"*#9
?
%
7I22
和
"*"#9
?
%
7JK6
组合较适宜胚状体的诱导本研究还发现
外植体在
$a
下经过
"*9<;
%
7
蔗糖处理
#!A
!得
到的胚性愈伤组织活性较强!能提高胚状体发生率!
但胚状体诱导率还有待进一步提高
胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织在组织形态学
以及生理生化水平上都表现出一定的差异本研究
切片观察结果显示尾巨桉胚性愈伤组织细胞体积
小!排列紧密!表现出典型的胚性细胞特征&而非胚
性细胞比较大!排列疏松!细胞呈不规则形状!与前
人在桉树不同愈伤组织切片观察的结果基本一
致*#3+王兰等*#0+发现在水稻的合子胚发育过程中
纤维素含量有一个渐渐增加过程!而木质素含量是
减小的由于木质素在细胞壁中有支撑细胞强度的
作用!正因如此!非胚性愈伤结构致密!不易分散&而
胚性愈伤则结构松散!呈颗粒状!易破碎*!")!#+本研
究中!尾巨桉非胚性愈伤组织木质素含量远高于胚
性愈伤组织!是其含量的
+
倍左右!差异达到极显著
水平
植物胚性愈伤组织形成过程中!相关酶类的活
性变化也十分明显李桢等*!!+发现棉花非胚性愈
伤组织中参与木质素代谢的苯丙氨酸解氨酶含量要
低于胚性愈伤组织过氧化物酶是与木质素合成最
后过程中的另一种关建酶!随着杨树中的过氧化物
酶含量下降!木质素含量也随之大幅度下降*!%+黄
真池等*!$+发现具有高分化能力的尾叶桉浅绿色愈
伤组织的
EMK
(
4MK
(
52J
和
EEM
的活性都要高
于褐色和白色愈伤组织
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等*!+报道!香
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的
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活性明显高于不具分化能力的愈伤组织
EEM
与
4MK
和
52J
一样能够清除植物体内活性
氧!他们在胚性愈伤组织与体胚发生过程中有着明
显的变化!共同调节体胚发生的分化和发育本研
究中发现尾巨桉胚性愈伤组织中的
4MK
和
52J
以及
EEM
活性都要显著高于非胚性愈伤组织!而
E27
和
EMK
的活性则是非胚性愈伤组织中表现更
高说明胚性愈伤组织的生理代谢能力较强!清除
活性氧自由基的能力高!活力旺盛而
E27
和
EMK
都是木质素合成代谢中的关健酶!他们的含量
与木质素合成的量成正相关!因此!非胚性愈伤组织
中
E27
和
EMK
的活性高于胚性愈伤组织
关于植物体细胞胚胎发生的分子机理普遍认
为!体细胞转化为胚性细胞的分子基础是基因差别
表达的结果本研究中测定的反肉桂酸
$)
单加氧
酶基因!是木质素合成的关健酶荧光定量
E5F
的
结果表明!该基因在非胚性愈伤组织中转录水平有
较大提高淀粉磷酸化酶是淀粉磷酸化分解的关键
酶该基因的表达量提高说明在非胚性愈伤组织中
淀粉分解较快谷胱甘肽硫转移酶能偶联植物体内
代谢产生的有毒物质!减少其对机体的伤害谷胱
甘肽硫转移酶基因在非胚性愈伤组织中表达上调!
是愈伤组织对不利环境的一种应答葡萄糖六磷酸
异构酶是催化葡萄糖六磷酸和果糖六磷酸相互转化
的酶!该基因表达量增加!说明在非胚性愈伤组织中
糖代谢速度较快而本研究测定的葡萄糖
)#)
磷酸
腺苷酸转移酶是淀粉合成过程中的一个关键酶在
非胚性愈伤组织中!该基因转录水平下调!说明了在
非胚性细胞中淀粉合成降低!这与前面所述的淀粉
磷酸化酶基因在非胚性愈伤组织中表达上调是一
致的
分支酸合酶是合成苯丙氨酸的关键酶!而苯丙
氨酸解氨酶是催化苯丙氨酸或者酪氨酸转化成反式
肉桂酸!是苯基丙烷类物质合成的关键酶!上述两种
酶基因表达量在非胚性愈伤组织中提高!说明植物
次生代谢增强!木质素合成增加这与非胚性愈伤
组织中木质素含量高的结果是一致的上述基因的
荧光定量
E5F
结果表明!与苯基丙烷类物质生物合
成(蔗糖淀粉代谢等相关基因在胚性与非胚性愈伤
组织中表达差异较大基因表达水平的不同是形成
不同愈伤形态及内部生理生化差异的关键
尾巨桉胚性愈伤组织诱导与体胚发生受多种因
素影响!目前!桉树体细胞胚胎诱导还存在诱导率
低(同步化调控效果不理想等问题!且不同树种与不
同材料间差异也十分明显!对植物体细胞胚产生的
机制还尚未完全掌握!因此还须做进一步系统深入
的研究
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