全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$国家自然科学基金"
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作者简介$游韩莉"
#&&!(
#!女!在读本科生!林学专业
2)34.5
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+893
"
通信作者$王
!
君!博士!副教授!主要从事林木倍性育种与细胞遗传学研究
2)34.5
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;-
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杜仲花粉离体萌发特征及花粉管微丝骨架分布
游韩莉#!%!贾婷婷#!%!田
!
菊%!王
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君#!"!康向阳#!
"
#
北京林业大学 林木育种国家工程实验室%林木花卉遗传育种教育部重点实验室!北京
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&
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北京林业大学生物科学与技
术学院!北京
#"""6%
&
%
北京林业大学 林学院!北京
#"""6%
#
摘
!
要$以干燥的杜仲成熟花粉为材料!对杜仲花粉离体萌发的适宜液体培养基配方进行了筛选!并对花粉萌发特
征及花粉管微丝骨架分布规律进行了研究结果表明$"
#
#适宜杜仲花粉离体萌发的液体培养基组成为
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A
蔗糖
B%"3
;
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A
硼酸
B#"3
;
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AC4
"
DE
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#
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!于
!,F
条件下离体培养
#6G
的花粉萌发率可达
$,+!&HI%+*H

"
!
#在适宜液体培养条件下!杜仲花粉萌发率在培养
,G
内急剧增长!随后趋于平稳&而花粉管在培养
6G
内伸长较
快!之后有放缓趋势!至培养
$6G
时!花粉管长度可达
%,%+#$I%"+#
"
3
"
%
#杜仲花粉属于
!
胞花粉!花粉萌发
过程中!营养核和生殖核的移动存在一定的时序性!通常营养核先于生殖核进入到花粉管&杜仲花粉生殖核的有丝
分裂发生在花粉管中!离体培养
#!G
可逐渐观察到有丝分裂行为"
$
#花粉萌发过程!微丝骨架形成束状!与花粉
管伸长方向平行排布!与较为稀疏的网状微丝阵列组成连续系统!引导细胞核的运动
关键词$杜仲&离体&液体培养基&花粉萌发&微丝骨架
中图分类号$
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J!$
文献标志码$
K
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3#+)#45)#"/",-".*/654*+",23"&44-$3*4&-.)57.#89
LEMN405.
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杜仲"
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#属杜仲科
"
2<8933.48?4?
#杜仲属"
()&**!+
#!是中国特有
植物种!也是国家二级重点保护植物(#)其用途广
泛!经济价值显著!在城乡绿化*用材*医药*食品以
及制胶工业等方面具有巨大的开发潜力(!)$)围绕
杜仲的开发利用*遗传改良等已有较多研究其中!
杜红岩等()采用选择育种方法选育出杜仲药用良种
+华仲
#
号,!具有速生*杜仲皮产量高*雄花量大*适
应性强等特点
由于杜仲为单科单属单种存在!单纯依靠优树
选择*种内杂交等途径所能带来的遗传增益是有限
的!因此!高鹏等(,)*)曾尝试开展杜仲花粉染色体加
倍技术研究!试图通过多倍体育种途径突破杜仲遗
传改良瓶颈尽管通过秋水仙碱和高温等处理方式
获得了较高比例的杜仲
!0
花粉!甚至最高可达
*"+!H
!却并未通过授粉获得三倍体后代(*)其原
因尚不明确!据推测!可能是由于
!0
花粉参与受精
过程中存在萌发迟缓*萌发异常等问题!导致不能优
先于正常雄配子与卵细胞结合(6)目前!有关杜仲
花粉的萌发特征及
!0
花粉萌发迟缓的机制尚不清
楚!仅贾小明等(&)对杜仲正常花粉的贮藏条件和花
粉萌发固体培养基进行了初步筛选本研究对杜仲
正常花粉离体萌发的适宜液体培养基成分*萌发特
征!以及萌发过程微丝骨架的分布规律等进行了探
讨!以便为进一步开展不同倍性花粉萌发特征比较
及
!0
花粉萌发迟缓的细胞学机制研究奠定基础
#
!
材料和方法
>+>
!
材
!
料
花粉采集于北京林业大学校园内生长健壮的杜
仲"
()&**!+(,*&!-./E5.\+
#雄株!待其处于散粉
期时!采集刚开始散粉的雄花!置于室内自然干燥!
收集花粉!
(!"F
保存
>+?
!
方
!
法
>+?+>
!
花粉培养及各处理梯度
!
采用液体培养法!
称取
3
;
杜仲花粉置于
!3A
培养基中!
,F#""
W
%
3.0
振荡光照培养首先采用
A
#,
"
$

#正交试验
设计对蔗糖*硼酸和
C4
!B浓度进行了初步研究!各
处理培养基组成见表
#
!每处理重复
%
次基于正
交试验结果!固定
C4
!B浓度为
#"3
;
%
A
!进一步利
用双因素试验对蔗糖和硼酸浓度进行了筛选!蔗糖
浓度梯度为
!""
*
!"
和
%""
;
%
A
!硼酸浓度梯度为
!"
*
!
*
%"
和
%3
;
%
A
通过统计培养
#6G
的花粉
萌发率分析最适培养基组成
>+?+?
!
花粉萌发率统计
!
对不同培养条件的花粉
分别取样!每重复随机观察

个视野!统计花粉总数
不少于
%""
粒
花粉萌发率
a
"萌发花粉数%花粉粒总数#
b
#""H
>+?+@
!
花粉管长度测量
!
对不同培养时间的花粉
分别取样!经
$H
多聚甲醛固定后!随机选取已萌发
的花粉用显微测微尺测量花粉管长度!每样品随机
测量
"
个花粉管
>+?+A
!
微丝骨架及细胞核荧光定位
!
参照尚峰男
等(#")的方法!将不同萌发时间的杜仲花粉管进行微
丝骨架荧光定位具体操作$采用
$H
多聚甲醛"
"
3395
-
A
(#
Z.
^
?/
配制#固定
#G
!经相应缓冲液清
洗后!用
ZX]
配制的
#H PW.Q90U)#""
抽提
#G
!
ZX]
洗涤
%
次!每次
#3.0
!然后用
cG9@43.0?)
ZG459.@.0
染色
!G
!相应缓冲液洗涤后用含
_KZO
的甘油封片所有制片均采用
A?.84PC])]Z
型激
光共聚焦扫描显微镜进行观察和照相
>+?+B
!
统计分析
数据统计及方差分析采用
_Z]\*+"
软件!其
中百分率数据经反正弦平方根转换后进行方差分
析!多重比较采用
A]_
法&数据管理和图表绘制采
用
].
;
34Z59Q#!+"
软件
!
!
结果与分析
?+>
!
杜仲花粉离体萌发液体培养基筛选
采用
A
#,
"
$

#正交试验设计对杜仲花粉离体萌
发液体培养基中蔗糖*硼酸和
C4
!B浓度组合进行了
筛选"表
#
#由极差分析"
1
值#可以看出!蔗糖浓
度的
1
值最大!为
!$+6#
!表明蔗糖浓度是对杜仲花
粉离体萌发率最重要的液体培养基组分&而
C4
!B浓
度
1
值最小!仅为
#+%
!表明
C4
!B浓度对杜仲花粉
液体萌发率的影响最小通过极差分析各液体培养
基成分对杜仲花粉离体萌发率的影响顺序为$蔗糖
浓度
#
硼酸浓度
#
C4
!B浓度!并且初步分析出
!""
;
%
A
蔗糖
B!"3
;
%
A
硼酸
B#"3
;
%
AC4
"
DE
%
#
!
为
该正交试验所筛选出的最优组合
进一步通过方差分析"表
!
#表明!蔗糖浓度各
水平间存在极显著差异"
2
$
"+"#
#!其中蔗糖浓度
为
!""
;
%
A
时!杜仲花粉离体萌发率极显著高于其
,&$
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
表
>
!
杜仲花粉离体萌发液体培养基组成
C
>D
"
A
B
#正交设计及萌发率极差分析
P4=5?#
!
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试验号
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因素
Y48Q9W
蔗糖
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A
#
硼酸
N
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%
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#
硝酸钙
C4
"
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#
!
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3
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A
#
萌发率
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7
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%
H
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平均值
I
标准误
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"#
#
"#
#
"#
%+$6 %+"6 !+"! !+6,I"+$$
! #
"#
!
"
#"
#
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"
#"
#
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"#
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$+&# ,+6% *+* ,+$$I"+*&
$ #
"#
$
"
!"
#
$
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!"
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6+$, 6+* +#, *+$,I#+#
!
"
#""
#
#
"#
!
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#&+!& !#+&% #+&# #&+"$I#+*$
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"
#""
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#
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#6+#! !,+,* !,+6* !%+66I!+66
* !
"
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#
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"
!"
#
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6 !
"
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"
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!$+6 %"+#" #&+$6 !$+6#I%+"*
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"
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#
!!+!# !$+#& #6+6 !#+*I#+,
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!$+,$ !!+6 !"+6$ !!+*6I#+#"
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!$+ %"+#, !%+#& !+&*I!+#%
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#$ $
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#
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#, $
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!""
#
$
"
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%!+&, !&+"# %6+!* %%+$#I!+,6
3
# +*" #6+"* !#+%
3
! !!+&! !"+, !#+&*
3
% !+*" !#+*# !"+,!
3
$ %"+# !$+$& !"+*"
1 !$+6# ,+$! #+%
他各浓度水平&在无蔗糖的液体培养基中!杜仲花粉
也表现出一定程度的萌发能力!但是其萌发率极显
著低于含有蔗糖的培养基硼酸各浓度水平间也存
在极显著差异"
2
$
"+"#
#!其中硼酸浓度为
!"
3
;
%
A
时!杜仲花粉离体萌发率显著高于其他各浓度
水平&而
C4
!B浓度各水平间差异不显著"
2
#
"+"
#
由于通过正交试验筛选出的蔗糖最优浓度和硼酸最
优浓度均为设计中的最大浓度水平!因此!有必要进
一步对其浓度水平进行筛选
进一步对蔗糖和硼酸进行双因素试验发现"表
%
#!蔗糖浓度的
%
个不同处理间差异达极显著水平
"
2
$
"+"#
#!当蔗糖浓度超过
!""
;
%
A
后!花粉萌发
率呈显著下降趋势!
""
;
%
A
蔗糖浓度的花粉萌发
率极显著高于其他浓度水平!表明
!""
;
%
A
为杜仲
花粉离体萌发液体培养基的最佳蔗糖浓度硼酸的
$
个不同浓度水平间差异极显著"
2
$
"+"#
#!硼酸浓
度为
%"3
;
%
A
时!杜仲花粉离体萌发率显著高于其
他浓度水平!而浓度为
!"3
;
%
A
和
!3
;
%
A
之间差
异不显著!表明
%"3
;
%
A
为杜仲花粉离体萌发液体
培养基的最佳硼酸浓度
表
?
!
各因素不同水平对萌发率影响
差异显著性及多重比较
P4=5?!
!
[<5Q.
^
5?893
^
4W./909>
^
95?0
;
?W3.04Q.90
W4Q?:.QG@.>>?W?0Q>48Q9W/.0QG?9WQG9
;
9045@?/.
;
0
因素水平
Y48Q9W/5?\?5
萌发率
YW?
7
V
9>
;
?W3.04Q.90
%
H
蔗糖浓度
C908?0QW4Q.909>/<8W9/?
%"
;
%
A
#
!"" %"+#4K
#" !+*"=X
#"" !!+&!8X
" +*"@C
硼酸浓度
C908?0QW4Q.909>N
%
XE
%
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3
;
%
A
#
!" !$+$&4K
# !#+*#=KX
#" !"+,=XC
" #6+"*8C
硝酸钙浓度
C908?0QW4Q.909>C4
"
DE
%
#
!
%"
3
;
%
A
#
#" !#+&*4K
" !#+%4K
!" !"+*"4K
# !"+,!4K
!!
注$不同小写字母表示差异显著"
&
a"+"
#!不同大写字母表示差异极显
著"
&
a"+"#
#下同
D9Q?
$
_.>>?W?0Q/3455?QQ?W/W?
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W?/?0Q/Q4Q./Q.845
V
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0.>.840Q@.>>?W?08?/
4Q
&
a"+"
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@.>>?W?0Q84
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G5
V
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a"+"#+PG?/43?4/=?59:+
*&$
%
期
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游韩莉!等$杜仲花粉离体萌发特征及花粉管微丝骨架分布
!!
综上所述!杜仲花粉离体萌发液体培养基的最
佳组成为
!""
;
%
A
蔗糖
B%"3
;
%
A
硼酸
B#"3
;
%
A
C4
"
DE
%
#
!
用该培养基于
!,F
条件下对杜仲花粉
离体培养
#6G
的花粉萌发率可达
$,+!&HI%+*H

?+?
!
杜仲离体萌发花粉管生长规律
在最适液体培养条件下!培养
!G
即可观察到
杜仲花粉萌发随着培养时间的延长!萌发率逐渐
升高"图
#
!
K
#在培养
!

,G
之间!萌发率从
#*+"HI"+6!H
急剧增长至
%*+&%HI#+$*H
!而
在培养
,

$6G
之间!萌发率的增长趋于平稳!仅由
%*+&%HI#+$*H
增长至
$6+&HI!+#6H
!表明离
体培养条件下!杜仲花粉的大量萌发主要集中于培
养
,G
以内培养
%!

$6G
之间!花粉萌发率差异
不显著!表明此时具备萌发能力的花粉均已完成
萌发
对不同培养时间花粉管长度进行测量!发现杜
仲花粉管平均长度随着培养时间的延长总体呈现增
加趋势"图
#
!
X
#在培养
!

6G
之间!花粉管生长
速度较快!平均生长速度为
!!+$,
"
3
-
G
(#
&随后花
表
@
!
蔗糖和硼酸双因素试验花粉
萌发率结果及多重比较
P4=5?%
!
c?/<5Q/40@3<5Q.
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5?893
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95?0
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因素水平
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萌发率
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7
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蔗糖浓度
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硼酸浓度
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粉管的生长速度趋于稳定!平均在
$+&
"
3
-
G
(#
!
至培养
$6G
时!花粉管长度达
%,%+#$I%"+#
"
3

?+@
!
杜仲花粉细胞核行为及花粉管内微丝骨架的
分布
杜仲花粉属于
!
胞花粉!在成熟花粉中!生殖核
尚未发生有丝分裂"图
!
!
K
#离体萌发过程中!可
观察到营养核和生殖核陆续进入到花粉管内!通常
情况下营养核先于生殖核进入到花粉管中"图
!
!
X
#杜仲花粉离体萌发过程!营养核和生殖核的移
动存在一定时序性"表
$
#培养
!G
时!在
6+!"H
的
萌发花粉中可观察到营养核已进入花粉管!而
$+&!H
的生殖核也进入到花粉管内在培养
!

$
G
间!营养核和生殖核进入到花粉管中的比例剧增!
$G
时!已有
&$+"%H
的花粉管中可观察到营养核!
6+&,H
的花粉管中可观察到生殖核培养
#6G
后!
表
A
!
不同培养时间花粉细胞核的位置及
生殖核有丝分裂进程
P4=5?$
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Q.3?
培养时间
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Q.3?
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G
营养核进入
花粉管比例
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7
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H
生殖核进入
花粉管比例
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%
H
生殖核正在进行和
已完成有丝分裂比例
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图
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最适液体培养条件下杜仲花粉萌发特征
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花粉萌发率随培养时间的变化&
X+
花粉管长度随培养时间的变化
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杜仲花粉离体萌发过程细胞核行为及微丝排布
K+
杜仲水合
!
胞花粉&
X+
花粉萌发早期营养核进入花粉管内!而生殖核仍在花粉中&
C+
营养核与生殖核均进入到花粉管内&
_+
生殖核完成有丝分裂形成
!
个精细胞&
2+
网状微丝骨架分布于水合杜仲成熟花粉细胞质中&
Y+
花粉萌发初期微丝
骨架聚集成束&
S+
花粉内微丝束推动生殖核进入花粉管内&
N+
花粉管内微丝束与花粉管伸长方向平行!
与网状微丝阵列一起推动花粉核在管内移动
+dD
表示营养核位置!
SD
表示生殖核位置
Y.
;
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$+#!H
的生殖核停留在花粉粒内直至培养
$"G
!
所有萌发花粉中的生殖核才全部移入花粉管中"图
!
!
C
#
杜仲花粉生殖核的有丝分裂发生在花粉管中!
最终形成
!
个球形精核"图
!
!
_
#培养初期!尽管
大量生殖核进入到花粉管内!但是并未发生有丝分
裂直至培养
#!G
!才在
%+,!H
的花粉管内观察
&&$
%
期
!!!!!!!!!!!!!
游韩莉!等$杜仲花粉离体萌发特征及花粉管微丝骨架分布
到生殖核有丝分裂行为随着培养时间的增加!生
殖核进行或完成有丝分裂的比例逐渐增加!至培养
$"G
后趋于稳定!在
,H
左右
通过
cG9@43.0?)ZG459.@.0
荧光定位!观察到
在杜仲花粉离体培养过程中微丝骨架排列与花粉核
的移动存在一定关系在尚未开始萌发的水合杜仲
花粉中!微丝骨架呈网状分布于细胞质内"图
!
!
2
#
随着花粉的萌发!微丝骨架逐渐聚集呈束状!推动营
养核和生殖核向花粉管内移动"图
!
!
Y
和
S
#在花
粉管伸长过程中!微丝束主要与花粉管伸长方向平
行排布!同时还存在一些微丝骨架较为稀疏*具网状
分布的阵列区域!而营养核和生殖核往往悬浮在这
些区域中"图
!
!
N
#!推测花粉管中核的移动可能是
由于微丝束与网状微丝阵列所组成的连续系统的运
动所致
%
!
讨
!
论
花粉离体萌发是花粉生命力测定的重要方法
贾小明等(&)曾对杜仲花粉离体萌发的固体培养基中
的琼脂和蔗糖最适浓度进行了研究!发现琼脂和蔗
糖浓度对干燥花粉萌发率影响均较大!以

;
%
A
琼
脂
B!""
;
%
A
蔗糖为最佳然而!该研究并未对花
粉离体萌发常添加的硼酸和
C4
!B进行探讨本研
究在与贾小明等(&)取得蔗糖最适浓度为
!""
;
%
A
的
同样结论基础上!更深入探讨了硼酸和
C4
!B浓度对
杜仲花粉离体萌发的影响!是对前人研究的补充和
丰富
在花粉萌发过程中!硼酸具有增加糖的吸收*转
运和代谢!帮助形成胞外
C4
!B梯度!促进花粉萌发
和花粉管生长等作用(##)!
C4
!B对花粉管极性生长及
生长方向具有重要的调控作用(#!)#%)本研究在培养
!G
即观察到
#*+"HI"+6!H
的花粉萌发!而贾小
明等(&)则在培养
,G
才观察到花粉萌发!且萌发率
最高仅为
+%H
由于本研究发现液体培养基中
C4
!B浓度对杜仲花粉离体萌发率影响不显著!因
此!推测硼酸的添加在促进杜仲花粉萌发方面起到
了关键作用但是!硼酸对花粉萌发影响与其浓度
关系显著!过高的硼酸浓度往往抑制花粉的萌
发(##!#$)本研究当硼酸浓度超过
%"3
;
%
A
时!花粉
萌发率出现了显著的下降!符合前人的研究规律
适用于花粉离体萌发的培养基类型!通常可分
为固体和液体
!
类其中!固定培养基被认为具有
透气性好*便于观察等优点!在植物花粉生活力测定
研究中普遍采用(#)#,)然而!由于固体培养基必须
使用琼脂作为支撑物!花粉在萌发过程中可能穿入
到琼脂中进行生长!在进行免疫荧光定位等细胞生
物学研究中!不利于荧光染料*抗体等试剂的渗入!
而且伸长的花粉管往往不在同一焦平面内!不利于
显微观察*摄像因此!在有关花粉管细胞骨架定位
等研究中!通常采用液体培养基作为花粉离体萌发
的介质(#"!#*)!")本研究明确了杜仲花粉离体萌发的
适宜液体培养基成分配比!为开展杜仲花粉管细胞
骨架定位等细胞生物学研究奠定了基础!并且已在
花粉管微丝骨架分布研究方面取得了较为理想的
结果
微丝骨架对花粉管的极性生长以及管内细胞质
和细胞器的运动均具有重要作用(#%!#)!$)
A.<
等(!)
研究发现!银杏"
4!"5
6
&7!,&7+
#花粉管萌发过程中
微丝网络紧密环绕细胞核排列!管核周围存在明显
的辐射状微丝!与管核载花粉管内的运动及转向等
有关挪威云杉"
2!).++7!./
#花粉萌发过程中!管
内存在平行于花粉管伸长方向的连续的网状微丝
束!这些微丝束阵列紧密包裹着造粉体和管核!使其
悬浮在花粉管中!并推动其向顶部移动(!,)!*)而在
毛白杨"
2&
8
(,(/$&*."$&/+
#
(
!"
)及本研究的杜仲等
被子植物花粉管中!微丝主要呈束状与花粉管伸长
方向平行!细胞核悬浮在管内!仅有少量网状微丝围
绕细胞核存在因此!微丝骨架对被子植物和裸子
植物花粉管内细胞核运动的控制方式可能存在一定
差异
在利用
!0
花粉杂交进行林木多倍体育种研究
过程中!人工诱导的
!0
花粉往往存在萌发迟缓*竞
争力差等问题!导致子代中多倍体得率低下!甚至不
能获得多倍体后代(6)然而!有关人工诱导
!0
花粉
在萌发过程中萌发迟缓*竞争力差的机制尚不清楚!
有必要引入细胞骨架定位*
C4
!B浓度梯度分布研究
等细胞生物学相关技术方法加以探讨本研究在明
确了适宜杜仲花粉离体萌发的液体培养基的基础
上!分析了正常花粉离体萌发特征和花粉管内细胞
核行为及微丝骨架分布规律!为进一步探讨上述机
制奠定了基础
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